Summary
Denne protokollen beskriver fabrikasjon og karakterisering av en fotoresponsiv prodrug-fargestoff nanoassembly. Metodikken for frigjøring av legemidler fra nanopartiklene ved lysutløst demontering, inkludert lysbestrålingsoppsettet, er eksplisitt beskrevet. Legemidlene som ble frigjort fra nanopartiklene etter lysbestråling, viste gode anti-spredningseffekter på humane kolorektale tumorceller.
Abstract
Selvmontering er en enkel, men pålitelig metode for å konstruere nanoskala legemiddelleveringssystemer. Fotoaktiverbare prodrugs muliggjør kontrollerbar legemiddelfrigjøring fra nanobærere på målsteder modulert av lysbestråling. I denne protokollen presenteres en lettvint metode for fremstilling av fotoaktiverbare prodrugfargede nanopartikler via molekylær selvmontering. Prosedyrene for prodrug syntese, nanopartikkel fabrikasjon, fysisk karakterisering av nanoassembly, fotospaltning demonstrasjon, og in vitro cytotoksisitet verifisering er beskrevet i detalj. Et fotospaltbart bor-dipyrrometen-klorambucil (BC) prodrug ble først syntetisert. BC og et nær-infrarødt fargestoff, IR-783, i et optimalisert forhold, kunne selvmontere seg i nanopartikler (IR783 / BC NP). De syntetiserte nanopartiklene hadde en gjennomsnittlig størrelse på 87, 22 nm og en overflateladning på -29, 8 mV. Nanopartiklene demonterte ved lysbestråling, som kunne observeres ved elektronisk overføringsmikroskopi. Fotospaltningen av BC ble fullført innen 10 minutter, med 22 % utvinningseffektivitet for klorambucil. Nanopartiklene viste forbedret cytotoksisitet under lysbestråling ved 530 nm sammenlignet med de ikke-bestrålte nanopartiklene og bestrålt fritt BC-prodrug. Denne protokollen gir en referanse for konstruksjon og evaluering av fotoresponsive legemiddelleveringssystemer.
Introduction
Kjemoterapi er en vanlig kreftbehandling som benytter cytotoksiske midler for å drepe kreftceller og dermed hemmer tumorvekst1. Imidlertid kan pasienter lide av bivirkninger som kardiotoksisitet og levertoksisitet på grunn av off-target absorpsjon av kjemoterapi narkotika 2,3,4. Derfor er lokalisert legemiddellevering gjennom spatiotemporal kontroll av legemiddelfrigivelse / aktivering i svulster avgjørende for å minimere legemiddeleksponering i normalt vev.
Prodrugs er kjemisk modifiserte legemidler som viser redusert toksisitet i normalt vev mens de beholder sin virkning i syke lesjoner ved aktivering 5,6. Prodrugs kan reagere på en rekke stimuli, for eksempel pH7,8, enzymer 9,10, ultralyd 11,12, varme 13 og lys14,15,1 6, og frigjøre sine overordnede legemidler spesielt i lesjonene. Likevel viser mange prodrugs iboende ulemper, for eksempel dårlig oppløselighet, feil absorpsjonshastighet og tidlig metabolsk ødeleggelse, noe som kan begrense utviklingen17. I denne sammenheng gir dannelsen av prodrug nanoassemblies fordeler som reduserte bivirkninger, in situ legemiddelfrigivelse, bedre oppbevaring og kombinasjonen av behandling og bildebehandling, noe som indikerer stort applikasjonspotensial for disse nanoassemblies. Mange prodrug nanoassemblies er utviklet for sykdomsbehandling, inkludert doksorubicin prodrug nanosfærer, curcumin prodrug miceller og camptothecin prodrug nanofibre18.
I denne protokollen presenterer vi en enkel metode for fremstilling av prodrug-dye nanoassemblies som viser høyt prodruginnhold, god vanndispergerbarhet, langsiktig stabilitet og sensitiv responsevne. IR783 er et vannløselig nær-infrarødt fargestoff som kan tjene som stabilisator av nanoaggregatene19. Den andre komponenten i nanoassemblen er bor-dipyrrometen-klorambucil (BODIPY-Cb, BC), et prodrug som ble designet av to hovedårsaker. Siden klorambucil (Cb) viser systemisk toksisitet in vivo, kan prodrugformen redusere toksisiteten20. BC-prodrug kan fotospaltes ved hjelp av 530 nm lysbestråling rettet mot sykdomslesjoner, noe som muliggjør lokal frigjøring av Cb. På den annen side er Cb utsatt for hydrolyse i vandige miljøer, og kan beskyttes ved å transformere den til en prodrug form21. Dermed var samsamlingen av BC-prodrug og IR-783-fargestoffet forventet å danne et stabilt og effektivt legemiddelleveringsnanosystem (figur 1A). Denne prodrug-dye nanoassemblen forbedrer dispergerbarheten og stabiliteten til prodrugmolekylene, noe som tyder på potensialet for anvendelse i lyskontrollerbar legemiddellevering. Fotospaltningen av BC-prodrug muliggjør demontering av nanopartikler og lyskontrollert frigjøring av Cb i lesjonene (tilleggsfigur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese av bor-dipyrrometen-klorambucil (BC) prodrug (figur 2)22
- Syntese av BODIPY-OAc
- Vei 1,903 g 2,4-dimetylpyrrol og oppløs den i 20 ml vannfri diklormetan (DCM) i en rundbunnskolbe under en nitrogenatmosfære. Vei 1.638 g acetoksyacetylklorid og tilsett dråpevis inn i løsningen. Fortsett å røre i 10 minutter ved romtemperatur og refluks deretter oppløsningen i 1 time ved 40 °C.
- Avkjøl blandingen til romtemperatur. Vei 5,170 g N,N-diisopropyletylamin (DIPEA) og tilsett dråpevis i blandingen under omrøring. Etter 30 minutter veier du 5,677 g bortrifluorid dietyleterat (BF3 · OEt2), tilsett den dråpevis i løsningen, og fortsett å røre i ytterligere 30 minutter.
- Tilsett 10 g silikagel (200-400 mesh) i blandingen og fjern oppløsningsmidlet ved roterende fordampning ved 45 °C. Stopp fordampningen når silikagelen vender tilbake til tørt pulver.
- Tilsett en frit i bunnen av en sylinderampulle (se Materialfortegnelse). Fyll silikagelen (fra trinn 1.1.3) i sylinderampullen og tilsett deretter en ny frit i sylinderampullen på toppen av den fylte gelen.
- Fest kassetten i kragen som er koblet til blitskromatografisystemet (se Materialfortegnelse) og vri den for å låse den. Monter sylinderampullen på toppen av seksveisventilen i blitskromatografisystemet og installer en blitskolonne (se materialfortegnelse) under ventilen.
- Start kromatografiinstrumentet og sett 515 nm og 365 nm som deteksjonsbølgelengder. Utfør eluering med 4/3 (v/v) heksan/DCM. Samle de eluente fraksjonene når 515 nm-signalet vises.
- Fjern oppløsningsvæsken fra de oppsamlede fraksjonene ved roterende fordampning ved 40 °C inntil det ikke samles opp mer oppløsningsvæske i oppsamlingskolben med oppløsningsvæske. Plasser det faste produktet i et vakuumtørkekammer over natten for å fjerne resten av oppløsningsvæsken.
- Syntese av BODIPY-OH
- Vei 1.120 g BODIPY-OAc (syntetisert i trinn 1.1) og oppløs den i 70 ml tetrahydrofuran (THF) ved romtemperatur, helt dekket med folie. Tilsett 70 ml 0,1 M LiOH vandig oppløsning dråpevis i BODIPY-OAc-løsningen.
- Rør blandingen i 30 minutter og fjern oppløsningsvæsken ved 40 °C ved roterende fordampning inntil det ikke samles opp mer oppløsningsvæske i oppsamlingskolben med oppløsningsvæske. Plasser resten i et vakuumtørkekammer over natten for å fjerne vann.
- Løs opp det tørre resten i 30 ml DCM og tilsett 10 g silikagel i oppløsningen. Fjern oppløsningsvæsken ved roterende fordampning ved 40 °C. Stopp fordampningen når silikagelen vender tilbake til tørt pulver.
- Rens produktet BODIPY-OH ved kolonnekromatografi, følg trinn 1.1.4 til 1.1.6, med DCM alene som eluent.
- Sammenlign fraksjoner samlet på forskjellige elueringstidspunkter med en THF-løsning av BODIPY-OAc på tynnsjiktskromatografi (TLC) og identifiser produktet23.
- Spot 3-4 μL av den eluerte fraksjonen og BODIPY-OAc-løsningen separat på den ene kanten av en TLC-plate i samme høyde. Plasser TLC-platen i et glasskammer inneholdende 1 ml DCM, og senk den flekkete kanten ned i DCM-oppløsningsvæsken, men med de to flekkene ut av oppløsningsvæsken.
- Ta ut TLC-platen når DCM-oppløsningsvæsken når over halvparten av platens høyde. Velg den eluerte brøken med et TLC-punkt i en annen høyde enn BODIPY-OAc-punktet.
- Fjern oppløsningsvæsken ved roterende fordampning ved 40 °C (trinn 1.1.7) for å oppnå produktet BODIPY-OH.
- Syntese av BODIPY-(Me)2-OH
- Vei 313 mg BODIPY-OH og oppløs den i 35 ml vannfri dietyleter i mørket under en nitrogenatmosfære. Tilsett 3,75 ml metylmagnesiumjodid (3 M i dietyleter) dråpevis i løsningen og fortsett å røre i 3 timer ved romtemperatur.
- Slukk reaksjonen ved å tilsette 3,5 ml vann dråpevis.
- Pakk ut blandingen med DCM og vann.
- Overfør blandingen til en 125 ml separasjonstrakt. Tilsett 20 ml DCM i blandingen.
- Lukk hetten på separasjonstrakten. Vipp trakten på rundt 45° og rist trakten litt. Åpne hetten for å tømme den. Gjenta dette trinnet 3 ganger, og la det stå i 3 min.
- Åpne bunnventilen og samle den nedre organiske fasen i et beger.
- Tilsett 30 ml DCM til den vandige fasen. Gjenta ekstraksjonen (trinn 1.3.3.2 og 1.3.3.3) 3 ganger med 30 ml DCM hver gang.
- Tilsett 10 g fast Na2SO4 i den oppsamlede organiske fasen for å tørke den organiske fasen over natten.
- Koble en filtreringskolbe til en vakuumpumpe med et gummirør. Legg et stykke filterpapir på Büchner-trakten og sett trakten inn i toppen av kolben. Fukt filterpapiret med 1 ml DCM, overfør blandingen til trakten og slå på vakuumpumpen. Samle den organiske løsningen i kolben.
- Tilsett 10 g silikagel i den organiske løsningen. Fjern det organiske oppløsningsmidlet ved roterende fordampning ved 40 °C til silikagelen går tilbake til tørt pulver. Rens produktet BODIPY-(Me)2-OH ved kolonnekromatografi (trinn 1.1.4 til 1.1.6) med heksan/DCM = 1/1 (v/v) som eluent.
- Velg de eluerte fraksjonene som inneholder produktet ved hjelp av TLC-analyse som beskrevet i trinn 1.2.5 (TLC-punkt i en annen høyde enn BODIPY-OH). Fjern oppløsningsvæsken ved roterende fordampning ved 40 °C for å oppnå produktet som beskrevet i trinn 1.1.7.
- Syntese av BODIPY-(Me)2-I 2-OH
- Vei 41 mg BODIPY-(Me)2-OH og løs det opp i 2,5 ml vannfri THF i mørket under en nitrogenatmosfære. Vei 74 mg N-iodosuccinid, og oppløs det i 1 ml vannfri THF.
- Tilsett N-iodosuccinimidoppløsningen dråpevis i BODIPY-(Me)2-OH-løsningen. Etter omrøring i 3,5 timer ved romtemperatur, fjernes oppløsningsvæsken ved roterende fordampning ved 40 °C inntil det ikke samles opp mer oppløsningsvæske i oppsamlingskolben med oppløsningsvæske på den roterende fordamperen.
- Løs opp resten i 10 ml DCM og vask den 3 ganger med 30 ml vann hver gang, som beskrevet i trinn 1.3.3. Tørk den organiske fasen med Na2SO 4 (trinn 1.3.4 og 1.3.5). Fjern oppløsningsvæsken ved roterende fordampning ved 40 °C (trinn 1.1.7) for å oppnå produktet BODIPY-(Me)2-I 2-OH.
- Syntese av BODIPY-Cb
- Vei 85 mg klorambucil og oppløs det i 2 ml vannfri DCM i mørket under en nitrogenatmosfære. Vei 69 mg N,N'-dicyclohexylcarbodiimide og oppløs det i 1 ml vannfri DCM. Tilsett det dråpevis i klorambuciloppløsningen under omrøring i 10 minutter.
- Løs opp 1,7 mg 4-dimetylaminopyridin i 0,5 ml vannfri DCM. Tilsett denne løsningen i blandingen og fortsett å røre i 10 minutter ved romtemperatur. Tilsett deretter 73 mg BODIPY-(Me)2-I 2-OH oppløst i 2 ml vannfri DCM og fortsett å røre i 2 timer.
- Tilsett 10 g silikagel i blandingen og fjern oppløsningsvæsken ved roterende fordampning ved 40 °C. Stopp fordampningen når silikagelen vender tilbake til tørt pulver. Rens produktet BODIPY-Cb ved kolonnekromatografi (trinn 1.1.4 til 1.1.6, 540 nm og 365 nm signalbølgelengde) med heksan/DCM = 7/3 (v/v) som eluent.
- Velg de eluerte fraksjonene som inneholder produktet, forskjellig fra BODIPY-(Me)2-I 2-OH ved hjelp av TLC-analyse (trinn 1.2.5). Fjern oppløsningsvæsken ved roterende fordampning ved 40 °C (trinn 1.1.7) for å oppnå produktet BODIPY-Cb.
2. Fremstilling av IR783/BC NP ved hjelp av blitsutfellingsmetoden
- Vei 10 mg av BC-prodrug (BODIPY-Cb) og oppløs det i 1 ml DMSO i en 1,5 ml mikrotube for å oppnå en 10 mg/ml stamløsning. Dekk BC-oppløsningen med folie.
- Forbered 300 μL 0,4 mg / ml IR-783 i filtrert avionisert vann i et 1,5 ml mikrorør. Plasser dette mikrorøret på en virvelblander ved 1,500 o / min.
- Tilsett 20 μL av BC-løsningen i DMSO til IR-783-løsningen over 10 s med konstant hastighet ved bruk av en 20 μL pipette. Enden av pipettespissen skal berøre mikrorørets indre vegg (figur 1B).
- Hold mikrorøret på virvelblanderen i ytterligere 30 s for å oppnå IR783 / BC NP-løsningen. Deretter plasserer nanopartikkelløsningen på et stativ som er helt dekket med folie.
- Sentrifuger den resulterende IR783/BC NP-løsningen i 10 minutter ved 2000 x g og 4 °C for å fjerne tilslag. Samle supernatanten, og la ~ 20 μL i røret for å unngå å forstyrre pelleten. Kast pelleten.
- Sentrifuge supernatanten to ganger i 30 minutter ved 30.000 x g og 4 ° C og samle nanopartikkelutfellingen fra begge sentrifugeringene. Resuspender nanopartiklene i 300 μL av 1x PBS.
MERK: Når det hydrofobe BC-prodrug i DMSO dispergeres i vann med virvel, oppløses DMSO av vann, og prodrugmolekylene har en tendens til å danne nanoskalaenheter for å holde seg stabile under den lokale overmetningssituasjonen24. - Kvantifisere innholdet av IR-783 og BC ved høyytelsesvæskekromatografi (HPLC), ved hjelp av elueringsmetoden vist i tabell 1.
MERK: HPLC-prøven fremstilles ved å blande like store mengder nanopartikkelløsning og acetonitril. Injeksjonsvolumet er 20 μL. Deteksjonsbølgelengden for klorambucil og BC-prodrug er 260 nm, og deteksjonsbølgelengden for IR783 er 783 nm. HPLC-kolonnen er en analytisk 4,6 mm (indre diameter) x 100 mm (lengde) C18-kolonne, med en partikkelstørrelse på 2,7 μm og 120 Å porestørrelse. - Beregn prodrug innkapsling effektivitet (EE%) og lastekapasitet (LC%) i henhold til følgende ligninger:
| Tid (min) | Acetonitril (%) | Vann (%) |
| 0 | 20 | 80 |
| 5 | 20 | 80 |
| 30 | 95 | 5 |
| 35 | 95 | 5 |
Tabell 1: HPLC-metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av BC-prodrug og dets fotospaltning. Gjengitt med tillatelse25. Opphavsrett 2022, Wiley.
3. Karakterisering av IR783 / BC NP
- Mål gjennomsnittsstørrelsen på IR783/BC NP med et dynamisk lysspredningsinstrument (DLS) (se Materialtabell). Tilsett 200 μL IR783/BC NP-løsning i en kyvette og sett kyvetten inn i holderen for måling. Sett måletypen som 'størrelse' og måletemperatur som 25 °C. Utfør tre målinger med en varighet på 20 s for hver måling.
- Mål overflateladningen til IR783/BC NP med DLS-instrumentet ved hjelp av en zeta-potensiell testkuvette.
- Fortynn 25 μL IR783/BC NP-oppløsning med 725 μL avionisert vann i et 1,5 ml mikrorør og tilsett oppløsningen til en zeta-potensiell testkuvette. Plasser kyvetten i prøvesporet. Sett lokk på prøvesporet.
- Sett måletypen som 'zeta-potential' og måletemperatur som 25 °C. Utfør 10 målinger.
- Forbered prøvene for transmisjonselektronmikroskopi (TEM) avbildning. Tilsett 10 μL IR783 / BC NP-løsning på et stykke holey karbonfilm på et kobbergitter (300 mesh) og fjern 7 μL. La 3 μL oppløsning ligge på filmen over natten for automatisk fordampning.
MERK: Ved å legge til 10 μL av NP-løsningen etterfulgt av fjerning av 7 μL, kan dråpen dekke et bredere område på filmen.
4. Fotoaktivering av IR783 / BC NP
- Sett opp en LED-lampe (530 nm; se Materialfortegnelse) med et strykejernstativ slik at lyset vender direkte mot betjeningsgulvet. Plasser et integrert kulefotodiodefotometer (se Materialfortegnelse) rett under LED-lampen.
MERK: For å forhindre påvirkning av miljølys, utføres alle lysbestrålingseksperimenter i et mørkerom. - Slå på LED-lampen og åpne hetten på fotometeret. Registrer bestrålingen og sett lampeparametrene ved hjelp av tilhørende programvare (se Materialfortegnelse). Juster inngangsstrømmen (mA) for å stille inn strålingen til 50 mW/cm2.
MERK: Bestrålingen påvirkes også av avstanden mellom LED-lampen og fotometeret. I oppsettet som brukes her (figur 3A,B), er avstanden fastsatt til 5 cm. - Fortynn IR783/BC NP-oppløsningen med avionisert vann til 50 μM basert på BC-konsentrasjon. Tilsett 200 μL av IR783/BC NP-oppløsningen i et 1,5 ml mikrorør. Plasser røret på en skumblokk med en sportilpasningsstørrelse på mikrorøret og samme høyde som fotometeret i trinn 4.1 (figur 3C, D).
- Åpne hetten på røret. Slå på LED-lampen og bestråle nanopartikkelløsningen i 1, 2, 3, 5, 7 og 10 minutter.
- Kvantifisere BC-forbruk og Cb-frigjøring ved HPLC etter lysbestråling. Beregn prosentandelen av gjenværende BC- og Cb-utgivelse ved hjelp av følgende ligninger:
5. Testing av cytotoksisitet av IR783 / BC NP med og uten lysbestråling
- Kultur HCT116 celler (human kolorektal tumor cellelinje) i RPMI 1640 medium inneholdende 10% foster storfe serum og 1% Penicillin-Streptomycin (komplett medium) i en 5% CO 2 atmosfære ved 37 ° C (~2 x 106 celler per tallerken i en 90 mm cellekultur parabolen). Rutinemessig subkultur cellene hver 2-3 dager.
MERK: HCT116 er en human koloncellelinje. Sammenlignet med andre kreftceller som HeLa-, MCF7- og A549-celler, uttrykker HCT-116-celler et høyere nivå av caveolin-125, som kan målrettes av IR783 og forbedre det cellulære opptaket av IR783 / BC NP. - Plate HCT116-cellene i 96-brønnplater med RPMI 1640 komplett medium med en tetthet på 104 celler per brønn.
- Aspirer mediet fra kulturskålen når cellekonfluensen overstiger 50%. Vask cellene med 1x PBS og fjern PBS. Tilsett 1 ml 0,25% trypsinoppløsning og inkuber ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
- Etter 3 minutter, tilsett 2 ml komplett medium for å slukke trypsinfordøyelsen. Resuspender cellene, overfør cellesuspensjonen til et 15 ml sentrifugeringsrør og sentrifuge ved 300 x g i 3 minutter. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml komplett medium.
- Fortynn 10 μL av cellesuspensjonen til 200 μL med komplett medium. Plasser 10 μL på et hemocytometer og dekk det med et deksel.
- Observer hemocytometeret under et mikroskop (okular: 10x; objektivlinse: 4x). Tell og registrer cellenumrene i de fire hjørnefirkantene og midten. Beregn cellekonsentrasjonen ved hjelp av formelen:
Hvor n = gjennomsnittet av celletallene til de fem kvadratene. - Fortynn cellesuspensjonen til 1 x 105 celler/ml. Tilsett 100 μL av cellesuspensjonen per brønn i en 96-brønnsplate for å frø cellene. Tilsett 100 μL PBS per brønn i de useedede brønnene.
- Behandle cellene med (1) 0,1-150 μM fri BC, (2) 0,1-150 μM IR783 / BC NP (basert på BC-konsentrasjon), (3) 0,1-150 μM fri BC med lysbestråling, eller (4) 0,1-150 μM IR783 / BC NP (basert på BC-konsentrasjon) med lysbestråling. Inkuber cellene ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator i 6 timer.
MERK: De frie BC- og IR783/BC NP-løsningene er utvannet fra sine respektive lagerløsninger med komplett medium. - Etter 6 timers inkubasjon, erstatt prodrug/nanopartikkelholdig medium med friskt komplett medium. Inkuber ikke-bestrålingsgruppe 1 og 2 i mørket i 24 timer. For gruppe 3 og 4, bestråle cellene med en 530 nm LED-lampe (50 mW/cm2) i 5 minutter, og inkuber i 24 timer.
MERK: Celleplater er plassert på en skumblokk for å sikre samme høyde som fotometeret i trinn 4.1. - Bestem cellens levedyktighet med 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse.
- Etter BC- eller nanopartikkelbehandling, tilsett 10 μL MTT (10 mg / ml i PBS) til hver brønn og inkuber platene ved 37 ° C i 3 timer. Fjern deretter mediet og tilsett 100 μL DMSO til hver brønn. Les av absorbansen med en mikroplateleser ved 490 nm, 570 nm og 630 nm.
- Beregn cellens levedyktighet ved hjelp av følgende ligning:
MERK: Fire uavhengige eksperimenter (n = 4) av hver gruppe er utført for analyse. OD490 kan erstattes av OD570-OD 630 ved beregning av cellelevedyktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IR783 / BC NP ble vellykket fremstilt i denne studien ved hjelp av en flash-utfellingsmetode. De syntetiserte IR783 / BC NPene presenteres som en lilla løsning, mens den vandige løsningen av IR783 var blå (figur 4A). Som vist i figur 4B viste IR783 / BC NP en gjennomsnittlig størrelse på ca. 87,22 nm med en polydispersitetsindeks (PDI) på 0,089, noe som viser en smal størrelsesfordeling. Overflateladningen til IR783/NP var ca. -29,8 mV (figur 4C), noe som kan tilskrives de negativt ladede sulfonatgruppene av IR783. Figur 4D viser stabiliteten til IR783/BC NP. Størrelsen på nanopartiklene ble opprettholdt på rundt 85 nm i minst 48 timer (i PBS ved 37 ° C) etter fabrikasjon, mens PDI også forble mindre enn 0, 2. Ingen signifikant endring ble observert i størrelsesfordelingen av IR783/BC NP ved 0 timer, 24 timer og 48 timer etter fabrikasjon (figur 4E).
Figur 5A,B viser morfologien til IR783/BC NP før og etter lysbestråling, henholdsvis. Både aggregater og fragmenter kunne observeres etter lysbestråling, noe som indikerer henholdsvis dissosiasjon og aggregering av nanopartiklene. Figur 5C viser endringen i nanopartikkelstørrelse og dens fordeling etter 3 min og 5 min lysbestråling. En økt størrelse og bredere fordeling ble observert for de bestrålte nanopartiklene. Fotoutgivelsesprofilene til IR783/BC NP ble også målt med HPLC. Som vist i figur 5D,E ble prodrug BC fotospaltet på 10 minutter. I mellomtiden ble Cb utgitt med en utvinningseffektivitet på rundt 22% i samme periode.
IR783/BC NP viste signifikant cytotoksisitet på humane kolorektale tumorceller (HCT116) under lett bestråling ved 530 nm sammenlignet med ikke-bestrålingsgruppen (figur 6). IC50 av IR783 / BC NP med lysbestråling (6, 62 μM) var lavere enn for fri BC med lysbestråling (9, 24 μM), noe som viser en høyere in vitro antitumoreffekt av IR783 / BC NP med lysbestråling enn for fri BC med lysbestråling25. Den presenterte cytotoksisiteten skyldtes både frigjorte Cb og genererte reaktive oksygenarter (ROS) (tilleggsfigur 1 og tilleggsfigur 2). Den høyere cytotoksisiteten til IR783 / BC NP under lysbestråling var hovedsakelig forårsaket av det effektive cellulære opptaket av IR783 / BC NP25.
Figur 1: Dannelse av IR783/BC NP. (A) Selvmontering og lysutløst dissosiasjon av IR783/BC NP. (B) Fabrikasjonsskjema for IR783/BC NP ved utfelling. Gjengitt med tillatelse25. Opphavsrett 2022, Wiley. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Syntesevei for prodrug BODIPY-Cb (BC). BODIPY-derivater ble først syntetisert fra acetoksyacetylklorid og 2,4-dimetylpyrrol, og deretter konjugert med Cb. 1H-NMR-spektrum av BC-prodrug er vist i tilleggsfigur 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oppsett av LED-bestråling. (A,B) LED-lampeinnstilling for måling av stråling. (C,D) LED-lampeinnstilling for bestråling av IR783 / BC NP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Karakterisering av IR783/BC NP. (A) Utseende av frie IR783-, frie BC- og IR783/BC NP-løsninger. (B) Størrelsesfordeling av IR783/BC NP. (C) Overflateladning av IR783/BC NP. (D) Endring av størrelse på IR783/BC NP i PBS ved 37 °C i løpet av 48 timer etter fabrikasjon. (E) Størrelsesfordeling av IR783 / BC NP ved 0 timer, 24 timer og 48 timer etter fabrikasjon. Gjengitt med tillatelse25. Opphavsrett 2022, Wiley. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fotoutgivelse av IR783/BC NP. TEM-bilder av IR783/BC NP (A) før og (B) etter lysbestråling. Skalastang = 100 μm. (C) Størrelsesfordeling av IR783/NP etter 0 min, 3 min og 5 min lysbestråling. (D) HPLC-analyse av IR783 / BC NP utsatt for økende varighet av lysbestråling til 10 min. (E) Kvantifisering av BC- og IR783-nedbrytning og Cb-frigjøring (n = 3). Feilfelt representerer standardavvik. Lysbestråling: 530 nm LED-lampe, 50 mW/cm2. Gjengitt med tillatelse25. Opphavsrett 2022, Wiley. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Cytotoksisitet av IR783/BC NP mot HCT116-celler. Signifikant cytotoksisitet forekom ved BC-konsentrasjoner >1 μM (n = 4). Feilfelt representerer standardavvik. En uavhengig prøve t-test ble tatt i bruk for å bestemme den statistiske signifikansen av forskjeller. *p < 0,05, **p < 0,01. Lysbestråling: 530 nm LED-lampe, 50 mW/cm2. Gjengitt med tillatelse25. Opphavsrett 2022, Wiley. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Fotokjemisk mekanisme. (A) Fotospaltning av BC-prodrug. (B) Dekomponering av IR783. Tilrettelagt med tillatelse25. Opphavsrett 2022, Wiley. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: ROS-generasjonsprofil. ROS-generering av forskjellige prøver under lysbestråling kvantifisert med en singlet oksygensensor grønn (SOSG) sonde. Lysbestråling: 530 nm LED-lampe, 50 mW/cm2. Tilrettelagt med tillatelse25. Opphavsrett 2022, Wiley. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: 1H-NMR-spektrum av BODIPY-Cb. Gjengitt med tillatelse22. Opphavsrett 2022, American Chemical Society. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen skisserer en lettvint utfellingsmetode for fremstilling av prodrug-dye nanopartikler, som gir en enkel og praktisk tilnærming til nanopartikkeldannelse. Det er flere kritiske trinn i denne metoden. For det første, for alle trinn av syntese, fabrikasjon og karakterisering, bør beholdere som mikrorør dekkes med folie for å unngå unødvendig fotospaltning av BC-prodrug av miljølys. Videre, i blitsutfellingstrinnet, bør mikrorøret som inneholder IR-783-løsningen plasseres stabilt på virvelblanderen mens den sakte tilsetter BC-prodrugløsningen. På denne måten kan BC-prodrug løsningen (i DMSO) dispergeres jevnt i IR-783-løsningen. I rensetrinnet brukes en differensialsentrifugeringsmetode. Den første sentrifugeringen ved 2000 x g brukes til å fjerne de ubelastede BC-prodrugfaste stoffene, mens den andre sentrifugeringen ved 30.000 x g fjerner DMSO og IR783 i supernatanten som ikke er innlemmet i nanopartiklene. IR783 / BC NP kan deretter samles som bunnfall og resuspenderes i filtrert avionisert vann.
Selvmontering er en enkel og effektiv metode for fremstilling av nanopartikler. Imidlertid må selvmonteringsmetoden optimaliseres i henhold til faktorer som hydrofobisiteten til byggeklosser. I denne protokollen er en av komponentene, IR783, et vannløselig fargestoff som er oppløst i vann. Men i noen tilfeller kan alle komponentene være hydrofobe. Under slike omstendigheter bør de oppløses i DMSO som BC-prodrug i denne protokollen. En stabilisator som 1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-Poly (etylenglykol) (DSPE-PEG) kan brukes til å danne og stabilisere selvmonterte nanopartikler 14,26,27.
Lys har begrenset vevspenetrasjon, noe som begrenser anvendelsen av fotoaktiverbare nanopartikler i klinisk bruk. En løsning er å utvikle lysaktiverbare systemer med lang bølgelengde, for eksempel rødt eller nær-infrarødt lys28. Ved hjelp av optiske fibre for å levere lys er en annen måte å løse begrenset vev penetrasjon problemet med lys for noen sykdom lesjoner29. Videre er samsamlingen av komponenter hovedsakelig avhengig av intermolekylære krefter som hydrofob interaksjon, π-π-stabling og hydrogenbinding, noe som antyder at denne metoden kanskje ikke gjelder for alle prodrug og fargestoffmolekyler30. Muligheten for sammontering av funksjonelle molekyler som stoffer, prodrugs, fargestoffer, fotosensibilisatorer og fototermiske midler må evalueres gjennom teoretisk beregning og eksperimentell karakterisering.
Det fotoaktiverbare prodrug-dye nanoskala legemiddelleveringssystemet har flere fordeler. For det første kan fargestoffer som IR783 brytes ned under lysbestråling, og deretter muliggjøre lokal og spesifikk demontering av nanopartiklene25. Videre kan det inkorporerte fargestoffet fungere som et bildebehandlingsmiddel for overvåking av legemiddelleveringssystemet, med dets fluorescens som brukes til å spore akkumulering og demontering av nanopartiklene. I tillegg har indokyaninfargestoffer med sulfonatgrupper blitt rapportert å kunne målrette caveolae i noen kreftformer19, noe som muliggjør effektivt cellulært opptak av legemiddelleveringssystemene25. Dermed har indocyaninfargestoffer med lignende strukturer stort potensial for inkorporering i slike legemiddelleveringssystemer.
Det har bare vært noen få publikasjoner så langt om standardisering av operasjoner på fotoaktivering av nano-legemiddelleveringssystemer31. Dermed kan protokollen beskrevet her tjene som en nyttig referanse for å utvikle fotoresponsive legemiddelleveringssystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
En PCT-søknad er innlevert til No.PCT/CN2021/081262.
Acknowledgments
Vi anerkjenner assistanse fra University of Hong Kong Li Ka Shing, Det medisinske fakultets kjernefasilitet. Vi takker professor Chi-Ming Che ved University of Hong Kong for å gi den menneskelige HCT116-cellelinjen. Dette arbeidet ble støttet av Ming Wai Lau Centre for Reparative Medicine Associate Member Program og Research Grants Council of Hong Kong (Early Career Scheme, nr. 27115220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II HPLC | Agilent Technologies | ||
| 2,4-Dimethyl pyrrole | J&K Scientific | 315305 | |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) | Gibco | M6494 | |
| 4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) | J&K Scientific | 212279 | |
| 90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile | SPL | 11090 | |
| 96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile | SPL | 30096 | |
| Acetoxyacetyl chloride | J&K Scientific | 192001 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | J&K Scientific | 921076 | |
| Büchner funnel | AS ONE | 3-6466-01 | |
| Chlorambucil | J&K Scientific | 321407-1G | |
| CM100 Transmission Electron Microscope | Philips | ||
| CombiFlash RF chromatography system | Teledyne ISCO | ||
| Dichloromethane | DUKSAN Pure Chemicals | JT9315-88 | |
| Dimethyl sulfoxide | DUKSAN Pure Chemicals | 2762 | |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | DTS1070 | Zeta potential measurement |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| Empty Disposable Sample Load Cartridges | Teledyne ISCO | 693873225 | can hold up to 65 g |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| Filtering flask | AS ONE | 3-7089-03 | |
| Hexane | DUKSAN Pure Chemicals | 4198 | |
| Holey carbon film on copper grid | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd | BZ10023a | |
| HPLC column (InfinityLab Poroshell 120) | Agilent Technologies | 695975-902T | |
| Integrating sphere photodiode power sensor | Thorlabs | S142C | |
| IR783 | Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd | I1031 | |
| LED | Mightex | LCS-0530-15-11 | |
| LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software) | Mightex | ||
| Lithium Hydroxide Anhydrous | TCI | L0225 | |
| Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether | Aladdin | M140783 | |
| N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA) | J&K Scientific | 203402 | |
| N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) | J&K Scientific | 275928 | |
| penicillin–streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (10×) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Power and energy meter | Thorlabs | PM100 USB | |
| Rotavapor | BUCHI Rotavapor R300 | ||
| RMPI 1640 | Gibco | 21870076 | |
| Separatory funnel (125 mL) | Synthware | F474125L | |
| Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g | Teledyne ISCO | 692203340 | |
| Sodium sulfate, anhydrous | Alfa Aesar | A19890 | |
| SpectraMax M4 | Molecular Devices LLC | ||
| Tetrahydrofuran (THF), anhydrous | J&K Scientific | 943616 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Vortex | DLAB Scientific Co., Ltd | MX-S | |
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instrument |
References
- Chabner, B. A., Roberts, T. G. Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
- Monsuez, J. -J., Charniot, J. -C., Vignat, N., Artigou, J. -Y.
- Floyd, J., Mirza, I., Sachs, B., Perry, M. C.
- Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced vascular toxicity-real-time in vivo imaging of vessel impairment. Journal of Visualized Experiments. (95), e51650 (2015).
- Denny, W. A.
- Kastrati, I., Delgado-Rivera, L., Georgieva, G., Thatcher, G. R. J., Frasor, J. Synthesis and characterization of an aspirin-fumarate prodrug that inhibits NFκB activity and breast cancer stem cells. Journal of Visualized Experiments. (119), e54798 (2017).
- Mao, J., et al. A simple dual-pH responsive prodrug-based polymeric micelles for drug delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (27), 17109-17117 (2016).
- Li, S. -Y., et al. A pH-responsive prodrug for real-time drug release monitoring and targeted cancer therapy. Chemical Communications. 50 (80), 11852-11855 (2014).
- Andresen, T. L., Thompson, D. H., Kaasgaard, T. Enzyme-triggered nanomedicine: Drug release strategies in cancer therapy (Invited Review). Molecular Membrane Biology. 27 (7), 353-363 (2010).
- Xu, G., McLeod, H. L. Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy. Clinical Cancer Research. 7 (11), 3314-3324 (2001).
- Luo, W., et al. Dual-targeted and pH-sensitive doxorubicin prodrug-microbubble complex with ultrasound for tumor treatment. Theranostics. 7 (2), 452 (2017).
- Gao, J., et al. Ultrasound triggered phase-change nanodroplets for doxorubicin prodrug delivery and ultrasound diagnosis: An in vitro study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 174, 416-425 (2019).
- Brade, A. M., Szmitko, P., Ngo, D., Liu, F. -F., Klamut, H. J. Heat-directed suicide gene therapy for breast cancer. Cancer Gene Therapy. 10 (4), 294-301 (2003).
- Long, K., et al. One-photon red light-triggered disassembly of small-molecule nanoparticles for drug delivery. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 357 (2021).
- Liu, Y., Long, K., Kang, W., Wang, T., Wang, W. Optochemical control of immune checkpoint blockade via light-triggered PD-L1 dimerization. Advanced NanoBiomed Research. 2 (6), 2200017 (2022).
- Wang, T., et al. Optochemical control of mTOR signaling and mTOR-dependent autophagy. ACS Pharmacology & Translational Science. 5 (3), 149-155 (2022).
- Abet, V., Filace, F., Recio, J., Alvarez-Builla, J., Burgos, C. Prodrug approach: An overview of recent cases. European Journal of Medicinal Chemistry. 127, 810-827 (2017).
- Li, G., et al. Small-molecule prodrug nanoassemblies: an emerging nanoplatform for anticancer drug delivery. Small. 17 (52), 2101460 (2021).
- Shamay, Y., et al. Quantitative self-assembly prediction yields targeted nanomedicines. Nature Materials. 17 (4), 361-368 (2018).
- Sinoway, P. A., Callen, J. P.
- Owen, W. R., Stewart, P. J. Kinetics and mechanism of chlorambucil hydrolysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 68 (8), 992-996 (1979).
- Lv, W., et al. Upconversion-like photolysis of BODIPY-based prodrugs via a one-photon process. Journal of the American Chemical Society. 141 (44), 17482-17486 (2019).
- Silver, J. Let us teach proper thin layer chromatography technique. Journal of Chemical Education. 97 (12), 4217-4219 (2020).
- Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Long, K., et al. Photoresponsive prodrug-dye nanoassembly for in-situ monitorable cancer therapy. Bioengineering & Translational Medicine. 7 (3), 10311 (2022).
- Zhong, T., et al. A self-assembling nanomedicine of conjugated linoleic acid-paclitaxel conjugate (CLA-PTX) with higher drug loading and carrier-free characteristic. Scientific Reports. 6 (1), 36614 (2016).
- Long, K., et al. Green light-triggered intraocular drug release for intravenous chemotherapy of retinoblastoma. Advanced Science. 8 (20), 2101754 (2021).
- Lv, W., Wang, W. One-photon upconversion-like photolysis: a new strategy to achieve long-wavelength light-excitable photolysis. Synlett. 31 (12), 1129-1134 (2020).
- Rwei, A. Y., Wang, W., Kohane, D. S. Photoresponsive nanoparticles for drug delivery. Nano Today. 10 (4), 451-467 (2015).
- Grzelczak, M., Vermant, J., Furst, E. M., Liz-Marzán, L. M.
- Gnanasammandhan, M. K., Idris, N. M., Bansal, A., Huang, K., Zhang, Y. Near-IR photoactivation using mesoporous silica-coated NaYF4:Yb,Er/Tm upconversion nanoparticles. Nature Protocols. 11 (4), 688-713 (2016).
