Summary
Bu makale, canlı yosun dokusunun 3 boyutlu hücre duvarı dinamiklerini görüntülemek için ayrıntılı bir protokol sunarak, ggb mutantlarında hücre duvarlarının ayrılmasının görselleştirilmesine ve uzun bir süre boyunca gelişim sırasında vahşi tipte hücre duvarı desenlerinin kalınlaştırılmasına izin vermektedir.
Abstract
Floresan mikroskobu ile hızlandırılmış görüntüleme, hücresel ve hücre altı seviyelerde büyüme ve gelişmenin dinamik değişikliklerinin gözlemlenmesini sağlar. Genel olarak, uzun bir süre boyunca gözlemler için, teknik bir floresan proteininin dönüşümünü gerektirir; Bununla birlikte, çoğu sistem için genetik dönüşüm ya zaman alıcıdır ya da teknik olarak kullanılamaz. Bu makale, yosun Physcomitrium patens'te geliştirilen calcofluor boyası (bitki hücre duvarındaki selülozu boyayan) kullanılarak 3 günlük bir süre boyunca hücre duvarı dinamiklerinin 3 boyutlu hızlandırılmış görüntülenmesi için bir protokol sunmaktadır. Hücre duvarından gelen kalkoflor boya sinyali stabildir ve belirgin bir çürüme olmadan 1 hafta sürebilir. Bu yöntem kullanılarak, ggb mutantlarındaki hücrelerin ayrılmasının (protein geranilgeraniltransferaz-I beta alt biriminin nakavt edildiği) düzenlenmemiş hücre genişlemesi ve hücre duvarı bütünlüğü kusurlarından kaynaklandığı gösterilmiştir. Ayrıca, kalkoflor boyama kalıpları zamanla değişir; daha az yoğun boyanmış bölgeler, vahşi tipteki gelecekteki hücre genişlemesi / dallanma bölgeleri ile ilişkilidir. Bu yöntem, hücre duvarları içeren ve kalkoflor tarafından boyanabilen diğer birçok sisteme uygulanabilir.
Introduction
Bitki hücre duvarları, hücre genişlemesi ve gelişimi sırasında dinamik değişikliklere uğrar 1,2,3. Hücre duvarı bütünlüğünün korunması, büyüme ve gelişme sırasında bitki hücresi yapışması ve çevresel sinyallere verilen yanıt için kritik öneme sahiptir. Canlı hücrelerin hücre duvarı dinamiklerini uzun bir süre boyunca görselleştirmek, gelişim sırasında hücre yapışmasının nasıl korunduğunu ve çevresel değişikliklere adaptasyonun nasıl korunduğunu anlamak için kritik öneme sahip olsa da, hücre duvarı dinamiklerini doğrudan gözlemlemek için mevcut yöntemler hala zordur.
Hücresel değişikliklerin hızlandırılmış görüntülemesi, yüksek çözünürlüklü bir floresan mikroskobu 4,5,6,7 kullanarak bir organizmanın bilgilendirici gelişimsel dinamiklerini sağlayabilir. Hızlandırılmış 3-D görüntüleme, büyüme ve gelişme sırasında hücre şeklindeki dinamik değişiklikleri incelemek için büyük bir potansiyele sahip olsa da, teknik normalde bir floresan proteininin 4,5,6,7 dönüşümünü gerektirir. Bununla birlikte, çoğu sistem için genetik dönüşümler ya zaman alıcı ya da teknik olarak zordur. Alternatif olarak, hücresel bileşenlere bağlanan floresan boyalar uzun zamandır mevcuttur. Floresan boyalar, belirli bir dalga boyundaki ışıkla ışınlamadan sonra floresan ışık yayabilir. Yaygın örnekler Edu, DAPI, PI, FM4-64 ve calcofluor white 8,9,10'dur. Bununla birlikte, önemli bir dezavantaj, bu boyaların tipik olarak yalnızca sabit dokuda veya kısa deneylerde, kısmen 8,9,10 hücresine verdikleri zarar nedeniyle kullanılabilmesidir.
Burada sunulan protokolle, yosun P. patenlerindeki hızlandırılmış deneyler sırasında calcofluor beyazı ortam içinde karıştırıldığında calcofluor sinyalleri kararlıdır. Bu yöntem kullanılarak, ggb mutantlarındaki hücrelerin 3 günlük bir süre boyunca 3 günlükbir süre boyunca 3 hızlandırılmış görüntüleme kullanılarak ayrılması gözlendi (Şekil 1). Bu yöntem, hücre duvarları içeren ve kalkoflor tarafından boyanabilen diğer birçok sisteme uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Malzeme ve ekipman listesi için Malzeme Tablosuna ve bu protokolde kullanılacak çözümlerin listesi için Tablo 1'e bakınız.
1. Cam tabanlı tabaklar için bitkilerin hazırlanması
- BCDAT agar ortamındaki yosun protonemal dokusunu, büyüme odasında 25° C'de 7 gün boyunca sabit beyaz ışık altında (~ 50 μmol m-2 s-1) 13 cm'lik bir Petri kabında büyütün.
- Kalkoflor beyazını filtreleyerek sterilize edin ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Reaktif birkaç ay boyunca stabildir.
- 7 günlük yosun dokusunu 20 μL sterilize su içeren 1,5 mL'lik bir mikrotüp içine dağıtın. Yosun protonemal dokusunun suda küçük parçalar halinde yeterince dağıldığından emin olun. Vahşi tip (WT) için, protonemata'yı ayırmak için forseps kullanın; ggb mutantı için bir P-1000 pipet kullanın.
- 1,5 mL mikrotüpe 10 μL sterilize edilmiş kalkoflor beyazı ekleyin ve mikrotüpü boyama için 2 dakika boyunca kaputta dik bırakın.
- Boyama işleminden hemen sonra, bitkileri% 0.5 (w / v) glikoz ve% 0.4 (w / v) gellan sakızı ile desteklenmiş BCDAT ortamı içeren 200 μL soğutulmuş BCDATG ile karıştırın, P-1000 pipet ile beş kez pipetleyin.
NOT: BCDATG ortamının, bitkilerin gerilmesini önlemek için yeterince soğutulduğundan emin olun (ortam katılaşmadan hemen önce). - Bitkileri ve BCDATG ortamını içeren karışımı 27 mm çapında bir cam taban kabına aktarın. Hücrelerin karıştırılması için BCDATG hacminin 200 μL'den fazla olmadığından ve numunelerle birlikte 200 μL'lik BCDATG'nin, ince bir film tabakası üretmek için 7 mm'lik cam alt kabın yüzeyine eşit olarak dağıtıldığından emin olun, böylece numuneler görüntüleme sırasında objektif çalışma mesafesi içinde olur.
- Oda sıcaklığında 2 dakika katılaştıktan sonra, ince tabakayı 3 mL soğutulmuş BCDATG ile örtün ve tekrar katılaşması için 10 dakika bekletin.
NOT: Kontaminasyonu önlemek için 1.2-1.5 adımlarının steril bir davlumbazda uygulandığından emin olun. - Çanağın alt kısmında, her biri paralel ve dik yönlerde dokuz çizgi çizin (Şekil 2). Satırları a'dan h'ye karakterlerle işaretleyin ve sütunları 1'den 8'e kadar sayılarla işaretleyin. Her karedeki konumları işaretlemek için üst, alt, sağ, orta ve sol kullanın. Örneğin, bir bitki ikinci satırda ve altıncı sütunda bir karede ise ve karenin sol üst kısmına yerleştirilmişse, bu bitkiye "b6_upper_left" adı verilir.
- Bitkileri içeren cam alt kabı, büyüme odasında 25 ° C'de 5 gün boyunca kırmızı ışık altında ve daha sonra 3 güne kadar her gün hızlandırılmış görüntülemeye tabi tutulmadan önce 1-2 gün boyunca beyaz ışık altında önceden kültüre alın. WT için, protonemata'nın fototropik tepkisini indüklemek için bitkileri 5 gün boyunca yukarıdan zayıf kırmızı ışıkta (0.5 μmol m-2 s-1) önceden kültüre alın, böylece bitkiler bulaşıkların dibine yapışabilir11.
NOT: Zayıf kırmızı ışık, beyaz bir ışığın 3 mm kalınlığındaki kırmızı akrilik plastik filtreden ışık geçirmez kutulara geçirilmesiyle sağlanır. ggb mutantları için, ggb mutantlarının fototropik bir yanıtı olmadığından kırmızı ışıkta önceden kültürleme isteğe bağlıdır3.
2. Görüntüleme ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon
- Bitkileri içeren cam alt kabı, cam taban hedefe bakacak şekilde ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin. Kalkoflorun 20x objektif lensle görselleştirilmesi için konfokal bir mikroskop kullanın. 405 nm lazer, 1,0'da iğne deliği, 100'de HV kazancı, 0'da ofset-arka plan ayarı, %5-%7'de Lazer Gücü, 1.024 x 1.024 tarama boyutu ve 1/2 kare/sn tarama hızı ile görüntü çekin. Adım boyutu 1,0 μm olan 17-30 z serisi optik bölümleri toplayın. Adım 1.6'daki kodu kullanarak görüntüleri "b6_upper_left-day0" gibi adlandırın ve kaydedin.
- Edinme'de DAPI kanalını seçin ve ND Alımı'ndaki Z kutusunu işaretleyin. Z yığınının alt ve üst sınırlarını ayarlamak için Üst ve Alt düğmelerini tıklatın.
- 3B görüntüleri yeniden oluşturmak için, .nd2 dosyasını açın (Şekil 3A; bkz. Malzeme Tablosu) ve Birim'i tıklatın (Şekil 3B).
3. Aynı bitkileri farklı zaman noktalarında görüntüleme
- Her görüntülemeden sonra, cam taban kabını tekrar büyüme odasına koyun.
- Görüntüleme ve 3B rekonstrüksiyon için adım 2.1'den itibaren tekrarlayın.
NOT: Aynı bitkileri bulmak için, adım 1.6'da belirtilen kodu kullanın ve bitkilerin yaşına göre "b6_upper_left-gün1" veya "b6_upper_left-gün2" adını verin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem, vahşi tip ve ggb mutantlarında gelişim sırasında hücre duvarı dinamiklerinin gözlemlenmesini sağlar (Şekil 1). Sonuçlar, hücre duvarının daha az kalınlaştığı bölgelerin, hücre genişlemesi / dallanma bölgeleri ile ilişkili olduğunu ve vahşi tipte genişleme / dallanma bölgelerinin tahmin edilmesine izin verdiğini göstermiştir (Şekil 1A). ggb mutantlarındaki hücre duvarlarının yüzeyi, kontrolsüz hücre genişlemesi3 nedeniyle gelişim sırasında parçalanmıştır (Şekil 1B). Dahası, ggb mutantlarının (eski selüloz) kırık yüzeyinin boyama sinyali, kırık hücre duvarı yüzeyinin altındaki hücre yüzeyinden (daha genç selüloz) daha güçlüdür.
Şekil 1: Yosun gelişiminin 3 boyutlu zaman serileri . (A,B) WT (A) ve ggb mutantlarında (B) çapraz duvarlardaki dinamik değişiklikler, calcofluor beyaz boyama (selülozu boyayan) ile gösterilmiştir. ggb mutantları (B) için, her görüntünün altındaki beyaz çizgi çizgileri, genişleyen hücrelerdeki kırık yüzey hücre duvarlarını gösterir ve turuncu çizgiler, ggb cinsinden hücre duvarı yüzeyinin altındaki hücreleri gösterir. Panel B ,3'ün izniyle yeniden basılmıştır. Kalkoflor beyaz sinyalindeki farklılıkların hücrelerin yüzey konumlarında tespit edilebileceğini ve daha az yoğun boyama bölgelerinin (ok uçları) hücre genişlemesi / dallanma bölgeleriyle ilişkili olduğunu unutmayın. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: d = gün; WT = vahşi tip; ggb = geranilgeraniltransferaz-I beta. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bitkilerin yerinin işaretlenmesi. Çanağın dibinde, karelerin yerini işaretlemek için her biri paralel ve dik yönlerde dokuz çizgi çizilmiştir. Satırları işaretlemek için a'dan h'ye kadar olan karakterler kullanıldı ve sütunları işaretlemek için 1'den 8'e kadar olan sayılar kullanıldı. Her karedeki konumları işaretlemek için üst, alt, sağ, orta ve sol kullanıldı. Örneğin, bir bitki (yeşil bir nokta ile gösterilir) ikinci sırada ve altıncı sütunda bir kareye yerleştirilmişse ve sol üst kısımda konumlandırılmışsa, bitki b6_upper_left olarak adlandırılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: nd2 z-stack dosyası kullanılarak 3B görüntülerin yeniden yapılandırılması . (A) NIS öğeleri görüntüleyicisinde bir nd2 dosyası açın. Görüntülerin kontrastını ve parlaklığını ayarlamak için LUT'ları (daire) tıklatın ve 3-B görüntüyü yeniden oluşturmak için Ses Düzeyi'ni (kare) tıklatın. (B) A'dan yeniden yapılandırılmış 3 boyutlu görüntü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çözümlerin listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hızlandırılmış 3-D rekonstrüksiyon veya 4-D görüntüleme, gelişimsel süreçler sırasında hücresel morfolojinin dinamiklerini gözlemlemek için güçlü bir araçtır. Bu protokolde, kalkoflor beyazının ortama karıştırılmasıyla, yosun P. patens'te 3-D hücresel morfolojinin dinamikleri gözlemlenebilir. Bu yöntemi kullanarak, ggb mutantlarındaki hücre duvarlarının yüzeyinin gelişim sırasında parçalandığını gözlemledik3. Ayrıca, hücre duvarlarının kalınlaşmasının azalması, vahşi tipteki hücre genişlemesi / dallanma bölgeleri ile ilişkilidir ve genişleme / dallanma bölgelerinin tahmin edilmesine izin verir. Ayrıca, kalkoflor beyazı mikrosferler gibi diğer boyalarla kullanılabildiğinden, hücre genişlemesi hakkında ek bilgiler gözlemlenebilir3.
Kalkoflor boyasının, moleküler hedefi etkilemeden / zarar vermeden günlerce bitkilere nasıl bağlanabileceğini açıklayabilecek iki neden vardır. İlk olarak, düşük çalışma konsantrasyonu (BCDATG ortamının 200 μL'sinde 10 μL veya% 5), yosun protonematasının etkilenmemesi için yeterince düşük olabilir. İkincisi, kalkoflor selülozun olgun aşamasını lekeleyebilir, çünkü boyama sinyali vahşi tipin bazal kısmında (eski doku) apikal hücrenin apikal bölgesinden (daha genç doku) çok daha güçlüdür ve ggb mutantlarının (eski selüloz) kırık hücre duvarı yüzeyi, kırık hücre duvarı yüzeyinin altındaki hücrelerden (daha genç selüloz) daha güçlüdür.
Bu protokol, yapısı basit olan yosun dokusu için kullanılmıştır. Mevcut protokol, çiçekli bitkilerde kök kılları ve trikomlar gibi basit yapılara sahip diğer sistemlere de uygulanabilir. Bununla birlikte, kalkoflor beyaz boyamasının saplar gibi daha fazla hücre katmanına sahip diğer sistemler için çalışıp çalışmadığı görülecektir. Ayrıca, kalkoflor beyazı ortam ile karıştırıldığından, boyanacak doku ortamın içine daldırılmalıdır. Bu nedenle, bu protokolü diğer sistemlere uygulamak için optimizasyon gerekebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip veya finansal çıkarlar beyan etmezler.
Acknowledgments
Yazarlar, Louisville Üniversitesi'nden Dr. Soucy Patricia ve Betty Nunn'a konfokal mikroskopla ilgili yardımları için teşekkür ediyor. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (M.P.R.'ye 1456884) ve Ulusal Bilim Vakfı İşbirliği Anlaşması (M.P.R.'ye 1849213) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
