Summary
このプロトコルでは、化学的発がんによって誘発される正常、腫瘍前、および扁平上皮がんの病変を表すマウスの口腔食道3Dオルガノイドを生成および特性評価するための重要なステップについて説明します。
Abstract
食道扁平上皮癌(ESCC)は世界中で蔓延しており、毎年すべての食道癌症例の90%を占め、すべてのヒト扁平上皮癌の中で最も致命的です。ESCCの開始と発達に伴う分子変化の定義における最近の進歩にもかかわらず、患者の予後は依然として不良です。これらの分子変化の機能アノテーションは必要な次のステップであり、ESCCの分子的特徴を捉え、機能アノテーションのために簡単かつ安価に操作できるモデルが必要です。タバコ煙模倣体4-ニトロキノリン1-オキシド(4NQO)で治療されたマウスは、予想通りESCCおよび食道前腫瘍を形成する。注目すべきことに、4NQO病変は口腔、最も一般的には舌、および前胃にも発生し、これらはすべて層状扁平上皮を共有しています。ただし、これらのマウスは、同質遺伝子マウスモデルの生成に時間とリソースを大量に消費するため、機能仮説検証のために単純に操作することはできません。ここでは、マウスESCCまたは前腫瘍細胞を ex vivoで特徴付けるために、4NQOで処理したマウスから単一細胞由来の3次元(3D)オルガノイドを生成することにより、この制限を克服します。これらのオルガノイドは、ESCCおよび食道前新生物の顕著な特徴を捉え、安価かつ迅速に活用して同質モデルを形成することができ、同系移植実験に利用することができます。正常、腫瘍前、およびSCCマウス食道組織から3Dオルガノイドを生成し、これらのオルガノイドを維持および凍結保存する方法を示します。これらの汎用性の高いオルガノイドの用途は幅広く、遺伝子操作マウスの利用、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によるさらなる特性評価、CRISPR技術を使用した同系オルガノイド株の生成、薬物スクリーニングまたは同系移植が含まれます。このプロトコルで実証された技術の広範な採用は、ESCCの深刻な負担と戦うためのこの分野の進歩を加速すると信じています。
Introduction
食道扁平上皮癌(ESCC)は、診断の遅れ、治療抵抗性、および転移のために、ヒト扁平上皮癌の中で最も致命的です1,2。ESCCは、食道の管腔表面を覆う層状扁平上皮から生じる。扁平上皮は、増殖性基底細胞と基底上細胞層内の分化細胞で構成されています。生理学的条件下では、基底細胞はp63、Sox2、サイトケラチンK5およびK14などのマーカーを発現し、分化細胞はK4、K13、およびIVLを発現します。基底細胞自体は不均一であり、K153およびCD734などのマーカーによって定義される推定幹細胞を含む。恒常性において、基底細胞は基底上細胞層内で有糸分裂後の終末分化を受けるのに対し、分化した細胞は内腔に移動して落屑し、上皮再生を完了する。ESCCは、それらの起源の細胞を彷彿とさせ、さまざまな程度で扁平上皮細胞の分化を示します。ESCCは、非定型基底細胞を含む上皮内腫瘍(IEN)または異形成として知られる多巣性組織学的前駆病変を伴うことがよくあります。上皮の変化に加えて、ESCCは上皮下コンパートメント内の組織リモデリングを示し、そこでは癌関連線維芽細胞(CAF)の活性化と免疫/炎症細胞の動員が起こり、腫瘍促進微小環境が促進されます。
ESCCの病因には、遺伝的変化と環境危険因子への曝露が含まれます。主な遺伝的病変には、腫瘍抑制遺伝子TP53およびCDKN2A(p16INK4A)の不活性化、およびCCND1(サイクリンD1)およびEGFR癌遺伝子の活性化が含まれ、細胞周期チェックポイント機能の障害、異常な増殖、および環境発がん物質への曝露に関連する遺伝毒性ストレス下での生存につながります。実際、遺伝的変化は、行動的および環境的危険因子、最も一般的にはタバコおよびアルコールの使用と密接に相互作用します。タバコの煙には、アルコールの主要な代謝物でもあるアセトアルデヒドなどの人間の発がん物質が含まれています。アセトアルデヒドはDNA付加体と鎖間DNA架橋を誘導し、DNA損傷とDNA変異の蓄積と染色体不安定性を引き起こします。過剰な分裂促進刺激と癌遺伝子活性化による異常な増殖を考えると、食道上皮細胞の悪性形質転換は、抗酸化剤の活性化、オートファジー、上皮間葉転換(EMT)などの遺伝毒性ストレスに対処するメカニズムによって促進されます。興味深いことに、これらの細胞保護機能は、高いCD44(CD44H)発現を特徴とし、腫瘍の開始、浸潤、転移、および治療抵抗性の能力を有するESCC癌幹細胞(CSC)においてしばしば活性化される5、6、7。
ESCCは、細胞培養およびげっ歯類モデルでモデル化されています8,9。過去30年間で、ESCCの堅牢な遺伝子操作マウスモデルが開発されました。これらには、CCND1およびEGFRトランスジェニックマウス10、11ならびにp53ならびにp120Ctonノックアウトマウス12、13が含まれる。ただし、単一の遺伝的変化は通常、急速に発症するESCCをもたらすことはありません。この課題は、ESCC14のヒトの遺伝的病変をよく再現する食道発がん物質の使用によって克服されました。例えば、4-ニトロキノリン-1-オキシド(4NQO)は、CCND1トランスジェニックマウスにおけるESCC発生を加速する15。近年、推定される食道上皮幹細胞、前駆細胞、およびそれらのそれぞれの運命が、細胞系譜追跡可能なマウスモデルにおいて研究されている3,4。さらに、これらの細胞系譜追跡可能なマウスは、ESCCの起源の細胞を探索し、そのような細胞が従来の組織学およびオミックスベースの分子特性評価を介してCD44H CSCをどのように生成するかを探索するために利用されています7。
これらのマウスモデルに関連する新たな分野の1つは、元の組織の構造がex vivoで再現される3次元(3D)オルガノイドシステムで生きたESCCおよび前駆細胞を分析するための細胞培養技術の新しい応用です7,8,9。これらの3Dオルガノイドは、原発性および転移性腫瘍(リンパ節、肺、肝臓の病変など)を含むマウス組織から単離された単一細胞懸濁液から急速に増殖します。細胞は基底膜抽出物(BME)に包埋され、明確に定義された無血清細胞培養培地が供給されます。3Dオルガノイドは7〜10日以内に成長し、得られた球状構造は、CSCマーカー、EMT、オートファジー、増殖、分化、アポトーシス細胞死など、さまざまな細胞特性と機能を分析するための継代培養、凍結保存、およびアッセイに適しています。
これらの方法は、頭頸部粘膜(口腔、舌、咽頭、喉頭)や前胃などの層状扁平上皮組織から確立された3Dオルガノイド培養に広く適用できます。頭頸部粘膜は食道と隣接しており、2つの組織は同様の組織組織、機能、および病気に対する感受性を共有しています。頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)とESCCの両方が、遺伝的病変と、タバコやアルコール曝露などのライフスタイル関連の環境リスク要因を共有しています。この類似性を強調すると、タバコ煙模倣体4NQOで処理されたマウスは、HNSCCとESCCの両方を容易に発症します。以下に説明するプロトコルをHNSCCのモデリングに簡単に適用できることを考慮して、これらの病変から3Dオルガノイド培養を確立するための具体的な手順が含まれています。
ここでは、4NQOで治療されたマウスで発生する正常、腫瘍前、およびESCC病変を表すマウス食道3Dオルガノイド(MEO)を生成するための詳細なプロトコルを提供します。C57BL/6などの一般的な実験株や、細胞系譜追跡可能なその他の遺伝子操作された誘導体など、さまざまなマウス系統を利用することができます。正常または罹患したマウス食道上皮の単離、単一細胞懸濁液の調製、増殖する3Dオルガノイドの培養とモニタリング、継代培養、凍結保存、形態やその他のアプリケーションを含むその後の分析のための処理など、重要なステップを強調しています。
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Protocol
マウス実験は、規制に従い、動物プロトコル#AABB1502の下で計画および実施され、コロンビア大学の施設動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました。マウスは、マウスの人道的な治療を保証し、マウスに適切な獣医ケアを提供し、実験室職員に実験室安全トレーニングを提供する適切な動物飼育施設に収容されました。
1.食道IENおよびESCC病変を誘発するための4NQOによるマウスの治療(時間的考慮事項:最大28週間)
注:腫瘍性食道病変を表すMEOを生成するために、マウスは、Tangらによって前述されたように、4NQOを介した化学的発がんを受けます14。正常/非腫瘍性のMEOは、未治療のマウスから生成されます。
- マウス
- ケージごとに4〜5匹のマウスを飼育し、実験を開始する前に少なくとも1週間動物施設に順応させます。加齢に伴う障害が28週間の完全な実験の早期終了をもたらす可能性を減らすために、8週齢から16週齢のマウスから始めます。.
注:体重約20〜30 gのC57BL / 6マウスがこのプロトコルで利用されました。より短い実験のために、より古いマウスが使用され得る。雄または雌のマウスが許容されます。対照(無治療、セクション1.3.1を参照)マウスは、年齢および性別が一致しなければならない。
- ケージごとに4〜5匹のマウスを飼育し、実験を開始する前に少なくとも1週間動物施設に順応させます。加齢に伴う障害が28週間の完全な実験の早期終了をもたらす可能性を減らすために、8週齢から16週齢のマウスから始めます。.
- 4NQOを含む飲料水の調製
- エチレングリコール溶液1 mg/mL 4NQOストック溶液を調製します(材料表)。シーリングフィルムで覆われた500 mLガラスビーカー内の100 mLの99.9%エチレンプロピレングリコールに100 mgの4NQOを溶解します。マグネチックスターラーを使用して室温(RT)で800rpmで30分間完全に混合します。4°Cで保存してください。
- 1 mg/mL 4NQO原液100 mLにオートクレーブ滅菌した脱イオン水900 mLを加え、シーリングフィルムで覆われた2 Lプラスチックメスシリンダーで転倒混合します。10%エチレングリコール中の100 μg/mL 4NQOの1 Lの容量は、500 mLの飲料ボトルを備えた2つのマウスケージに役立ちます。
注意:注意:4NQOは、癌を引き起こす可能性のある合成化学発がん物質です。ニトリル手袋と長袖の白衣を着用し、つま先の開いた靴を履いてください。適切な目の保護、顔の保護、およびヘッドカバーを検討してください。廃棄物処理の場合、4NQOは、環境衛生と安全による有害廃棄物管理に関する制度的ガイドラインに従って、ラベルの付いた容器に入れる必要があります。
- 4NQOによる治療とモニタリング
- 飲用ボトルを取り付け、飲料水を 自由に 使用して4NQOをマウスに16週間投与します。ビヒクル(無処理)コントロールとして10%(w / v)プロピレングリコールを使用してください。
注:IENを誘発するために、4NQO治療のより短い期間が使用される場合があります。 - 週に一度水を補充してください。
- 各マウスを実験室の天秤の上のプラスチック容器に入れて、毎週体重を量ります。
- 16週間の4NQO治療期間の終わりに、4NQO後の観察期間中、最大12週間マウスに定期的な飲料水を与え始めます(図1)。
- 苦痛の兆候(運動障害、猫背の習慣、引きこもり行動など)、嚥下障害、脱水症状がないかマウスを毎日監視します。さらに、体重または食物および液体摂取量の変化についてマウスを毎週評価します。体重が初期体重から10%以上低下した場合は、マウスに液体栄養補助食品を与えます。
注:液体栄養補助食品に耐性のある体重の減少はESCCを示している可能性があり、体重の20%以上を失うマウスは安楽死させる必要があります。重要なことに、MEOは時期尚早に安楽死させたマウスから生成することができます。遺伝子改変のないC57BL/6マウスは、通常、4NQO後の観察期間が終了するまで、罹患率の兆候を示さず、ESCC病変が見えることに注意してください。
- 飲用ボトルを取り付け、飲料水を 自由に 使用して4NQOをマウスに16週間投与します。ビヒクル(無処理)コントロールとして10%(w / v)プロピレングリコールを使用してください。
- 動物の準備
- CO2で満たされたCO2チャンバー内で、チャンバー容積の30%〜70%を毎分変位させる流速でマウスを安楽死させる。頸部脱臼による死亡を確認。
- 21 Gの針を使用して、仰臥位のマウスの手足と鼻を解剖プラットフォームに固定します。
- マウスの腹面を70%エタノールで消毒します。
- 解剖(時間考慮:0.5時間)
- 中腹部の毛皮と皮膚をつまんで皮膚を開き、下の内臓から確実に放出されるようにします。外科用ハサミを使用して、下腹部からあごまで頭蓋尾の腹側正中線切開を行います。
- 正中線切開から始めて、外科用ハサミを使用して、マウスの両側の手足まで伸びる放射状の切り込みを入れます。皮膚のフラップをはがします。
- 頸部気管を露出させるには、解剖ハサミを使用して正中線で唾液腺を分割します。気管は腺の奥深くにあります。
- 胸部気管を露出させるには、胸骨を取り除きます。
- 鉗子で腹膜をそっとつまんで持ち上げ、はさみを使用して腹膜を胸郭に沿って頭蓋尾側と横方向に分割します。
- 横隔膜の尾面から肝臓を静かに引っ込め、はさみを使用して胸骨ノッチ、特に剣状突起の背側表面で横隔膜を小さく切開します。これにより、肺と心臓が内臓胸膜から解放されます。
- 胸郭を胸部の内容物から分離します。横隔膜の切開部にハサミを挿入し、頸部ガードルまで頭蓋状に解剖します。この解剖中は、下の臓器への損傷を避けるために、胸骨の背側に密着してください。解剖面が気管の前方にあることを確認してください。
- ハサミを使用して胸骨の両側の肋骨を切り、胸骨を取り除きます。胸部の内容物が露出していることを確認してください。
- 腹部食道を露出させます。鉗子で前庭を持って胃を前方にそっと持ち上げます。脾臓、膵臓、腸間膜をハサミで胃と食道から解剖します。
- 胸部食道を露出させます(図2)。
- 甲状腺軟骨のすぐ尾側の気管をそっと持ち上げ、虹彩ハサミを使用して気管の背側の食道を解剖します。
- 甲状腺軟骨の気管を虹彩ハサミで分割します。
- 尾方向に慎重に解剖することにより、食道の残りの部分から気管を剥がします。
- 肺、心臓、胸腺を気管で まとめ て取り除きます。大動脈と大静脈を解剖して分割するときは、食道の損傷を避けるように注意してください。
- 幽門の胃をハサミで分けます。
- 鉗子で前庭を保持し、頭蓋骨を解剖することによって食道を椎骨から分離します。
- 食道を甲状軟骨のレベルで分割し、食道と胃を まとめて採取します(図3)。
- 噴門で食道を分割して胃と食道を分離します(図4、上パネル、赤線)。
- 食道の外面の筋膜を解剖します。組織学用のサンプルを予約するには(オプション)、食道の半分を取り除き、ハサミで縦方向に分割します。残りの無傷の食道を氷上の冷たいPBSに入れます。
- より大きな曲率に沿って胃を開き、PBSで十分に洗います。前胃を分離し、冷たいPBSで洗います。前胃を氷の上の冷たいPBSに入れます。
- 舌を収穫するには、鼻の21 G針を外し、ピンセットで舌を引き抜きます。できるだけ長く舌を切ります。氷の上の冷たいPBSに舌を置きます。
2. マウス食道オルガノイド(MEO)培養の確立
注:このプロトコルは、トリプシン処理の前に舌組織を細刻するステップを追加して、マウス舌オルガノイド培養を確立するためにも使用できます。ステップ 2.2.3 の注記を参照してください。
- 試薬の調製
注意: 試薬のリストは 、材料表に記載されています。特に明記されていない限り、製造元の指示に従ってストック溶液を準備して保管してください。- このプロトコルで使用される基底膜マトリックス(BME)のシングルユースアリコートは、使用日まで-20°Cで保管され、その後氷上または2〜8°Cで解凍され、使用されていないときはいつでも氷上に保たれていることを確認してください。
- 大豆トリプシンインヒビター(STI)250mgをPBS1,000mL(ストック濃度250mg/mL)に溶解し、ろ過滅菌(0.22μm)します。50 mLのアリコートを円錐形のチューブに分注し、4°Cで最大6か月間保管します。
- マウスオルガノイド培地(MOM)の調製:1 mM N-アセチル-L-システイン(NAC)、2%R-スポンジンおよびノギン馴化培地(RN CM)、1x N-2サプリメント、1x B-27サプリメント、10 mM HEPES、1x抗生物質抗真菌薬、1x GlutaMAXサプリメント、および100 ng/mLマウス上皮成長因子(mEGF)をアドバンストDMEM/F12で補充します。MOMを一度に500 mLずつ準備し、50 mLアリコートに分割し、使用する準備ができるまで2〜8°Cで保管します。使用直前に0.5 μg/mLのアムホテリシンBと10 μM Y-27632を加えてください。
- 使用前に、MOM、0.25%トリプシン、および大豆トリプシン阻害剤(STI)を水浴またはビーズ浴で37°Cに予熱します。
- 解剖したマウス組織からのケラチノサイトの単離(時間的考察:2時間)
- 食道組織をPBS中の500 μLのディスパーゼ(合計2.5〜5単位)に移し、サーモミキサーで37°Cおよび800rpmで10分間インキュベートします。
- 組織を培養皿に移し、鉗子を使用して上皮から筋肉層を慎重に取り除きます(図4)。
注:このステップは、経験豊富な研究者がディスパーゼでインキュベーションする前に実行することもできます。 - 上皮を500 μLの0.25%トリプシンを含むマイクロ遠心チューブに移し、サーモミキサーで37°C、800 rpmで10分間インキュベートします。
注:出発物質が舌組織である場合は、トリプシンを加える前に、滅菌メスで組織を約1〜2 mm2 のサイズの小さな断片に細かく刻みます。 - 2,000 x g で5〜10秒間短時間遠心分離して、組織をペレット化します。100 μmのセルストレーナーで50 mLのコニカルチューブを準備します。組織/細胞懸濁液を、円運動を使用して広いボアチップを備えたストレーナに通します。
- ストレーナーを通して3 mLのSTIを加え、円運動を使用して洗浄します。
- 1 mLのツベルクリンシリンジプランジャーのベースでストレーナーをこすり、細胞を押し込みます。
- ストレーナーを3 mLのPBSで3〜5回洗浄し、洗浄の合間にシリンジのベースでストレーナーをこすります。
- チューブを300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
- 上清を取り除き、チューブに1 mLの溶液を残します。
- 残りの1 mLのペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を70 μmのセルストレーナーを通して新しい50 mLコニカルチューブに移します。
- チューブを300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
- ペレットを100 μLのMOMに再懸濁します。必要に応じて音量を調整します。トリパンブルー除外による自動細胞カウントを実行します。
- 初期細胞懸濁液の播種(時間考慮:<1時間)
- 24穴細胞培養プレートを37°Cのインキュベーター内で予熱します。
- 5,000個の生細胞を75%(v/v)BME/MOMでプレートし、ウェルあたり50 μLの総容量でプレートします。以下の計算例に従って、播種するウェルの数を最大化し、1つの追加のウェルに対してBMEで十分なセルを準備します。
注:凍結保存培地(FBS中の10%DMSO)中の余分な細胞を最大濃度1 x 106 細胞/mLで凍結保存します。クライオバイアルを凍結容器に入れて-80°Cで一晩保存します。 それらを気相液体窒素に移して長期保存します。 - 微量遠心チューブでは、まずMOMで適切な細胞希釈液を調製し、次にめっき直前にワイドボアチップを使用してBMEを追加します。
- 200 μLのワイドボアチップを使用して、チップとウェルの底部または側面との接触を避けながら、50 μLの液滴をウェルの中央にゆっくりと加えます(図5)。先端から液体を排出するために力を入れすぎないように注意してください、さもなければドームは平らになります。
- BMEを37°C、5%CO2、95%相対湿度(RH)インキュベーター内で30分間固化させます。
- 0.5 μg/mLのアムホテリシンBと10 μM Y-27632を添加したウェルあたり500 μLのMOMを慎重に加えます。
注:最初の一次培養を通してすべてのMOMにアムホテリシンを追加します。Y-27632は、すべてのパッセージについて、継代当日(0日目)にのみ追加します。 - 3〜4日目にMOMを変更し、その後2〜3日ごとに通過する準備ができるまで交換します。
- 7〜10日目に、オルガノイドを画像化し、形成されたオルガノイドの数を最初に播種した細胞の数で割ることによってオルガノイド形成率(OFR)を測定する。
計算例:
- マウス食道オルガノイド(MEO)の継代と凍結保存(時間的考察:<1.5時間)
- BMEを解凍して氷上に保ちます。使用前に、MOM、0.05%トリプシン、およびSTIを水またはビーズバスで37°Cに予熱します。24穴細胞培養プレートを37°Cのインキュベーター内で予熱します。
- 広口径マイクロピペットチップを使用して、上清とともにBMEドーム内のオルガノイドを収集します。上下にピペッティングしてBMEを混乱させます。
注:同一のサンプルを含むウェルを1つのマイクロ遠心チューブに結合します。 - 2,000 x g で10〜15秒間短時間遠心分離して、オルガノイドをペレット化します。上清を取り除いて廃棄する。
- ペレットを静かに取り除き、ペレットを500 μLの0.05%トリプシンに再懸濁します。
- チューブをサーモミキサーで37°C、800rpmで10分間インキュベートします。
- 600 μLのSTIでトリプシンを不活化します。
- チューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
- 上清を取り除いて廃棄する。細胞ペレットを100 μLのMOMに再懸濁します。トリパンブルー除外による自動細胞カウントを実行します。
注意: 音量は必要に応じて調整できます。 - 75%(v/v)BME/MOMで2,000〜5,000個の生細胞を、ウェルあたり50 μLの総容量でプレートします。プレーティングするウェルの数を最大化し、前述の計算例に従って、1つの追加のウェルに対してBMEで十分なセルを準備します。
注:凍結保存培地(FBS中の10%DMSO)中の余分な細胞を最大濃度1 x 106 細胞/mLで凍結保存します。クライオバイアルを凍結容器に入れて-80°Cで一晩保存します。 それらを気相液体窒素に移して長期保存します。 - 微量遠心チューブでは、まずMOMで適切な細胞希釈液を調製し、次にめっき直前にワイドボアチップを使用してBMEを追加します。
- 200 μLのワイドボアチップを使用して、チップとウェルの底部または側面との接触を避けながら、50 μLの液滴をウェルの中央にゆっくりと加えます。先端から液体を排出するために力を入れすぎないように注意してください、さもなければドームは平らになります。
- プレートを30°C、5%CO2,95%RHインキュベーター内で2分間インキュベートします。
- 10 μM Y-27632を添加したウェルあたり500 μLのMOMを慎重に添加します。
注意: Y-27632は、継代当日(0日目)にのみ追加してください。メディア変更時に追加する必要はありません。アムホテリシンBを追加する必要はもうありません。 - 3〜4日目にMOMを変更し、その後2〜3日ごとに通過する準備ができるまで交換します。
- 7〜10日目に、オルガノイドを画像化し、OFRを測定します。
- マウス食道オルガノイド(MEO)の融解と回収(時間的考察:<1時間)
- BMEを解凍して氷上に保ちます。24穴細胞培養プレートを37°Cのインキュベーター内で予熱します。
- 15 mLのコニカルチューブで10 mLのコールドまたはRT MOMまたはPBSを準備します。
- クライオバイアルを37°Cの水浴またはビーズ浴で約30秒から1分間、または小さな氷ペレットが残るまで解凍します。
- 予め湿らせたピペットチップを使用して、細胞懸濁液をMOMまたはPBSを含むチューブに滴下してゆっくりと移します。
- チューブを300 x g 、4°Cで5分間遠心分離して、細胞をペレット化します。
- 上清を取り除いて廃棄する。細胞ペレットを100 μLのMOMに再懸濁します。必要に応じて音量を調整します。トリパンブルー除外による自動細胞カウントを実行します。
- 75%(v/v)BME/MOMで5,000〜10,000個の生細胞をプレートし、ウェルあたり50 μLの総容量を使用します。プレーティングするウェルの数を最大化し、前述の計算例に従って、1つの追加のウェルに対してBMEで十分なセルを準備します。
- マウス食道オルガノイド(MEO)の継代および凍結保存のためのプロトコルの残りのステップを続行します(ステップ2.4.11を参照)。
3. パラフィン包埋用オルガノイドの調製(時間考慮:<1時間[試薬調製用プラス1.5時間])
- ワイドボアマイクロピペットチップを使用して、マイクロ遠心チューブごとに3つのウェルを収集します。上清と一緒にBMEドームにオルガノイドを収集します。上下にピペッティングしてBMEを混乱させます。
- 2,000 x g で10〜15秒間短時間遠心分離して、オルガノイドをペレット化します。上清を取り除いて廃棄する。
- ペレットを静かに取り除き、300 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)にペレットを再懸濁します。
- オルガノイドを4°Cで一晩固定します。
- 2,000 x g で10〜15秒間短時間遠心分離して、オルガノイドをペレット化します。できるだけ多くのPFAを取り外して廃棄します。
- ペレットを静かに取り除き、ペレットを500 μLのPBSに再懸濁します。
注:固定オルガノイドは、次のステップに進む前に、4°Cで最大2週間保存できます。 - 50 mLの寒天ゲル(2%寒天と2.5%ゼラチン)を準備します。
注:インキュベーション時間のために寒天ゲルストックを事前に準備し、その後オートクレーブサイクルを実施します。- 1 gのバクト寒天と1.25 gのゼラチンを50 mLの水に150 mLのオートクレーブ可能なガラスビーカーに再懸濁します。
- サスペンションを回転させ、RTで30〜60分間放置します。
- オートクレーブを121°Cで20分間行います。
- 少し冷まして、15 mLのコニカルチューブに5 mLのアリコートを分注します。.
- RTで最大6か月間保管してください。
- 微小遠心チューブラックを反転させ、その表面をシーリングフィルムのシートで覆って埋め込み面を準備します。対応するオルガノイドIDでラベル付けします。
- チューブを300 x g で5分間遠心分離し、オルガノイドをペレット化します。上清を取り除いて廃棄する。
- 一方、寒天ゲルを含む15 mLのコニカルチューブを100 mLの水を入れた150 mLのガラスビーカーに入れ、最高出力設定で1〜2分間、または水が沸騰し始めて寒天ゲルが液体状態になるまで電子レンジで加熱することにより、寒天ゲルを液化します。
注意: 電子レンジで加熱する前に、寒天ゲルを含む円錐管のキャップを緩めてください。 - オルガノイドペレットを入れた微小遠心チューブを、マイクロ遠心チューブに水を導入することなく、温水に部分的に沈めます。
- チューブの側面に50 μLの寒天を加えて、オルガノイドペレットを注意深く重ねます。
- ペレットを乱すことなく(再懸濁せず、ペレットを無傷のままにしておく)、寒天ゲル液滴中のペレットを包埋面上のシールフィルムに移す。
- ステップ3.12とステップ3.13を繰り返し、さらに50 μLの液体寒天ゲルを追加して残りのオルガノイドペレットを収集し、同じゲル液滴に注意深く加えます。
- オルガノイドペレットを含む液滴を4°Cで45分間インキュベートします。
- 鉗子を使用して、オルガノイドペレットを含む液滴を標識された病理カセットに注意深く移します。
- カセットを70%エタノールに4°Cで最大1か月間保管します。
- 日常的な組織学的処理を介してパラフィン包埋を進め、パラフィンブロックを調製します。
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Representative Results
このプロトコルは、飲料水中で16週間の4NQO投与からなる特定の治療レジメンに従って、4NQO処置マウスからの正常な食道組織またはESCC腫瘍組織からマウス食道オルガノイド(MEO)を生成するプロセスを説明し、続いて10週間から12週間の観察期間を投与する(図1)。次に、マウスを安楽死させて舌または食道組織の解剖を行います(図2 および 図3)。その後の単一細胞単離に利用される無傷の食道から上皮層を単離する方法(図4)について説明します。食道由来の上皮細胞は、基底膜マトリックス中の細胞を含む50 μLの液滴に1ウェルあたり5,000細胞で最初に播種され、十分に特徴付けられた無血清細胞培養培地(図5)、平均7〜10日間にわたってオルガノイドを形成させます。マウス食道オルガノイド、舌オルガノイド、前胃オルガノイドは、位相差/明視野イメージングによる形態学的解析と病理組織学によってさらに特徴付けることができます(図6)。オルガノイドの自己複製能は、継代培養時にOFRを決定することによって評価することができる(図7)。OFRは、増殖性バサロイド細胞の含有量に大きく影響され、成長速度論解析とその形態によって明らかになりました(図8)。最後に、これらのオルガノイドは、4NQO未処理マウスの正常な構造を含め、継続的に成長し、長期間維持することができます(図9)。
図1:4NQO治療レジメン。 マウスを飲料水中の4NQOで16週間処理し、続いて10週間〜12週間の観察期間を経た。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:胸部食道の露出。 気管(青い線)が食道から剥がれています(白い線)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:扁平上皮柱状接合部(青線)で胃(黄色の線)に接続された食道(白い線)。 略語:FS =前胃、DS =遠位胃、L =肝臓。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:胃と食道を分離し、上皮を分離する。 上:胃が食道から分離されています。赤い線は、解剖中に食道を剥離する場所を示しています。中:上皮(白線)が筋肉層から剥がれています。下: 図1に記載されている治療スケジュールに従った食道腫瘍。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ワイドボアチップを使用した単一細胞を含むBME液滴のメッキ。 オルガノイドは4〜7日目頃に形成を開始し、平均して7〜10日後に継代する準備が整います。BioRender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:形態素解析によるオルガノイドの特性評価。 (A)正常およびESCC MEOの代表的な画像。左上:通常のMEOの明視野画像。左下:正常なMEOのH&E染色。右上:4NQO処理マウスからのESCC MEOの明視野画像。右下:核異型と突然の角質化を示す4NQO治療マウスからのESCC MEOのH&E染色は、ケラチン真珠を連想させ、SCC腫瘍内の高分化したコンパートメントを表しています。 (B)正常マウス舌および前胃オルガノイド(それぞれMTOおよびMFO)の代表的な画像。左上:通常のMTOの明視野画像。左下:正常MTOのH&E染色。右上:通常のMFOの明視野画像。右下:正常なMFOのH&E染色。すべてのスケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:オルガノイド更新能力の決定。 (A)継代培養によるオルガノイド再生能を決定する実験計画。増殖する一次オルガノイド(P0)は、さまざまな時点で解離し、シングルセル懸濁液になります。これらの細胞を継代し、継代培養における7日目にOFRを測定した(P1)。(B)4NQO未処理マウスから生成された継代MEOからの代表的なOFRデータ。OFRは時間の関数として減少し、有糸分裂後の末端分化を受けた細胞をより多く含む成熟オルガノイドの増殖性バサロイド細胞の減少を反映していることに注意してください( 図8を参照)。 p < 0.001(n = 6)7日目、11日目、および21日目のOFR対4日目のOFR。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:様々な時点での形態によって明らかにされたオルガノイドの成長速度論。 4NQO未処置マウスからの正常なMEOの代表的な明視野およびH&E染色像を示す。オルガノイドの内核の角質化は10日目までに顕著になることに注意してください。増殖性バサロイド細胞は、14日目および21日目の時点でも最外層に留まる。免疫組織化学/免疫蛍光では、元の扁平上皮組織の場合と同様に、蓄積されたケラチンが非特異的染色を引き起こす可能性があるため、染色条件、コントロール(二次抗体のみなど)、およびデータの解釈を慎重に最適化する必要があります。すべてのスケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:4NQO未処理マウスから生成された代表的な正常MTOの集団倍増曲線。 これらのオルガノイドは、複数回の継代および長期培養にわたって着実な成長を示すために、以前に生成、凍結保存、および解凍されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコルでは、MEO の生成と分析に関するいくつかの重要な手順と考慮事項があります。MEO実験の再現性と厳密性を確保するには、生物学的複製と技術的複製の両方が重要です。生物学的複製の場合、ESCCを有する2〜3匹の独立したマウスは、一般に、実験条件ごとに十分である。ただし、生物学的反復の適切な数は、個々の研究でテストするパラメーターによって異なる場合があります。例えば、肉眼的に見える病変または組織学的IENおよびESCC病変のない4NQO処理マウスから腫瘍性オルガノイドがどのくらい早期かつどのくらいの頻度で検出されるかは現在不明です。4NQOは様々なマウス系統において食道病変を誘導するが14、MEOはC57BL/6マウスのみから作製されている。ESCCの発生と進行は、Trp53の喪失やサイクリンD1の過剰発現などの遺伝子操作された遺伝的病変を持つマウスで加速されます7,14,15。このようなマウスでは、腫瘍性MEOは、4NQO治療中または治療後に、野生型C57BL / 6マウスよりも頻繁かつ早期に出現する可能性があります。必要に応じて、計画された実験におけるマウスの適切なサンプルサイズを推定するためにパイロット研究を実施する必要があります。マルチウェル細胞培養プレートを使用すると、テクニカルレプリケート(n = 3-6)を簡単に作成できます。ただし、細胞がBMEを含む粘性培地に分注されるため、ウェル間のばらつきを最小限に抑えるために、慎重なピペッティングと実践が必要です。
説明されているプロトコルでのMEO確立には、ほぼ100%の成功率が期待できます。しかしながら、MEO培養の成功は、最初に単離された食道上皮細胞の生存率に依存し、これは出発物質の品質に大きく関係している。安楽死時にマウスをすぐに解剖できない場合は、死体を一晩4°Cに保ち、翌日食道を隔離することができます。しかしながら、凍結組織は生存細胞を生じさせないので、死体は凍結されるべきではない。解離した食道上皮細胞は、凍結培地(90%FBSおよび10%DMSO)中で単一細胞懸濁液として凍結保存し、液体窒素中に保存して後日オルガノイドを生成することができる。食道(上皮シート)は、最適ではありませんが、同様の方法で凍結保存される場合があります。MEOは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)やその他の方法で精製した細胞で開始して食道上皮細胞のユニークなサブセットを精製できますが、精製後に細胞の生存率が低下する可能性があります。トリパンブルー排除試験などの細胞生存率アッセイは、生細胞と死細胞を区別できますが、死にかけている細胞は区別できないため、オルガノイド培養開始前の細胞生存率を過小評価できます。確立後、4NQO処理マウスと未処理マウスの両方からのMEOは無期限に継代することができ(>20継代)、指定された培地の各継代で>80%の生存率が期待されます。要件が不明なままであるオルガノイド培地成分があることは注目に値する。Zhengらは最近、Wnt3A、RSpondin-1、およびNogginを含むサプリメントがマウス食道オルガノイドを増殖させる必要があることを実証しました16。ただし、このプロトコルでは、舌、食道、前胃からのオルガノイドが成長し、Wnt3Aなしで複数回継代(>10継代)できるため、Wnt3Aを利用していません7,3,17。これらの要因の要件は個別にテストされていないことに注意してください。
上皮シートは、腫瘍などの肉眼的に目に見える病変なしに、正常な食道または食道粘膜からMEOを生成するために利用されます。上皮シートの使用は、出発物質としての上皮細胞の濃縮を可能にする。しかしながら、担癌性食道粘膜からの上皮シートの単離は、上皮下区画へのESCC浸潤のために困難である。食道全体を使用してMEO培養を開始できますが、非上皮細胞集団が存在すると、初期培養でのオルガノイド形成率(OFR)が低下する可能性があります。現在のMEO培養条件により上皮細胞がBME内で増殖できるため、OFRはその後の継代で上昇すると予想されます。注目すべきことに、ここで説明するプロトコルは、他の臓器、特に4NQO誘発性扁平上皮発がんの影響を受けやすい口腔舌と前胃にも適用できます。注目すべきは、上皮細胞を単離することなく、組織全体からマウス舌オルガノイド(MTO)とマウス前胃オルガノイド(MFO)を生成したことです。必要に応じて、これらのオルガノイドは、蛍光活性化細胞選別によって精製された上皮細胞の亜集団から作製することができる(例えば、高いCD44発現を特徴とする癌幹細胞、CD73+推定食道幹細胞)。
さらに、非上皮細胞、特に線維芽細胞は、プラスチック表面上の単層で増殖するためにBMEから移動し得、それによって癌関連線維芽細胞を含むマウス食道線維芽細胞の同時確立を可能にする。3D BMEにおける上皮細胞増殖の選択性は、ここに記載されている現在の条件下で、免疫細胞および他の細胞タイプとのMEOの共培養を制限する可能性があります。共存培養実験の最適化を進めています。さらに、腫瘍浸潤前線は、有機型3D培養などの代替3D培養方法によってモデル化された上皮間質界面でよりよく再現される可能性があります8,18。さらに、MEOは、経上皮的電気抵抗を評価するために気液界面培養を利用することによってよりよく評価することができる上皮バリア機能を測定するための適切なプラットフォームではないかもしれない19、20、21。
MEO、そして実際にMTOとMFOの最大の利点は、良性と悪性の両方の元の上皮構造を再現する単一細胞由来の構造の急速な成長です。これらのオルガノイドの倍加時間(DT)は、典型的には<20時間と推定される。4NQO未処理マウスの正常なMTOの成長動態は、正常なオルガノイドの長期培養能力と、予想される集団倍増(PD)レベルおよびDTの両方を示しています(図9)。この例では、各継代中に約10の集団倍増が発生し、計算されたDTは平均して18.5時間と18.3時間でした。最初の初代培養後、播種密度に関係なく、通常15%〜25%のOFRが予想され、MEOはサイズは小さくなりますが、早くも4日目に出現する可能性があります(図8)。位相差顕微鏡下では、正常な食道粘膜のオルガノイドは滑らかな表面を持つ球状構造を示します。時間の関数として、正常なオルガノイドは、内部細胞塊が有糸分裂後の終末分化を受けるときに同心円状の構造を示し、層状扁平上皮を模倣した分化勾配を生成します。腫瘍性オルガノイドは、バサロイド細胞の高い増殖活性を反映して不規則な表面を示し、外向きに拡大する可能性があります。増殖-分化勾配を示すMEOの能力を利用して、増殖性食道基底角化細胞がどのように増殖し、有糸分裂後の終末分化を受けるかを研究することができます。解離したMEO細胞を継代培養することにより、上皮細胞の自己複製(図7)、ならびに4NQOによって誘導される遺伝毒性ストレス下での再生または形質転換を評価することができます。同様の研究はまた、口腔癌の状況においてMTOモデルを利用して実施することができ、記載された4NQOマウスオルガノイドモデルの頭頸部SCCへの適用を広げる。上皮の再生は幹細胞を意味するかもしれませんが、MEOシステムの潜在的な弱点の1つは、MEOの形成が細胞の増殖に依存するため、静止した、またはまれに分裂する幹細胞を検出しない可能性があることです。MEOに関する最近の単一細胞解析研究は、食道上皮細胞の不均一性に関する実質的な洞察を提供しました22。
悪性形質転換は、個々のMEO構造およびMEOを含む細胞の核異型の慎重な形態学的評価によって評価することができる。全エクソームシーケンシングとRNAシーケンシングによるMEOの分子プロファイリングは、腫瘍前病変とESCC病変の明確な性質を明らかにする可能性があります。ただし、悪性形質転換の究極の検査では、ESCC細胞の腫瘍形成性を文書化するために、免疫不全マウスまたは免疫適格マウスのいずれかにMEOを移植する必要があるかもしれません。同系免疫コンピテントマウスに移植されたESCC MEOは、腫瘍免疫微小環境を調査するための優れたプラットフォームを提供する可能性もあります。
MEOの用途は多岐にわたります。形態学、生化学、およびマルチオミクスアプローチに加えて、フローサイトメトリーは、DNA合成、アポトーシス、オートファジー、ミトコンドリア呼吸などの細胞プロセスの分析だけでなく、ex vivoでの遺伝的および薬理学的修飾に対応するMEO内の細胞の固有のサブセットを定義する細胞表面マーカーも利用することができます7,23.さらに、オルガノイドは、上皮細胞と間質、免疫細胞、さらにはマイクロバイオーム24との間の相互作用を評価するための共培養実験に使用され得る。最後に、MEOは、細胞種特異的遺伝子調節プロモーター(例えば、Sox2、サイトケラチンKrt5、およびKrt15)の下で発現される蛍光レポータータンパク質などの細胞系譜追跡可能な遺伝子改変を有するマウスから生成することができる3、4、7、25。
要約すると、MEOはESCCの研究にとって非常に貴重なツールです。ここで説明するプロトコルは、MEOが、生成、維持、および特性評価が比較的簡単で、ESCCおよび食道腫瘍の特徴を再現する能力を備えた用途の広いモデルを表すことを示すことを目的としています。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
コロンビア大学のハーバート・アーヴィング総合がんセンターの共有リソース(Flow Cytometry、Molecular Pathology、Confocal & Specialized Microscopy)の技術サポートに感謝する。Alan Diehl博士、Adam J. Bass博士、Kwok-Kin Wong博士(NCI P01食道発がんのメカニズム)とRustgi研究室とNakakawa研究室のメンバーに有益な議論をしていただき感謝します。この研究は、次のNIH助成金によってサポートされました:P01CA098101(H.N.およびA.K.R.)、R01DK114436(H.N.)、R01AA026297(H.N.)、L30CA264714(F.F.F.)、DE031112-01(F.M.H.)、KL2TR001874(F.M.H.)、3R01CA255298-01S1(J.G.)、2L30DK126621-02
(J.G.)R01CA266978 (C.L.)、R01DK132251 (C.L.)、R01DE031873 (C.L.)、P30DK132710 (C.M. および H.N.)、および P30CA013696 (別名)。H.N.とC.L.は、コロンビア大学ハーバートアーヴィング総合がんセンターMulti-PIパイロット賞を受賞しています。H.N.はファンコニ貧血研究基金賞を受賞しています。F.M.H.は、The Mark Foundation for Cancer Research Award(20-60-51-MOME)およびAmerican Association for Cancer Research Awardを受賞しています。J.G.は、米国消化器病学会(AGA)賞を受賞しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
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