Summary
Ce manuscrit présente un protocole détaillé pour imager la dynamique 3D de la paroi cellulaire du tissu de mousse vivant, permettant la visualisation du détachement des parois cellulaires chez les mutants ggb et l’épaississement des motifs de paroi cellulaire dans le type sauvage au cours du développement sur une longue période.
Abstract
L’imagerie accélérée avec microscopie à fluorescence permet d’observer les changements dynamiques de croissance et de développement aux niveaux cellulaire et subcellulaire. En général, pour les observations sur une longue période, la technique nécessite la transformation d’une protéine fluorescente ; Cependant, pour la plupart des systèmes, la transformation génétique prend du temps ou est techniquement indisponible. Ce manuscrit présente un protocole d’imagerie 3D time-lapse de la dynamique de la paroi cellulaire sur une période de 3 jours à l’aide de colorant calcofluor (qui colore la cellulose dans la paroi cellulaire végétale), développé dans la mousse Physcomitrium patens. Le signal de colorant calcofluor de la paroi cellulaire est stable et peut durer 1 semaine sans décomposition évidente. En utilisant cette méthode, il a été démontré que le détachement des cellules chez les mutants ggb (dans lequel la sous-unité bêta de la protéine géranylgéranyltransférase-I est éliminée) est causé par une expansion cellulaire non régulée et des défauts d’intégrité de la paroi cellulaire. De plus, les modèles de coloration au calcofluor changent avec le temps; Les régions moins intensément colorées sont en corrélation avec les futurs sites d’expansion cellulaire / ramification dans le type sauvage. Cette méthode peut être appliquée à de nombreux autres systèmes qui contiennent des parois cellulaires et qui peuvent être colorés par le calcofluor.
Introduction
Les parois cellulaires végétales subissent des changements dynamiques au cours de l’expansion et du développement cellulaires 1,2,3. Le maintien de l’intégrité de la paroi cellulaire est essentiel pour l’adhésion des cellules végétales pendant la croissance et le développement, ainsi que pour la réponse aux signaux environnementaux. Bien que la visualisation de la dynamique de la paroi cellulaire des cellules vivantes sur une longue période de temps soit essentielle pour comprendre comment l’adhésion cellulaire est maintenue pendant le développement et l’adaptation aux changements environnementaux, les méthodes actuelles d’observation directe de la dynamique de la paroi cellulaire sont encore difficiles.
L’imagerie accélérée des changements cellulaires peut fournir une dynamique de développement informative d’un organisme à l’aide d’un microscope à fluorescence à haute résolution 4,5,6,7. Alors que l’imagerie 3D time-lapse a beaucoup de potentiel pour étudier les changements dynamiques de la forme cellulaire au cours de la croissance et du développement, la technique nécessite normalement la transformation d’une protéine fluorescente 4,5,6,7. Cependant, pour la plupart des systèmes, les transformations génétiques prennent du temps ou sont techniquement difficiles. Comme alternative, les colorants fluorescents qui se fixent aux composants cellulaires sont disponibles depuis longtemps. Les colorants fluorescents peuvent émettre de la lumière fluorescente après irradiation avec de la lumière d’une certaine longueur d’onde. Les exemples courants sont Edu, DAPI, PI, FM4-64 et calcofluor blanc 8,9,10. Un inconvénient majeur, cependant, est que ces colorants ne peuvent généralement être utilisés que dans les tissus fixes ou pour de courtes expériences, en partie à cause des dommages qu’ils causent à la cellule 8,9,10.
Avec le protocole présenté ici, les signaux de calcofluor sont stables lorsque du blanc de calcofluor est mélangé dans le milieu lors d’expériences en accéléré dans la mousse P. patens. En utilisant cette méthode, le détachement des cellules chez les mutants ggb à l’aide de l’imagerie 3D time-lapse a été observé sur une période de 3 jours3 (Figure 1). Cette méthode peut être appliquée à de nombreux autres systèmes qui contiennent des parois cellulaires et qui peuvent être colorés par le calcofluor.
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Protocol
NOTA : Voir le tableau des matériaux pour la liste des matériaux et de l’équipement et le tableau 1 pour la liste des solutions à utiliser dans ce protocole.
1. Préparation des plantes pour les plats à fond de verre
- Faire pousser le tissu protonémique de mousse dans un milieu gélosé BCDAT dans une boîte de Petri de 13 cm sous lumière blanche constante (~50 μmol m-2 s-1) pendant 7 jours à 25 °C dans la chambre de croissance.
- Filtrer-stériliser le blanc de calcofluor et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Le réactif est stable pendant plusieurs mois.
- Disperser le tissu de mousse âgé de 7 jours dans un microtube de 1,5 mL contenant 20 μL d’eau stérilisée. Assurez-vous que le tissu protonémique de la mousse est suffisamment dispersé sous forme de petits morceaux dans l’eau. Pour le type sauvage (WT), utiliser une pince pour séparer les protonemata; pour le mutant GGB , utilisez une pipette P-1000.
- Ajouter 10 μL de blanc de calcofluor stérilisé dans le microtube de 1,5 mL et laisser le microtube à la verticale dans la hotte pendant 2 minutes pour le colorer.
- Immédiatement après la coloration, mélanger les plantes avec 200 μL de BCDATG refroidi, contenant un milieu BCDAT supplémenté en glucose à 0,5 % (p/v) et 0,4 % (p/v) de gomme gellane, en pipetant cinq fois avec une pipette P-1000.
REMARQUE : Assurez-vous que le milieu BCDATG est suffisamment refroidi (juste avant que le milieu ne se solidifie) pour éviter de stresser les plantes. - Transférer le mélange contenant les plantes et le milieu BCDATG dans un plat à base de verre de 27 mm de diamètre. S’assurer que le volume de BCDATG pour le mélange des cellules ne dépasse pas 200 μL et que les 200 μL de BCDATG avec les échantillons sont répartis uniformément sur la surface de la capsule inférieure en verre de 7 mm pour produire une fine couche de film, de sorte que les échantillons soient à la distance de travail objective pendant l’imagerie.
- Après avoir solidifié pendant 2 min à température ambiante, couvrir la couche mince avec 3 mL de BCDATG refroidi et laisser reposer pendant 10 min pour solidifier à nouveau.
REMARQUE : Assurez-vous que les étapes 1.2 à 1.5 sont effectuées dans une cagoule stérile pour éviter toute contamination. - Sur le fond du plat, tracez neuf lignes dans le sens parallèle et perpendiculaire (figure 2). Marquez les lignes avec des caractères de a à h et marquez les colonnes avec des nombres de 1 à 8. Utilisez le haut, le bas, la droite, le milieu et la gauche pour marquer les positions dans chaque carré. Par exemple, si une plante se trouve dans un carré de la deuxième rangée et de la sixième colonne et est positionnée dans la partie supérieure gauche du carré, cette plante porte le nom de « b6_upper_left ».
- Préculture Plat à fond de verre contenant les plantes sous lumière rouge pendant 5 jours à 25 °C dans la chambre de croissance, puis sous lumière blanche pendant 1-2 jours avant d’être soumis à une imagerie accélérée tous les jours pendant 3 jours maximum. Pour WT, préculture des plantes en lumière rouge faible (0,5 μmol m-2 s-1) de la ci-dessuspendant 5 jours pour induire la réponse phototropique du protonemata, afin que les plantes puissent se fixer au fond des plats11.
REMARQUE: La lumière rouge faible est fournie en faisant passer une lumière blanche à travers un filtre en plastique acrylique rouge de 3 mm d’épaisseur dans des boîtes résistantes à la lumière. Pour les mutants ggb, la préculture en lumière rouge est facultative, car les mutants ggb n’ont pas de réponse phototrope 3.
2. Imagerie et reconstruction 3D
- Placez le plat à fond de verre contenant des plantes sur la scène d’un microscope confocal inversé, le fond en verre étant orienté vers l’objectif. Utilisez un microscope confocal pour la visualisation du calcofluor avec une lentille d’objectif 20x. Prenez des images avec le laser 405 nm, le sténopé à 1,0, le gain HV à 100, le réglage décalage arrière-plan à 0, la puissance laser à 5%-7%, une taille de numérisation de 1 024 x 1 024 et une vitesse de numérisation de 1/2 image/s. Collectez 17 à 30 sections optiques de la série Z avec une taille de pas de 1,0 μm. Nommez les images à l’aide du code de l’étape 1.6, par exemple « b6_upper_left-day0 », puis enregistrez.
- Sélectionnez le canal DAPI dans Acquisition et cochez la case Z dans ND Acquisition. Pour définir les limites inférieure et supérieure de la pile Z, cliquez sur les boutons Haut et Bas.
- Pour reconstruire les images 3D, ouvrez le fichier .nd2 (Figure 3A ; voir Table des matériaux) et cliquez sur le volume (Figure 3B).
3. Imagerie des mêmes plantes à différents moments
- Après chaque imagerie, remettez le plat à base de verre dans la chambre de croissance.
- Répétez l’étape 2.1 pour l’imagerie et la reconstruction 3D.
NOTE: Pour trouver les mêmes plantes, utilisez le code mentionné à l’étape 1.6 et donnez le nom « b6_upper_left-jour1 », ou « b6_upper_left-jour2 », selon l’âge des plantes.
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Representative Results
Cette méthode permet d’observer la dynamique de la paroi cellulaire au cours du développement chez les mutants de type sauvage et ggb (Figure 1). Les résultats ont montré que les régions avec moins d’épaississement de la paroi cellulaire sont en corrélation avec les sites d’expansion / ramification cellulaire, ce qui permet de prédire les sites d’expansion / ramification dans le type sauvage (Figure 1A). La surface des parois cellulaires chez les mutants ggb a été déchirée au cours du développement en raison de l’expansion cellulaire incontrôlée3 (Figure 1B). De plus, le signal de coloration de la surface brisée des mutants ggb (qui est de la cellulose plus ancienne) est plus fort que la surface cellulaire (qui est de la cellulose plus jeune) sous la surface de la paroi cellulaire brisée.
Figure 1 : Séries chronologiques 3D du développement de la mousse. (A,B) Les changements dynamiques dans les parois transversales ont été mis en évidence par la coloration blanche au calcofluor (qui colore la cellulose) chez les mutants WT (A) et ggb (B). Pour les mutants ggb (B), les lignes de tirets blanches sous chaque image indiquent les parois cellulaires de surface brisées sur les cellules en expansion, et les lignes orange indiquent les cellules sous la surface de la paroi cellulaire en ggb. Le panneau B est reproduit avec la permission de3. Notez que les différences dans le signal blanc de calcofluor peuvent être détectées sur les positions de surface des cellules, et les régions de coloration moins denses (pointes de flèches) sont corrélées aux sites d’expansion / ramification cellulaire. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : d = jours; WT = type sauvage; ggb = géranylgéranyltransférase-I bêta. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Marquage de l’emplacement des plantes. Sur le fond du plat, neuf lignes chacune ont été tracées dans des directions parallèles et perpendiculaires pour marquer l’emplacement des carrés. Les caractères a à h ont été utilisés pour marquer les lignes, et les nombres 1 à 8 ont été utilisés pour marquer les colonnes. Le haut, le bas, la droite, le milieu et la gauche ont été utilisés pour marquer les positions dans chaque carré. Par exemple, si une plante (indiquée par un point vert) était située dans un carré à la deuxième rangée et à la sixième colonne, et positionnée dans la partie supérieure gauche, alors la plante était nommée b6_upper_left. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Reconstruction d’images 3D à l’aide d’un fichier z-stack nd2. (A) Ouvrez un fichier nd2 dans la visionneuse NIS-elements. Cliquez sur LUT (cercle) pour régler le contraste et la luminosité des images, puis cliquez sur Volume (carré) pour reconstruire l’image 3D. (B) Image 3D reconstruite à partir de A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Liste des solutions utilisées dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
La reconstruction 3D en accéléré, ou imagerie 4D, est un outil puissant pour observer la dynamique de la morphologie cellulaire au cours des processus de développement. Dans ce protocole, en mélangeant le blanc de calcofluor dans le milieu, la dynamique de la morphologie cellulaire 3D peut être observée dans la mousse P. patens. En utilisant cette méthode, nous avons observé que la surface des parois cellulaires chez les mutants ggb est déchirée au cours du développement3. De plus, l’épaississement réduit des parois cellulaires est corrélé avec les sites d’expansion / ramification des cellules dans le type sauvage, ce qui permet de prédire les sites d’expansion / ramification. De plus, comme le blanc de calcofluor peut être utilisé avec d’autres colorants, tels que des microsphères, des informations supplémentaires sur l’expansion cellulaire peuvent être observées3.
Il y a deux raisons qui pourraient expliquer comment le colorant calcofluor peut se lier pendant des jours aux plantes sans affecter / endommager la cible moléculaire. Premièrement, la faible concentration de travail (10 μL dans 200 μL de milieu BCDATG, ou 5%) peut être suffisamment faible pour que le protonème de mousse ne soit pas affecté. Deuxièmement, le calcofluor peut colorer le stade mature de la cellulose, car le signal de coloration est beaucoup plus fort dans la partie basale de type sauvage (qui est un tissu plus ancien) que dans la région apicale de la cellule apicale (qui est un tissu plus jeune), et la surface de la paroi cellulaire brisée des mutants ggb (qui est de la cellulose plus ancienne) est plus forte que les cellules (qui est de la cellulose plus jeune) sous la surface de la paroi cellulaire brisée.
Ce protocole a été utilisé pour le tissu de mousse, dont la structure est simple. Le protocole actuel peut également être appliqué à d’autres systèmes avec des structures simples, tels que les poils racinaires et les trichomes dans les plantes à fleurs. Cependant, il reste à voir si la coloration blanche au calcofluor fonctionne pour d’autres systèmes avec plus de couches cellulaires, tels que les tiges. De plus, comme le blanc de calcofluor est mélangé au milieu, le tissu à colorer doit être immergé dans le milieu. Par conséquent, une optimisation peut être nécessaire afin d’appliquer ce protocole à d’autres systèmes.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent ou financier.
Acknowledgments
Les auteurs remercient la Dre Soucy Patricia et Betty Nunn de l’Université de Louisville pour leur aide avec le microscope confocal. Ce travail a été financé par la National Science Foundation (1456884 à M.P.R.) et par un accord de coopération de la National Science Foundation (1849213 à M.P.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
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