Begrensning av tidspunktet for matinntak har dukket opp som et lovende inngrep for å dempe diettinduserte metabolske sykdommer. Dette manuskriptet beskriver konstruksjonen og bruken av et effektivt system bygget internt for å måle og manipulere rytmisk matinntak hos mus.
Rytmisk genuttrykk er et kjennetegn på døgnrytmen og er viktig for å drive rytmisiteten til biologiske funksjoner på riktig tidspunkt på dagen. Studier de siste tiårene har vist at rytmisk matinntak (dvs. tidspunktet hvor organismer spiser mat i løpet av 24-timersdagen), bidrar betydelig til den rytmiske reguleringen av genuttrykk i forskjellige organer og vev i hele kroppen. Effektene av rytmisk matinntak på helse og fysiologi har blitt mye studert siden den gang, og har vist at begrensning av matinntak i 8 timer i den aktive fasen demper metabolske sykdommer som oppstår ved en rekke obesogene dietter. Disse studiene krever ofte bruk av kontrollerte metoder for timing av levering av mat til dyr. Dette manuskriptet beskriver utformingen og bruken av et billig og effektivt system, bygget internt for å måle daglig matforbruk, samt manipulere rytmisk matinntak hos mus. Dette systemet innebærer bruk av rimelige råvarer for å bygge merder egnet for matlevering, etter en brukervennlig håndteringsprosedyre. Dette systemet kan brukes effektivt til å mate mus på forskjellige fôringsregimer som ad libitum, tidsbegrensede eller arytmiske tidsplaner, og kan innlemme et fettfattig kosthold for å studere effekten på atferd, fysiologi og fedme. Det gis en beskrivelse av hvordan villtype (WT) mus tilpasser seg de ulike fôringsregimene.
Den sirkadiske klokken finnes allestedsnærværende på tvers av arter og gir en tidsbevarende mekanisme som hjelper organismer til å tilpasse seg deres rytmisk skiftende miljø. Master circadian pacemaker ligger i den suprachiasmatiske kjernen (SCN) i hypothalamus. SCN er primært innblandet av den miljømessige lys-mørke syklusen, og synkroniserer perifere klokker som er tilstede i nesten hver celle i kroppen via flere signaler, inkludert nevrale og hormonelle signaler, fôring og kroppstemperatur 1,2,3,4,5,6,7,8 . Hos pattedyr er den molekylære sirkadiske klokken avhengig av den heterodimere transkripsjonsfaktoren CLOCK: BMAL1 9,10, som styrer uttrykket av kjerneklokkegenene kalt Periode (Per1, Per2 og Per3) og Cryptochrome (Cry1 og Cry2) for å starte en transkripsjonell tilbakemeldingssløyfe som er kritisk for genereringen av sirkadiske rytmer 9,11,12 . Den molekylære klokken regulerer også den rytmiske transkripsjonen av tusenvis av gener som styrer rytmisiteten til praktisk talt alle biologiske funksjoner13,14,15. Mer enn 50% av genomet hos pattedyr er rytmisk uttrykt i minst en vevstype 16,17,18, og vev som lever hos mus har omtrent 25%-30% av deres transkriptom uttrykt rytmisk18,19. Rytmisk genuttrykk er avgjørende for å aktivere viktige biologiske prosesser som cellesykluskontroll20, glukosehomeostase 21 og aminosyremetabolisme22 til rett tid på dagen for å øke organismens kondisjon.
I løpet av de siste tiårene har det vært økende bevis som tyder på at matinntaket kan fungere som et kraftig synkroniseringssignal for å innføre rytmer i genuttrykk i flere vev, inkludert leveren23,24. Det er viktig at fôring har vist seg å gi rytmer i leveren uavhengig av SCN eller av lys-mørk syklus25, og rytmisk fôring kan drive rytmisk genuttrykk uten å involvere molekylærklokken 26,27,28,29,30,31. Fôring begrenset til den inaktive perioden av mus (dagtid) inverterer ekspresjonsfasen til kjerneklokkegenene og av mange rytmiske gener31. Tidsbegrenset fôring (TRF), som er et ernæringsmessig inngrep der det daglige kaloriinntaket er begrenset til en periode på 8-10 timer, har vist seg å beskytte mot fedme, hyperinsulinemi, hepatisk steatose og metabolsk syndrom32,33. Alle de ovennevnte forsøkene som involverer manipulering av matinntaket krever at eksperimentøren benytter seg av effektive metoder for å levere mat til rett tid på dagen.
Ulike metoder for matlevering er utviklet, med flere fordeler og ulemper 29,34,35,36,37,38,39 (tabell 1). Noen automatiserte matere er designet for å fungere basert på en programvare som kontrollerer mengden, varigheten og tidspunktet for mattilgjengelighet mens du registrerer fôring og frivillig hjulløpsaktivitet hos mus34. Noen få andre metoder innebærer at mus blir plassert i forskjellige bur for forskjellige fôringsforhold, med eksperimentøren som manuelt legger til matpellets på forutsetningstiden38,39. Et annet system bruker et automatisert matersystem som styres av en datamaskin der et pneumatisk drevet skjold hindrer tilgang til mat og som kan styres enten med tidsintervaller eller masse mat35. Alle disse metodene krever enten bruk og oppsett av en datastyrt programvare som kan være kostbar og krever litt trening for riktig drift av instrumentet eller er arbeidskrevende fordi eksperimentøren må være til stede på bestemte tidspunkter for å manuelt endre fôringsforholdene. Datastyrte systemer kommer også med sin del av problemer, inkludert funksjonsfeil i spaker eller dører som slipper maten ut, matpellets som sitter fast i uttakene og programvarebrudd. Videre utgjør lyden som kan produseres under åpningen av dører eller spaker risikoen for å kondisjonere mus til å knytte disse til matlevering, og dermed kompromittere tolkningen av effekter av matmanipulasjon som strengt tatt på grunn av mattilgang eller på grunn av effekter på andre atferdsrytmer som søvn / våkne syklus. Det overordnede målet med denne studien var å utvikle et rimelig og effektivt system for å manipulere langsiktig rytmisk matinntak som ville bidra til å lindre mange av disse nevnte problemene. Først og fremst kan fôringsapparatet som ble utviklet og er beskrevet nedenfor, konstrueres til en svært minimal kostnad sammenlignet med de automatiserte maskinene (tabell 2) og krever ikke sofistikert opplæring for håndtering, drift og vedlikehold. For det andre produserer fôringssystemet bare en hvit bakgrunnsstøy og ingen høye lyder under matlevering, og forhindrer dermed Pavlovsk kondisjonering. Alt i alt er dette fôringssystemet økonomisk, mer tilgjengelig og pålitelig for forskere, samtidig som det er effektivt i manipulering av rytmisk matinntak.
Omfattende forskning har blitt utført de siste tiårene på manipulering av fôringsrytmer og deres effekt på fysiologi. Konstruksjonen og utnyttelsen av fôringssystemet beskrevet her kan brukes som en effektiv metode for å manipulere matinntaket. Protokollen benytter en felles 24-timers timer og en matkopp designet som en åtte-roms arrangør som nøkkelkomponenter i systemet. Merdene kan enkelt konstrueres ved hjelp av noen få lett tilgjengelige verktøy, og håndteringen av systemet er brukervennlig. Noen av de viktigste aspektene ved protokollen for å tilpasse systemet for å manipulere rytmisk matinntak inkluderer daglig bytte av matkopper siden timeren svinger over en 24-timers periode, manuell telling eller veiing av gjenværende mat og daglig justering av antall pellets for AR-fôring. Vanligvis ses plastspon når mus er sultne og ikke får tilstrekkelig mat. Dette problemet kan løses ved å legge til noen flere matpellets som overholder fôringsregimet til ingen plastspon blir sett. Når det gjelder AR-fôring, der daglig mat må justeres, bør det utvises forsiktighet for ikke å indusere rytmen i matinntaket (figur 3B). Derfor er det å foretrekke å enten legge til eller trekke pellets i motsatte rom gjennom hele for å holde mus arytmisk matet.
Dette systemet kan forbedres ytterligere ved å belegge matkoppene med et lag epoksy for å forhindre at musene biter plasten, og dermed bidra til å forlenge levetiden til matkoppene. Overflaten på timeren for plassering av matkoppen kan også modifiseres for å hjelpe matkoppen til å sitte flatt og stabilt på timeren. Dette kan forhindre utilsiktet stopp av timeren forårsaket av en ujevnt plassert timer. Noen av burkomponentene, for eksempel matkopper, kan også 3D-printes for å redusere kostnadene og skreddersys etter forskerens smak. Dette kan inkludere matkopper med mer enn åtte rom, noe som kan gi en bedre tidsoppløsning enn det nåværende 3-timersvinduet.
Selv om det er veldig effektivt, har dette systemet noen begrensninger, for eksempel å være arbeidsintensivt, med forskeren som fortsatt trenger å bytte matkopper hver 24. time og kreve at de manuelt teller / veier den gjenværende maten. I tillegg må tidtakerne overvåkes fra tid til annen for å identifisere potensielle problemer og / eller hvis de sluttet å fungere. Dette kan oppnås ved å telle matpellets som er igjen etter fôring (f.eks. ved å bestemme om noen mus spiste mat bare i noen få rom og lot noen rom være urørt). En annen begrensning av dette systemet er at det kanskje ikke fungerer så bra med kvinnelige mus, siden de få forsøkene som ble utført med kvinner viste at de pleier å hamstre mat og tygge plasten mer enn hannmus.
Likevel er dette fôringssystemet svært effektivt for å manipulere matinntaket, er enkelt å konstruere, betjene, vedlikeholde og er billig sammenlignet med de dyre automatiserte matere som finnes i markedet. Den kan enkelt tilpasses og modifiseres for å passe forskerens krav og trenger ingen spesiell opplæring for å betjene systemet. Det er viktig at timere bare produserer en lav mengde konstant hvit støy, noe som forhindrer mus i å knytte lyd til mattilgjengelighet.
Oppsummert beskriver dette papiret et innovativt fôringssystem som kan brukes til å overvåke daglig matforbruk hos mus og kan tilpasses for å mate mus på forskjellige paradigmer som tidsbegrenset fôring, arytmisk fôring og fôring på fettfattig diett. Dette systemet legger til listen over verktøy som kan brukes til å løse viktige spørsmål innen rytmisk matinntak og dens effekt på fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av tilskuddet R01DK128133 fra NIH / NIDDK (til JSM) og oppstartsmidler fra Texas A &M University.
#6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack) | Everbilt | #800172 | |
#8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack) | Everbilt | #801622 | |
0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch) | USPlastic | #45088 | |
4 inch PVC pipe (10 ft) | Home Depot | #531103 | |
45 mg dustless precision pellets | Bio-Serv | #F0165 | |
6 ft. Extension Cord | HDX | HD#145-017 | |
Food container (eight-compartment jewelry organizer) | JewelrySupply | #PB8301 | |
Indoor Basic Timer | General Electric | #15119 | |
Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout | Home Depot | #39103D | |
Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye) | Research Diets | #D12451 |