Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering av naturlige drepeceller fra humane utvidede potensielle stamceller

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64608
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 2,3
1Major in Molecular Biology and Biotechnology, School of Biological Sciences, The University of Hong Kong, 2School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 3Centre for Translational Stem Cell Biology

Summary

Den nåværende protokollen viser hvordan man skiller CD3−/CD45+CD56+-celler med mild cytotoksisitet fra humane utvidede potensielle stamceller (hEPSC) under både 3D- og 2D-kulturforhold. Dette muliggjør rutinemessig fenotypisk validering uten ødeleggelse av det komplekse mikromiljøet.

Abstract

Differensieringen av naturlige dreperceller (NK) fra humane pluripotente stamceller muliggjør forskning på og fremstilling av kliniske cellulære produkter for immunterapi. Beskrevet her er en tofaseprotokoll som bruker et serumfritt kommersielt medium og en cocktail av cytokiner (interleukin [IL]-3, IL-7, IL-15, stamcellefaktor [SCF] og FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand [Ftl3L]) for å skille humane utvidede potensielle stamceller (hEPSC) til celler som har NK-celleegenskaper in vitro med både 3-dimensjonal (3D) og 2-dimensjonal (2D) kulturteknologi. Etter denne protokollen genereres CD3−CD56+ eller CD45+CD56+ NK-celler konsekvent. Når de er kokulturert med tumormål i 3 timer, viser de differensierte produktene mild cytotoksisitet sammenlignet med en IL-2-uavhengig permanent cellelinje, NK92mi-celler. Protokollen bevarer kompleksiteten til differensieringsmikromiljøet ved generering av 3D-strukturer, og letter dermed studiet av romlige forhold mellom immunceller og deres nisjer. I mellomtiden muliggjør 2D-kultursystemet rutinemessig fenotypisk validering av celledifferensiering uten å skade den delikate differensieringsnisjen.

Introduction

Sammenlignet med konvensjonelle pluripotente stamceller som humane embryonale stamceller (hESCs) og humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCs), er humane utvidede potensielle stamceller (hEPSC) nærmere totipotenstilstanden, da de kan differensiere i både ekstraembryonale og embryonale linjer1. For eksempel kan hEPSC differensieres til trofoblaster1 og eggeplomme-sac-lignende celler2. For å oppnå den unike styrken til hEPSC, dyrkes en individuell blastomer i et medium som inneholder flere små molekyler som hemmer avstamningsforpliktelsessignalering1, som refereres til som EPSC-medium (EPSCM). Dyrking av hESC og hiPSC i EPSCM utvider deres tidligere begrensede potens for å differensiere dem til trofoblastceller1.

Pluripotente stamceller er et verdifullt forskningsverktøy for å eksperimentere med nye genetiske modifikasjoner. På grunn av selvfornyelses- og differensieringskapasiteten til pluripotente stamceller, kan en transformert klon av en pluripotent stamcelle produsere differensierte cellulære produkter som har samme genetiske modifikasjon på samme sted. Zhu og Kaufman etablerte standarden for NK-celledifferensiering fra konvensjonelle pluripotente stamceller (hESC og hiPSCs)3. Først induserte de hematopoietiske stamceller (HSC) fra et embryoid legeme avledet fra pluripotente stamceller. Tilsetningen av stamcellefaktor (SCF), FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand (Ftl3L), interleukin (IL)-7, IL-15 og et tidlig tilskudd av IL-3 forstyrret HSCene til å utvikle seg til naturlige dreperceller (NK). Deretter utvidet de NK-cellene med kunstige antigenpresenterende celler (aAPCs), som presenterer membranbundet IL-21, med kontinuerlig tilskudd av IL-2. Forskere har brukt denne tilnærmingen til immunterapi for å generere iPSC-avledede naturlige drepeceller utstyrt med den kimære antigenreseptoren (CAR-iNK)4.

Humane NK-celler er definert som CD3-CD56+ leukocytter i perifert blod. De er effektorer mot virusinfiserte celler og tumorceller5. Noen hemmende reseptorer på NK-celler gjenkjenner molekyler uttrykt allestedsnærværende i normale celler. Som et eksempel gjenkjenner NKG2A / CD94-heterodimeren uttrykt på NK-celler MHC klasseI-molekyler 5. I mellomtiden gjenkjenner de aktiverende reseptorene på NK-celler stressinduserte ligander, som hvordan NKG2D gjenkjenner transformasjonsindusert MHC klasse I polypeptidrelatert sekvens A (MICA / MICB) 6. Noen transformerte celler nedregulerer sine "selvligander" for å unnslippe immunovervåking og oppregulere avvikende ligander, noe som utløser NK-cellene til å utføre sitt lytiske maskineri. Den iboende antitumorevnen til NK-celler har brakt oppmerksomhet til denne immuncelletypen.

Evnen til samtidig å gi opphav til både embryonale og ekstraembryonale linjer kan gjøre hEPSC til en mer trofast rekapitulering av den embryonale utviklingsnisjen enn konvensjonelle pluripotente stamceller. Av erfaring er det lettere å opprettholde styrken til hEPSC enn hiPSCs. I denne studien ble det utviklet en protokoll (figur 1) for å skjevhet hEPSCs for å utvikle seg til hematopoietiske linjer og senere differensiere stamceller til naturlige dreperceller (NK) in vitro. I protokollen brukes kommersielle medier for å unngå seruminkonsekvenser, etterfulgt av trinnvis tilsetning av cytokiner for å skjevgjøre differensiering i lymfoide linjer. Denne protokollen har to systemer for å bevare det komplekse 3D-mikromiljøet mens den utleder CD3-CD56+/CD45+CD56+-celler som fenotypisk og funksjonelt ligner humane NK-celler.

Denne protokollen kan være nyttig for å studere samspillet mellom immunceller med deres differensieringsnisjer og kan ha potensial til å rense cellulære produkter for immunterapeutisk bruk.

Protocol

Den foreliggende studien involverte in vitro-eksperimenter ; Derfor er etisk godkjenning ikke aktuelt. De etablerte cellelinjene som ble brukt i denne studien ble hentet fra kommersielle kilder (se materialfortegnelsen).

1. Generering av 3D-organoidstrukturer fra hEPSC

  1. Vedlikehold hEPSC ved å dyrke dem med 1 ml EPSC-medium (12-brønnsplate) på SNL-materceller1.
    MERK: Kuppelformede kolonier observeres (figur 2A) hvis deres utvidede styrke forblir.
  2. Utfør predifferensiering av hEPSC-ene.
    1. Fjern hEPSC-mediet, og tilsett 1 ml DFK-medium (DMEM/F12 + 10 % serumerstatningsmedium, se materialfortegnelsen). Inkuber i 2-3 dager ved 37 °C og 5% CO2. Utfør en middels forandring på den andre dagen hvis du fortsetter inkubasjonen i 3 dager.
      MERK: Under mikroskopet er de kuppelformede koloniene flatt (figur 2B).
  3. Kontroller dannelsen av embryoidlegemer ved hjelp av hengende dråpeteknikk 7,8.
    1. Fjern DFK-mediet, og vask med 1 ml PBS én gang. Tilsett 500 μL 0,05% trypsin, og inkuber platen ved 37 °C og 5% CO2 i 3-7 minutter basert på morfologien.
      MERK: hEPSC-ene må kunne løsnes fra matercellene når platen er litt forstyrret.
    2. Fjern trypsinet, og tilsett 2 ml DFK-medium for å høste cellene. Spinn ned cellene ved 300 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
    3. Fjern supernatanten med en pipette. Tilsett 1 ml DFK-medium og 1 μL Y27632 (se materialfortegnelsen) for å blande cellene på nytt ved å bla videre.
    4. Telle antall celler i cellesuspensjonen med et hemocytometer9. Fortynn cellesuspensjonen med DFK-medium og Y27632 (1000x) slik at det er 4000 celler/25 μl DFK-medium.
    5. Fyll lokket på en 10 cm petriskål med rundt 30-40 dråper 25 μL cellesuspensjon per hette. Hell litt PBS i den nedre parabolen for å forhindre fordampning av dråpene. Snu korken forsiktig og dekk fatet. Inkuber parabolen ved 37 °C og 5% CO2 i 3 dager.

2. Mesoderm og hematoendotelial mønster av embryoid kroppen (EB)

  1. Samle EBs i dråpen.
    1. Samle alle EB-ene fra dråpen i et 15 ml rør ved hjelp av en 1 ml pipette og litt PBS. Pump litt PBS inn i dråpen, og aspirer deretter ut mediet, inkludert EB-ene, med pipetten.
      MERK: Dråper som er mer gule indikerer mer vellykket dannelse og vekst enn rosa dråper.
    2. Spinn ned de oppsamlede EB-ene ved 100 x g i 1 min ved romtemperatur, og bruk en pipette til å fjerne supernatanten. Tilsett 1 ml medium A (fra et kommersielt tilgjengelig celledifferensieringssett, se materialfortegnelsen) for å overføre de innsamlede EB-ene til en 24-brønnsplate som ikke fester seg. Merk denne dagen som dag 0 (figur 1).
      MERK: Vanligvis blir alle EB-er samlet fra en 10 cm tallerken gruppert og overført til en brønn på en 24-brønnsplate.
  2. Utfør mesoderm mønster av EBs.
    1. Inkuber platen i 3 dager ved 37 °C med 5 % CO2. På dag 2 fjerner du 500 mikrol medium A (fra settet, trinn 2.1.2) samtidig som du unngår pipettering av EB-ene. Deretter tilsettes 500 μL ferskt medium A.
  3. Utfør hemato-endotelial spesifikasjon av embryoidlegemet.
    1. Fjern 700 μL medium A fra brønnen, og tilsett 700 μL medium B (fra settet, trinn 2.1.2). Kultur i 7 dager. Utfør et halvt bytte på medium B på dag 5, dag 7 og dag 9.

3. NK-celle differensiering

  1. Overfør mønstrede EB-er til en luft-væske-grensesnitt.
    1. Vipp platen litt slik at EB-ene samler seg på bunnen. Bruk en 1 ml pipette for å fjerne så mye av medium B som mulig, samtidig som du unngår EB-ene.
    2. Plukk opp EB-ene med en pipette ved å aspirere det gjenværende mediet. Overfør dem til en transwell i en 24-brønnsplate (se materialtabellen).
      MERK: Begrens tallene til to til tre EB per transwell for optimal tetthet.
  2. Utfør lymfoid stamutvidelse.
    1. Tilsett 500 μL NK-1 medium (kommersielt tilgjengelig lymfoid ekspansjonsmedium + 14 IE/ml IL-3, 4 500 IE/ml IL-15, 8 800 IE/ml IL-7, 26 IE/ml SCF og 12 IE/ml ftl3L, se materialfortegnelsen) til det nedre rommet i transbrønnen. Kultur i 14 dager, og utfør en middels endring annenhver dag.
  3. Høst og overfør cellene på dag 7-10 til en belagt tallerken.
    1. For å belegge platen, fortynn beleggmaterialet (kommersielt tilgjengelig lymfoid differensieringsbeleggmateriale, 100x, se materialfortegnelsen) i PBS. Tilsett 1 ml fortynnet beleggløsning til hver brønn i en 12-brønnsplate, og inkuber platen ved 4 °C over natten. Dekk åpningen på platen med innpakningsfilm.
    2. Tilsett 200 μL PBS i transbrønnen, og pipetter sakte opp og ned rundt fem til seks ganger for å høste cellene som frigjøres fra organoidene. Unngå å pipettere organoidene.
      MERK: Runde celler frigjøres kontinuerlig fra organoidene (figur 2D).
    3. Overfør den høstede cellesuspensjonen til et 2 ml rør, og spinn ned cellene ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatanten med en pipette, og tilsett 1 ml NK-1 medium (trinn 3.2.1) for å resuspendere cellene ved hjelp av pipettering.
    4. Fjern all beleggløsningen fra brønnen, og vask hver brønn på en 12-brønnsplate med 1 ml PBS to ganger.
    5. Del de innsamlede cellene i forholdet 1:2. Overfør cellesuspensjonen til en belagt 12-brønnsplate (trinn 3.3.1). Tilsett 1 ml NK-1 medium slik at hver brønn har 1,5 ml medium.
    6. For å utføre en middels forandring, la cellene sitte i 1-2 minutter for å la cellene synke til bunnen. Aspirer forsiktig ut 750 μL medium. Spinn ned den oppsamlede supernatanten ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    7. Kast det meste av supernatanten, og resuspender i 750 mikrol NK-1 medium med pipettering fem til seks ganger. Legg cellene resuspendert i det friske mediet inn i den opprinnelige brønnen.
      MERK: Dette parallelle systemet kalles 2D-systemet i figur 1. Følg middels endringsplanen for brønnen til organoidene cellene stammer fra.
  4. Utfør NK-cellemodning ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Fjern det gamle mediet i 3D-systemet, og tilsett 500 μL NK-2 (kommersielt tilgjengelig NK-celledifferensieringsmedium + 4 500 IE / ml IL-15, 8 800 IE / ml IL-7, 26 IE / ml SCF og 12 IE / ml ftl3L, se materialtabellen) i det nedre rommet i transbrønnen. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 14 dager.
      MERK: Forsikre deg om at mediet berører bunnen av transwellen.
    2. Utfør en full middels endring på cellene i 2D-systemet. Samle alle 1,5 ml celler fra en brønn, og sentrifuger den ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern mesteparten av supernatanten med en pipette, og resuspender pelleten med 1,5 ml NK-2 medium (trinn 3.4.1).
    3. Utfør en middels endring annenhver dag. Vipp platen på 3D-systemet litt, og fjern alt det gamle mediet utenfor transbrønnen. Tilsett 500 μL NK-2 medium utenfor transbrønnen.
    4. For å utføre en halv middels forandring på en brønn på en 12-brønnsplate for 2D-systemet, la cellene sitte i 1-2 minutter for å la cellene synke til bunnen. Aspirer forsiktig ut 750 μL av mediet.
    5. Spinn ned den oppsamlede supernatanten ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å forhindre celletap. Kast det meste av supernatanten, og resuspender i 750 mikrol NK-2 medium ved å pipetere fem til seks ganger. Tilsett cellene resuspendert i friskt medium i den opprinnelige brønnen.

4. Høsting av modne celler

  1. Høst cellene som dyrkes i 2D-systemet.
    1. Høst cellene ved å pipettere opp og ned i løpet av dagene 38-45. Vask med 1 ml PBS to ganger. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Fjern supernatanten med en pipette, og resuspender den i den valgte bufferen (dvs. PBS + 2% FBS for flowcytometri, se materialfortegnelsen).
  2. Høst cellene som er innebygd i organoiden.
    1. Samle mediet fra utsiden av transbrønnen inn i et 15 ml rør i løpet av dagene 38-45. Vask organoiden to ganger ved å tilsette 200 μL PBS inne i transbrønnen og pipettere opp og ned fem til seks ganger. Overfør suspensjonen til 15 ml røret.
    2. Tilsett 500 μL PBS i en brønn med en 12-brønnsplate. Overfør organoid fra transbrønnen til den brønnen på 12-brønnsplaten med tang.
    3. Klipp organoiden 20 ganger med en saks og tang. Skyll de resterende cellene på tangen og saksen ned i brønnen med PBS. Samle så mye PBS som mulig, og overfør det til 15 ml røret som brukes i trinn 4.2.1 uten å aspirere organoidstrukturen.
    4. Tilsett 500 μL av dissosiasjonsreagenset (se materialtabellen) i transbrønnen for å fordøye organoid enzymatisk. Inkuber med en kommersiell celledetachmentløsning (se materialfortegnelsen) i 7-10 minutter ved 37 °C og 5% CO2. Slukk reaksjonen ved å tilsette 1 ml PBS med 2% FBS, og samle løsningen i et annet 15 ml rør. Vask brønnen med 1 ml PBS med 2% FBS to ganger.
      MERK: Bestem lengden på inkubasjonen basert på morfologien. Prøv å oppnå det punktet hvor enkeltceller begynner å bli frigjort fra membranen til 3D-strukturen.
    5. Tilsett 1 ml PBS med 2% FBS, og pipett opp og ned 8-10 ganger. Samle alle løsningene, inkludert organoidstrukturer. Overfør dem til 15 ml røret som ble brukt i trinn 4.2.3 med en cellesil.
    6. Sentrifuger begge rørene ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten med en pipette. Resuspender cellepelleten med den valgte bufferen (trinn 4.1.2).

Representative Results

Det ble antatt at nåværende in vitro differensiering (IVD) produkter ville ha lignende overflatemarkører og antitumorevner til humane NK-celler.

Den definerende markøren for humane NK-celler ble åpnet for å teste om differensieringsproduktene fra 3D-kultursystemet ga celler som fenotypisk lignet humane NK-celler. Omtrent 15 % av cellene som ble dissosiert fra 3D-kultursystemet fra to batcher indusert ved forskjellige tidspunkter (n = 2) var CD3-CD56+ (figur 3A). CD3 ble erstattet med CD45 (en pan-leukocyttmarkør) i testpanelet på grunn av fravær av CD3 og vanskeligheter med å indusere T-celler in vitro. Omtrent 16% av cellene som ble dissosiert fra 3D-strukturen var CD45 + CD56 + (figur 3B, n = 1), som er i tråd med prosentandelen av CD3-CD56 + -celler sett i tidligere studier. Prosentandelen av CD3-CD56+-celler i cellene høstet fra 2D-kultursystemet varierte fra 30 % til 6 %, fra mer vellykkede induksjoner (figur 3C, n = 3) til mindre vellykkede induksjoner (figur 3D, n = 2). Funksjonaliteten og fenotypene til cellene høstet fra 2D-kultursystemet ble validert. I løpet av dag 18-kulturen fra 2D-systemet uttrykte ca. 12 % av cellene både ektopisk CD56 og CD107a etter 2 timer på 50 ng/ml IL-18, 455 IE/ml IL-2 og 20 ng/ml anti-CD244 antistoffstimulering (figur 4C, n = 1). Omtrent 28 % av de høstede cellene var CD94+CD159a+ (figur 4B, n = 1). Ektopisk ekspresjon av CD107a, en proteinforing på membranen av granulater, indikerer degranulering10, mens CD94 / NKG2A (CD159a) heterodimeren er en annen definerende markør for NK-celler. Dette gir et eksempel på fenotypisk og funksjonalitetsvalidering av IVD-produkter.

Funksjonaliteten til IVD-produktene ble testet av deres cytotoksisitet mot humane erytroleukemiceller-K562-celler. Omfattende ligandprofilering på K562-celler avslører deres nedregulerte store histokjemiske kompleks I (MHC-I) og relativt sterke NKG2D-liganduttrykk (som ULBP-1, ULBP-2/5/6 og ULBP-3)11; Dermed er K562-celler utsatt for den lytiske aktiviteten til NK-celler12. Både IVD-endepunktsprodukter og NK92mi-celler ble primet med 50 ng/ml IL-18, 455 IE/ml IL-2 og 20 ng/ml anti-CD244-antistoffer over natten. GFP + K562-cellene ble kokulturert med enten høstede celler fra IVD- eller NK92mi-celler ved forskjellige effektor-til-målforhold (E: T) i nærvær av 50 ng / ml (IE ikke gitt) IL-18, 455 IE / ml IL-2 og 20 ng / ml anti-CD244 antistoffer i samme volum av H5100 medium i 3 timer. Avlesningen av NK-celledrapsaktivitet var uttrykket av dødcellemarkøren på GFP+-undergrupper. K562-cellene ble transdusert med en kommersielt tilgjengelig kontrollvektor (se materialtabellen) for å uttrykke GFP konstitutivt, og effektiviteten av transduksjonen var ca. 80% (tilleggsfigur 1A). Prosentandelen av GFP-signal som ble lagt til var proporsjonal med antall GFP + K562-celler lagt til, noe som tyder på spesifikt GFP-uttrykk fra de transducerte K562-cellene (tilleggsfigur 1B).

Prosentandelen av døende målceller vist i figur 5 ble beregnet med følgende formel13:

Prosentandel av døende celler = (FITC + DAPI +% av kokultur [for eksempel figur 5A]) - (FITC + DAPI +% av transducerte K562-celler)

Av alle tre E:T-forholdene som ble vurdert (0,1:1, 0,33:1, 1:1), var prosentandelen av døende GFP+-celler positivt korrelert med E:T-forholdene når de ble dyrket sammen med IVD-produkter (figur 5B, hEPSC-NK) eller NK92mi-celler (figur 5B, NK92mi), noe som indikerer spesifikt drap av tumormål. Cytotoksisiteten til IVD-produktene var imidlertid relativt beskjeden innenfor den testede tidsrammen (figur 5C).

Til slutt ble den lymfoide stamcellegenerasjonen sammenlignet mellom 3D- og 2D-kulturer. Det ble funnet at 3D-kulturtilstanden genererte flere stamceller (55 000 celler) enn 2D-kulturtilstanden (36 000 celler) (tilleggsfigur 2). Dette antyder at konteksten av vevsarkitektur og cellulære komponenter i 3D-kulturen støttet genereringen av lymfoide stamceller.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk diagram som viser differensieringsstrategien for å skille NK-celler fra hEPSC . (A) Her vises tidslinjen til 3D-kultursystemene, som beskriver kulturforholdene og korte nøkkelord fra hvert trinn. Luft-væskegrensesnittet til 3D-systemet opprettholdes under NK-celleinduksjonen. (B) Her vises tidslinjen til 2D-kultursystemene. De frigjorte cellene høstet fra dag 7-10 fra strukturer i 3D-systemet blir sådd på en belagt plate uten luft-væske-grensesnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Morfologi av cellene observert på forskjellige stadier av differensiering. (A) Morfologien til hEPSC når den opprettholdes i EPSCM. HEPSC-ene danner kuppelformede kolonier. (B) Morfologien til hEPSC etter predifferensiering. De kuppelformede koloniene er flatt. HEPSC-ene høstes og danner EB-er med hengende dråpeteknikk. EB-ene samles og dyrkes i medium A og deretter medium B. (C) Morfologien til en EB på dag 10. I løpet av denne perioden begynner EB å ekspandere og blåses opp, og danner membranstrukturer. (D) Morfologien til en cellefrigjørende EB. Etter såing på transbrønnen vokser EB og frigjør hele tiden runde celler til omgivelsene. Noen av de frigjorte cellene samles og dyrkes på en 12-brønns plate belagt med lymfoide differensieringsbeleggmaterialer. Cellepopulasjonene er morfologisk heterogene og har en tendens til å aggregere sammen. (E) Morfologien til celler observert ved endepunktet av IVD. Små, sirkulære suspensjonsceller (svart pil) observeres. Skala barer: (A,B,E) = 100 μm; (C,D) = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative FACS-plott av hEPSC-avledede produkter ved endepunktet. Cellene inkuberes med fluoroskopkonjugerte antistoffer på is i 30 minutter. Prøvene er farget med DAPI før de lastes inn i FACS-prøveinjeksjonsporten. Ufargede celler brukes til å etablere den negative gating. (A) Representativt FACS-plott på CD3- og CD56-uttrykk i celler dissosiert fra 3D-kultursystemet fra to batcher (n = 2). (B) Representativt FACS-plott på CD45 og CD56-uttrykk i celler dissosiert fra 3D-kulturen (n = 1). (C) Representativt FACS-plott på CD3- og CD56-uttrykk i celler høstet fra den belagte platen fra en vellykket induksjon (n = 3). (D) Representativt FACS-plott på CD3 og CD56-uttrykk fra den belagte platen når induksjonen er suboptimal (n = 2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativt FACS-plott på hEPSC-deriverte produkter under kultur av dag 18 (n = 1). (A) FACS-plott på CD56- og CD107a-uttrykk etter 2 timers stimulering med IL2-, IL-18- og anti-CD244-antistoffer. (B) FACS-plott på CD159a og CD94-uttrykk. Prøvene farges medDAPI før de lastes inn i FACS-prøveinjeksjonsporten. Ufargede celler brukes til å etablere den negative gating. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Plott av prosentandelen av døende celler mot forskjellige E:T-forhold fra kokulturen til GFP+ K562-celler med enten IVD-endepunktsproduktet eller NK92mi-celler (n = 1). Ekspresjonen av FITC+ DAPI+-celler ble vurdert med en celleanalysator, og dataanalysen ble utført med kompatibel programvare. (A) Et representativt FACS-plott som viser gating av FITC + DAPI + undergrupper fra kokulturen av IVD-produkter og K562-celler med et E: T-forhold på 1. (B) Individuelle plott fra kokultureksperimentet med GFP+ IVD-produkter (venstre) eller NK92mi-celler (høyre) i 3 timer. Begge reflekterer et positivt proporsjonalt forhold mellom prosentandelen av døende celler og E:T-forholdet. (C) Et plott som viser drapskurvene til IVD-produkter og NK92mi-celler i samme skala. IVD-produktene viste mild cytotoksisitet sammenlignet med NK92mi-cellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Funksjonell analyse av NK-celler fra hEPSC. (A) FACS-histogram for transduserte K562-celler. FITC+ K562-cellene uttrykte GFP. (B) FACS-histogrammer fra kokulturen av GFP + K562-celler og endepunktet IVD-produkter ved tre E: T-forhold (n = 1). Prosentandelen av FITC+-celler i kokulturen korresponderte med antall tilsatte transduserte K562-celler. Gatingene ble etablert med utransducerte K562-celler. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Lymfoid stamfardifferensiering i 2D versus 3D-kultur. Den nåværende organoidbaserte protokollen ble brukt til å indusere lymfoide progenitorer fra humane utvidede potensielle stamceller. To betingelser ble satt opp: (1) lymfoide forfedre ble holdt i kultur innenfor organoidene (3D), og (2) lymfoide progenitorer ble isolert og holdt på dyrkningsskålen (2D). Etter 2 uker med ekstra kultur ble cellenumrene bestemt for å sammenligne 2D versus 3D-kultur. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Det er noen viktige trinn for å sikre vellykket differensiering av CD45 + CD56 + celler fra hEPSCs. Predifferensieringen (trinn 1.2) er avgjørende siden EPSC-mediet inneholder hemmere av avstamningsforpliktelse1. Etter predifferensiering blir de kuppelformede koloniene av hEPSC flattrykt (figur 2B). Tillegg av Y27632, en rhokinasehemmer (ROCKi), under dannelsen av EB fra hEPSC (trinn 1.3) er uunnværlig for overlevelse av hEPSC etter dissosiasjon. En annen viktig faktor er antall EB-er plantet på hver transbrønn. Siden det er et lite system, er to til tre EB per transwell den optimale tettheten for å forhindre overforbruk av mediet. Luft-væske-grensesnittet opprettholdes under hele løpet av NK-celledifferensiering for 3D-systemet, som antas å opprettholde polariteten til stromale celler og støtte utvidelsen av AGM-avledede hematopoietiske progenitorer14,15.

Som nevnt tidligere er tettheten av EB på transbrønnen en avgjørende faktor for vellykket differensiering. Nøkkeltegnet for dette er fargen på mediet 1 dag etter implantasjonen av EB på transbrønnen. Hvis fargen blir gul raskt, indikerer dette enten forurensning eller overbefolkning. For å løse problemet bør en 1 ml pipette brukes til å manuelt plukke opp ekstra EB og overføre dem til en annen transbrønn.

En stor begrensning i denne protokollen er renheten til CD3−/CD45+ CD56+-celler i IVD-produktene, som antas å være delvis ansvarlig for den dårligere cytotoksisiteten sammenlignet med rene NK92mi-celler. Et 3D-kultursystem ble brukt til å indusere hematopoietiske forfedre via genereringen av en EB som ligner de tre embryonale kimlagene. Denne strategien etterligner utviklingen av blodceller i benmargens mikromiljø, og fjerner dermed behovet for stromale celler for å støtte differensieringen3. Uten et sorteringstrinn for å rense hematopoietiske forfedre, forventes renheten av IVD-produktene å bli redusert. En strategi for å beholde den komplekse differensieringsnisjen og samtidig øke renheten til endepunktsproduktet, er å utvikle en ekspansjonsmetode for de sorterte CD3-CD56+ IVD-produktene. For eksempel kan de sorterte CD3-CD56+ IVD-produktene dyrkes på kunstige antigenpresenterende celler (aAPCs), slik som bestrålte K562-celler konstruert med membranbundet IL-21. Med tilførsel av IL-2 i kulturen, kan denne metoden oppnå en 1000 ganger økning i NK-celle nummer3.

En annen begrensning er den begrensede tilgangen til bona fide humane NK-celler som en positiv referanse. NK92mi er den positive referansen som brukes i kokulturanalysen, men den er ikke nøyaktig nok. NK92mi-celler er konstruert fra NK92-celler, en permanent cellelinje som uttrykker aktiverte NK-cellefenotyper16, for autonomt å produsere IL-2 for å møte kulturkravene. NK92-celler viser overlegen drapsaktivitet mot K562-celler in vitro enn humane primære NK-celler17. En mer rettferdig sammenligning av den tumordrepende kapasiteten til IVD-produkter kan oppnås ved å analysere cytotoksisiteten til perifere blod NK-celler parallelt, men dessverre mangler tilgang til blodbanker.

Denne to-systemkulturprotokollen tar sikte på å generere CD3−/CD45+CD56+-celler fra hEPSC-er. Vurderingen av overflatemarkører og cytotoksisitet med FACS kan rutinemessig utføres på celler fra 2D-systemer uten å forstyrre differensieringsnisjen. Til tross for forskjellene i prosentandelen av CD3-CD56+-celler, kan 3D- og 2D-systemene utlede CD3-CD56+-celler med tilsvarende variasjoner i CD56-uttrykk (figur 3), og 2D-systemet gjenspeiler eksistensen av lymfoide progenitorer fra 3D-kulturtilstanden.

Betydningen av å utnytte 3D-kultursystemet er at det tillater bruk av høyoppløselige profileringsanalyser, for eksempel romlig transkriptomikk eller avbildning av massespektrometri, for å undersøke romlige forhold og celle-celle-interaksjoner innenfor den komplekse differensieringsnisjen.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung og Celine Chan for deres tekniske assistanse og nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av Platform Technology Fund. Figur 1 er laget med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free Wako Chemicals 017-22231 For resuspending cytokines. 
ACCUMAX STEMCELL Technologies  07921
Anti-human-CD159a-PE BD 375104 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD3-APC antibodies BD 555355 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) 
Anti-human-CD45-APC antibodies BD 555485 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS)
Anti-human-CD56-PE antibodies BD 555516 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS)
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies BD 335826 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Anti-human-CD94-APC  BD 559876 During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Thermo Scientific 11772644
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience Thermo Scientific 16-5838-85
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts STEMCELL Technologies 3470
Dapi Solution, 1 mg/mL BD 564907 It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) 
DMEM CPOS-Bioreagent core 11965092
DMEM/F12 Thermo Scientific 11320033
FcX, human Biolengend 422302
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America CPOS-Bioreagent core 10270106
FlowJo v10.8.0 BD
Gibco  PBS (10x) pH 7.4 CPOS-Bioreagent core 70011044 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red
K562 cells  ATCC  CCL-243
Knockout Serum Replacement Thermo Scientific 10828-028
MyeloCult H5100 medium  STEMCELL Technologies 5150
NK92mi cells  ATCC  CRL-2408 Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL.
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate Thermo Scientific 150628 flat bottom
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate Thermo Scientific 142475
Nunc EasYDish Dishes Thermo Scientific 150460
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector  CELL BIOLABS LTV-400 It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2.
Polybrene  EMD Millipore TR-1003-G
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein R&D Systems 308-FK-005 It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL.
Recombinant Human IL-15 Protein R&D Systems 247-ILB-005 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. 
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein R&D Systems 9124-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. 
Recombinant Human IL-2 Protein R&D Systems 202-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. 
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug PeproTech 200-03 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. 
Recombinant Human IL-7 Protein R&D Systems 207-IL-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. 
Recombinant Human SCF Protein R&D Systems 255-SC-010 It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. 
STEMdiff Hematopoietic Kit STEMCELL Technologies 5310 Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B
StemSpan lymphoid differentiation coating material STEMCELL Technologies 9950 It is resuspended in PBS (100x)
StemSpan NK cell differentiation medium  STEMCELL Technologies 9960 It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x)  into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. 
StemSpan lymphoid expansion medium  STEMCELL Technologies 9960 It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. 
StemSpan NK Cell Generation Kit STEMCELL Technologies 9960 Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. 
The BD LSRFortessa cell analyzer BD
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific 25300054
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254 working concentration: 10 µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nature Cell Biology. 21 (6), 687-699 (2019).
  2. Mackinlay, K. M. L., et al. An in vitro stem cell model of human epiblast and yolk sac interaction. eLife. 10, 63930 (2021).
  3. Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical-scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2048, 107-119 (2019).
  4. Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192 (2018).
  5. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
  6. Dhar, P., Wu, J. D. NKG2D and its ligands in cancer. Current Opinion in Immunology. 51, 55-61 (2018).
  7. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  8. Rungarunlert, S., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors. World Journal of Stem Cells. 1, 11-21 (2009).
  9. Counting cells using a hemocytometer. abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
  10. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294, 15-22 (2004).
  11. Tremblay-McLean, A., Coenraads, S., Kiani, Z., Dupuy, F. P., Bernard, N. F. Expression of ligands for activating natural killer cell receptors on cell lines commonly used to assess natural killer cell function. BMC Immunology. 20, 8 (2019).
  12. Inoue, T., Swain, A., Nakanishi, Y., Sugiyama, D. Multicolor analysis of cell surface marker of human leukemia cell lines using flow cytometry. Anticancer Research. 34 (8), 4539 (2014).
  13. Mhatre, S. Rapid flow cytometry based cytotoxicity assay for evaluation of NK cell function. Indian Journal of Experimental Biology. 52 (10), 983-988 (2014).
  14. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  15. Motazedian, A., et al. Multipotent RAG1+ progenitors emerge directly from haemogenic endothelium in human pluripotent stem cell-derived haematopoietic organoids. Nature Cell Biology. 22 (1), 60-73 (2020).
  16. Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  17. Yan, Y., et al. Antileukemia activity of a natural killer cell line against human leukemias. Clinical Cancer Research. 4 (11), 2859-2868 (1998).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 191
Generering av naturlige drepeceller fra humane utvidede potensielle stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu Ching, P., Wang, C., Hang, S.,… More

Yu Ching, P., Wang, C., Hang, S., Liu, P., Sugimura, R. Generation of Natural Killer Cells from Human Expanded Potential Stem Cells. J. Vis. Exp. (191), e64608, doi:10.3791/64608 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter