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Biochemistry

孔雀石绿测定法用于发现热休克蛋白 90 抑制剂

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64693
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology (KIST), 2School of Life Sciences, University of Sussex

Summary

孔雀石绿测定方案是一种简单且经济高效的方法，用于发现热休克蛋白 90 （Hsp90） 抑制因子以及其他针对 ATP 依赖性酶的抑制剂化合物。

Abstract

热休克蛋白90（Hsp90）是一种有前途的抗癌靶点，因为它对多种致癌蛋白具有伴侣作用。Hsp90的活性取决于其将三磷酸腺苷（ATP）水解为二磷酸腺苷（ADP）和游离磷酸盐的能力。Hsp90的ATP酶活性与其伴侣功能有关;ATP与Hsp90的N端结构域结合，破坏其结合被认为是抑制Hsp90功能最成功的策略。ATP酶活性可以通过比色孔雀石绿测定法测量，该测定法确定ATP水解形成的游离磷酸盐的量。这里描述了使用孔雀石绿磷酸测定试剂盒测定酵母Hsp90的ATP酶活性的程序。此外，还提供了通过服用格尔达霉素作为真实抑制剂来发现Hsp90抑制剂的详细说明。最后，讨论了该测定方案通过针对酵母Hsp90的抑制剂分子的高通量筛选（HTS）的应用。

Introduction

热休克蛋白90（Hsp90）是一种分子伴侣，可维持负责癌症发展和进展的蛋白质的稳定性。此外，负责抗肿瘤药物耐药性的蛋白质也是Hsp901的客户。Hsp90在所有癌细胞类型（>90%的细胞蛋白）中普遍过度表达，而正常细胞可能占总蛋白的2%以下。此外，癌细胞的Hsp90与共伴侣存在于复合物中，而在正常细胞中，它主要以游离，未复合的状态存在2，3。近年来，几种Hsp90抑制剂在体外和体内研究中已被证明具有senolyticality作用，它们显着改善了小鼠的寿命4，5，6。上述所有发现都证实了这样一个事实，即Hsp90抑制剂可能对多种癌症类型有效，不良反应更少，产生耐药性的机会也更少。Hsp90的伴侣功能是通过在Hsp90的N端结构域结合ATP并将其水解成ADP和游离磷酸盐7来实现的。发现与Hsp90的ATP结合口袋竞争性结合的小分子成功地抑制了蛋白质的伴侣作用。迄今为止，这仍然是Hsp90抑制的最佳策略，这种抑制剂已达到临床试验的事实支持了这一策略8。其中之一Pimitespib于2022年6月在日本被批准用于治疗胃肠道间质瘤（GIST）9。这是自1994年建立伴侣的成药性以来第一个批准的Hsp90抑制剂10。

孔雀石绿测定是一种简单、灵敏、快速且廉价的无机磷酸盐检测程序，适用于针对其所需靶标11 对化合物进行自动化和高通量筛选 （HTS）。该测定已成功用于在小型实验室规模设置以及HTS12，13，14，15，16，17中筛选Hsp90抑制剂。该测定使用比色法测定由于Hsp90的ATP酶活性而形成的游离无机磷酸盐。这种定量的基础是在游离磷酸盐和钼之间形成磷钼酸盐复合物，随后与孔雀石绿反应产生绿色（图1）。这种快速的颜色形成是在分光光度计或读板器上测量的，在600-660nm18，19之间。

在本协议中，描述了用酵母Hsp90进行孔雀石绿测定以及随后鉴定针对伴侣的抑制剂的程序。首先建立Hsp90成药性的天然产物分子geldanamycin （GA）被视为真正的抑制剂10。由于有大量分子用于测试，HTS已成为当前药物发现计划的一个组成部分。由于迫切需要重新利用药物治疗Covid-19感染，该技术在过去2年中变得更加重要20，21。因此，提出了采用孔雀石绿测定法对酵母Hsp90蛋白的分子HTS的详细概述。

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Protocol

1. 实验室规模的孔雀石绿色测定

  1. 测定缓冲液的制备
    1. 按照 表1中所示的组合物和制备制备测定缓冲液。
  2. 磷酸盐标准品的制备
    1. 使用孔雀石绿色测定磷酸盐测定试剂盒（储存在4°C）中提供的1mM磷酸盐标准品。
    2. 将 40 μL 1 mM 磷酸盐标准品移入 960 μL 超纯水中，以获得 40 μM 磷酸盐溶液（预混溶液）。按照制造商的说明，将预混料溶液与超纯水一起添加，以形成0至40μM的磷酸盐系列稀释液。
  3. 酵母Hsp90的制备
    1. 使用甘油储备浓度为 0.66 mg/mL 的酵母 Hsp90。使用前在冰上解冻。
    2. 使用 8 μL（5.98 μg，0.80 μM）酵母 Hsp90 进行可测量的 ATP 酶活性。检查加入孔雀石绿试剂后的空白和阳性对照之间的光密度差是否至少为0.5且小于1.0。在这里，发现空白（没有Hsp90）和阳性对照（有Hsp90）之间的吸光度差异为0.510。
  4. 泛型丁胺的制备
    1. 将 1 mg ATP 转移到含有 453.39 μL 超纯水的小瓶中，以获得 4 mM 储备溶液。根据无水ATP（分子量[m.w.] = 551.14）进行重量计算。准备新鲜的ATP，因为它会随着时间的推移自发水解。
    2. 向每个孔中加入 4 μL ATP 储备溶液，使最终孔浓度为 0.2 mM（最终总测定孔体积为 80 μL）。使用多通道移液管将ATP作为反应的最后一个组分添加到反应中，以便所有反应同时开始。
  5. 凝胶霉素（GA）的制备
    1. 通过将 1 mg 溶解在 178.37 μL DMSO 中来制备 10 mM GA 储备液 （m.w. = 560.64）。使用储备溶液，通过连续稀释在DMSO中制备4 mM，0.8 mM，0.16 mM，0.032 mM，0.0064 mM和0.00128 mM溶液。
    2. 向每个孔中加入 2 μL 这些储备溶液，以获得分别为 0.1 mM、0.02 mM、0.004 mM、0.0008 mM、0.00016 mM 和 0.000032 mM 的最终孔浓度。
    3. 按照表 2 和 表3中的说明制备孔，孔中含有空白（缓冲液+水+ DMSO）和阴性对照（缓冲液中的Hsp90+水+ DMSO）。含有GA（缓冲液+水+GA中的Hsp90）的孔作为阳性对照。
  6. 孔板的制备和添加顺序
    1. 按照 表2所示的布局制备96孔板。对于在620nm处显示吸光度的化合物，准备一个单独的孔以记录该波长下的吸光度。不要为GA准备单独的孔，因为GA在620nm处不显示测定中使用的浓度的吸光度。
    2. 用每种成分的总体积制备每种成分，如 表3所示。
    3. 通过向每个孔中添加超纯水来设置测定孔。之后，加入所需量的测定缓冲液和复合溶液（例如GA溶液）。
    4. 然后，将Hsp90加入适当的孔中，并在室温下在平板振荡器上摇动板2分钟。
    5. 使用多通道移液器加入 4 μL ATP 溶液。用铝箔包裹板，并在室温下在摇板器（200rpm）上摇晃2分钟。将板在37°C孵育3小时。
  7. 孔雀石绿试剂的制备和添加
    1. 孔雀石绿试剂由试剂A（3M HCl中的钼酸铵）和B（孔雀石绿和聚乙烯醇）组成。使用前将试剂置于室温。以 100：1 的比例混合试剂 A 和 B（1，000 μL：10 μL）。在使用前3小时内准备，因为它不稳定并在3小时后开始分解。
    2. 步骤1.6.53小时后，使用多通道移液管加入20μL孔雀石绿试剂，以与ATP相同的顺序添加，停止反应。
    3. 在室温下孵育15分钟后，在读板器中测量板在620nm处的吸光度。

2. 孔雀石绿法高通量筛选Hsp90抑制剂

注意：高通量筛选方案类似于实验室规模的方法。每种情况下的最终孔体积为 80 μL。但是，试剂的添加顺序略有不同。在基于实验室规模的方法中，溶液添加分为五个阶段（34 μL 水、32 μL 缓冲液、2 μL DMSO 化合物、8 μL Hsp90，最后是 4 μL ATP 溶液）。相比之下，HTS 有三个添加阶段（40 μL 含有酵母 Hsp90 的缓冲溶液，2 μL DMSO 在 18 μL 含有化合物的水中，最后 20 μL 溶解在水中的 ATP）。在 HTS 设置中可准确移液的最小溶液量为 20 μL。 因此，观察到实验室秤和 HTS 秤之间的移液差异。

  1. 测定缓冲液的制备（pH 7.4）
    1. 在HTS中使用与实验室规模的孔雀石绿色测定相同的缓冲液（表1）。
  2. 酵母Hsp90的制备
    1. 使用甘油原液浓度为 0.66 mg/mL 的蛋白质。使用前在冰上解冻。
    2. 在每个孔中使用 8 μL （5.98 μg， 0.80 μM） 酵母 Hsp90，可提供可测量的 ATP 酶活性。
    3. 在每个孔的缓冲液（32μL）中稀释蛋白质（8μL）。每个孔的最终总工作体积为 40 μL，总测定体积为 80 μL。
  3. 0.8 mM ATP的制备
    1. 将 1 mg ATP 溶解在 2，267 μL 蒸馏水中以获得 0.8 mM 溶液。每个孔的总工作体积为 20 μL，总测定体积为 80 μL。
  4. 凝胶霉素（GA）/测试化合物的制备
    1. 在DMSO中制备0.8 mM的GA储备液，如步骤1.5所示。用 90 μL 水稀释 10 μL GA 储备液，得到 80 μM 的终浓度。
    2. 在适当的测定孔中使用 20 μL 的 80 μM GA 溶液（最终总测定孔体积 = 80 μL），最终孔浓度为 20 μM。这可以作为阳性对照。
    3. 对于测试化合物，根据所需的浓度在DMSO中制备溶液以进行评估。
    4. 在 90 μL 水中制备 10 μL DMSO，以添加到空白（缓冲液 + 水 + DMSO）和阴性对照孔（缓冲液 + 水 + DMSO 中的 Hsp90）中。以类似的方式在100μM最终孔浓度下制备测试化合物。
  5. 检测板的设计和添加顺序
    1. 使用四个主板、一个复合板和四个含有试剂储备的加成板来设置测定（图2 和 表4）。
    2. 此外，板A，在每个孔中加入90μL测定缓冲液;除板 B 外，在每个孔中加入 90 μL 含有 Hsp90 的缓冲液;除板C和D外，在每个孔中分别加入90μLATP和90μL孔雀石绿试剂（表5 和 表6）。
    3. 使用自动多通道分液系统，从添加板 A 和板 B 分别将 40 μL 溶液从每个孔转移到主板 1 和 2 以及 3 和 4。这里使用了Biomek（R） FXP 实验室自动化工作站（图2 和 表6）。
    4. 从复合板的每个孔中，将20μL溶液转移到主板1，2，3和4中（图2）。在摇床（200rpm）中摇动板1分钟。
    5. 从加法板C（ATP）的每个孔中，将20μL溶液转移到主板1，2，3和4中（图2）。在摇床（200rpm）中摇动板1分钟。
    6. 将板在37°C孵育3小时。
    7. 按照步骤1.7制备孔雀石绿试剂。3小时后，将20μL孔雀石绿试剂从加法板D转移到主板1，2，3和4的孔中（图2）。
    8. 在室温下孵育15分钟后，在读板器中测量板的吸光度为620nm。

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Representative Results

测定结果根据游离磷酸根离子浓度引起的吸光度来解释。由于酵母Hsp90在620nm处水解ATP引起的游离磷酸盐的吸光度被认为是100%ATP酶活性或零百分比蛋白质抑制。蛋白质的抑制导致ATP水解停止（游离磷酸盐减少）。这反映在620nm处的吸光度降低。

实验室规模的孔雀石绿色测定结果
磷酸盐标准品的标准图如图 3所示。Hsp90的活性是根据其将ATP水解为ADP和无机磷酸盐（Pi）的能力来衡量的。较高的游离磷酸盐浓度导致孔雀石绿复合物形成增加，这导致在 620 nm 处可检测到的强烈绿色（图 4）。

抑制百分比由以下公式计算：

% 抑制 Equation 1

Equation 2

Hsp90的吸光度被认为是零百分比抑制（100%ATP酶活性）。ATP酶活性百分比用于测量GA对蛋白质的剂量依赖性抑制。观察到GA以剂量依赖性方式抑制蛋白质，IC50 值为0.85μM（图5 和 表7）。

使用绘图软件的S形曲线方法来确定IC 50值（分子表现出50 %Hsp90 ATP酶活性的浓度）。

通过孔雀石绿测定对Hsp90抑制剂进行高通量筛选（HTS）的结果
以GA（20 μM最终孔浓度）为参考标准品，使用一式两份的测试化合物（代码3至96）进行高温超导。化合物在620nm处的吸光度未知，因此仅记录化合物的吸光度（主板1和2; 图6）。主板3和4的每个孔的吸光度值（用Hsp90; 图7）从板1和2（单独化合物）中的相应吸光度中扣除。Hsp90的吸光度被认为是100%的ATP酶活性。

使用以下公式计算抑制百分比：

% 抑制 Equation 3

Equation 4

20 μM GA浓度表现出75.82%的抑制作用。100 μM化合物82对酵母Hsp90蛋白的抑制率为100%，而化合物6和95在100μM处分别表现出73.07%和62.88%的抑制作用（表8）。其他化合物在100μM时抑制蛋白质不到50%，被认为是无活性的。

Figure 1
图1：孔雀石绿（MG）试剂的反应 。 （A）孔雀石绿的结构。（B）孔雀石绿试剂A（3M HCl中的钼酸铵）与Pi的反应，随后与试剂B（聚乙烯醇中的孔雀石绿）反应。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图 2：HTS 协议的实验方案。 该图描述了试剂从加成板添加到主测定板的顺序。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：标准磷酸盐浓度的标准图。X轴表示以微摩尔为单位的Pi浓度，在Y轴上描绘了620nm处的吸光度。误差线表示两个样本数之间的偏差 （n = 2）。请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4：加入孔雀石绿试剂后的颜色发展。 随着高磷酸盐浓度和更多的ATP酶活性，绿色变得更加强烈。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图 5：凝胶霉素与酵母 Hsp90 的 IC50 计算。 每个点是两个确定的平均值 （n = 2）。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图6：加入孔雀石绿试剂后显色。 （A）主板显色 1.A11孔中的粉红色是由于复合颜色。（二）主板显色 2.A11孔中的粉红色是由于化合物的有色性质。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 7
图 7：加入孔雀石绿试剂后的颜色发展。 加入孔雀石绿试剂后显色。（一）主板显色 3.（二）主板显色 4. 请点击此处查看此图的大图。

储备液 最终确认 稀释（最终/库存） 100毫升原液所需量（稀释×总体积）
1000 mM 三盐酸， pH 7.4 200 毫米 0.2 20毫升
1000 毫米氯化钾 40 毫米 0.04 4毫升
1000 毫米氯化镁2 12 毫米米 0.012 1.2毫升
超纯水 那 那 添加到 100 mL 总体积

表 1： 制备测定缓冲液。

#  1 2 3 4 5
一个 超纯水 超纯水 空白 空白
B 4 微米 PB 4 微米 PB 阴性对照 阴性对照
C 8 微米 PB 8 微米 PB GA（100 μM） + Hsp90 GA（100 μM） + Hsp90
D 12 微米 PB 12 微米 PB GA（20 μM） + Hsp90 GA（20 μM） + Hsp90
E 16 微米 PB 16 微米 PB GA（4 μM） + Hsp90 GA（4 μM） + Hsp90
F 24 微米 PB 24 微米 PB GA（0.8 μM） + Hsp90 GA（0.8 μM） + Hsp90
G 32 微米 PB 32 微米 PB GA（0.16 μM） + Hsp90 GA（0.16 μM） + Hsp90
H 40 微米 PB 40 微米 PB GA（0.032 μM） + Hsp90 GA（0.032 μM） + Hsp90
注意： 总孔体积为 80 μL。PB = 磷酸盐缓冲液标准品。

表 2： 96孔板的布局。

# 空白 阴性对照 酵母 HSP90 + GA
检测缓冲液 40 微升 32 微升 32 微升
二甲基亚胺 2 微升 2 微升 -
加语 - - 2 微升
HSP90 - 8 微升 8 微升
三氧化硫 （4毫米） 4 微升 4 微升 4 微升
超纯水 34 微升 34 微升 34 微升
总体积 80 微升 80 微升 80 微升

表 3： 每口井的成分。

车牌编号 解释
1 含有化合物的主板
2 含有化合物的主板（板1的副本）
3 带Hsp90和化合物的主板
4 带Hsp90和化合物的主板（与板3重复）
正中电 复合溶液
一个 缓冲液
B 含 Hsp90 的缓冲液
C 可供订货量分配条件解决方案
D 孔雀石绿试剂溶液
注意：所有板都是96孔透明的。主板：发生最终ATP酶反应的板。板 CP、A、B、C 和 D 是含有特定试剂的加成板。

表 4： HTS测定中使用的板类型。

# 1 2 3 4 正中电 一个 B C D
1：10 DMSO 的化合物/GA 溶液：水 20 微升 20 微升 20 微升 20 微升 90 微升 - - - -
HSP90溶液：缓冲溶液（1：4） - - 40 微升 40 微升 - - 90 微升 - -
缓冲液 40 微升 40 微升 - - - 90 微升 - - -
泛质性追加价（0.8毫米） 20 微升 20 微升 20 微升 20 微升 - - - 90 微升 -
孔雀石绿试剂 - - - - - - - - 90 微升
总体积 80 微升 80 微升 80 微升 80 微升 90 微升 90 微升 90 微升 90 微升 90 微升
注意： GA = 格尔达霉素。对于添加板 CP、A、B、C 和 D，额外服用 10 μL 以将溶液完美转移到主板。

表 5： HTS协议中每个孔的组成部分。

# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
一个 DMSO+W 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89
B 加语 10 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90
C 3 11 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91
D 4 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92
E 5 13 21 29 37 45 53 61 69 77 85 93
F 6 14 22 30 38 46 54 62 70 78 86 94
G 7 15 23 31 39 47 55 63 71 79 87 95
H 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
注意： 3-96是用于评估Hsp90抑制电位的化合物代码。GA = 格尔达霉素。W=超纯水

表 6： 孔板布局为主板 1 和 2（不带 Hsp90）以及 3 和 4（带 Hsp90）。

良好的成分 % ATP酶活性* % 抑制
HSP90 100 0.00
GA（100微米） 17.46 82.55
GA （20 μM） 17.77 82.23
GA（4微米） 18.27 81.73
GA （0.8 微米） 58.43 41.57
GA （0.16 μM） 91.38 8.62
GA （0.032 μM） 92.86 7.14
*两个独立测定的平均值

表 7： 凝胶霉素的百分比抑制和ATP酶活性。

良好的成分 腹肌 （A） 良好的成分 腹肌 （B） B-A % ATP酶活性* % 抑制
空白 0.281 阴性对照 0.663 0.383 100 0
GA （20 μM） 0.295 GA （20 μM）+Hsp90 0.388 0.093 24.18 75.82
化合物 6 （100 μM） 0.3 化合物 6 （100 μM） + Hsp90 0.403 0.103 26.93 73.07
化合物 82 （100 μM） 0.49 化合物 82 （100 μM） + Hsp90 0.462 -0.028 -7.32 107.32
化合物 95 （100 μM） 0.327 化合物 95 （100 μM） + Hsp90 0.469 0.142 37.12 62.88

表 8： 凝胶霉素和选定化合物的百分比抑制和ATP酶活性。

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Discussion

Hsp90是发现新型抗癌药物分子的重要靶标。自1994年建立成药性以来，已有10、18种分子进入临床试验。目前，有7种分子处于临床试验的不同阶段，或单独使用，或组合22。所有这些小分子都是N端ATP结合抑制剂。抑制伴侣的其他手段（C末端抑制剂，中域抑制剂）的进展不如N末端抑制剂快。因此，N端ATP结合抑制剂化合物仍然有望发展为临床上可销售的分子。此外，2022 年 6 月批准的唯一 Hsp90 抑制剂（在日本用于治疗 GIST 的匹米特斯匹布）是一种 N 末端 ATP 结合分子9。然而，迄今为止，单一分子在世界其他地区尚未达到上市阶段23，24。这种失败有几个主要原因，包括配方问题，除了毒性（如耳毒性）之外，生产分子的成本以及与少数化合物相关的心脏毒性。为了克服这些不良反应，目前正在探索Hsp90 N末端选择性抑制剂（α和β）25，26，27。上述所有讨论都证明了对化合物的HTS筛选，该化合物将通过与其ATP结合裂隙结合来抑制Hsp90活性。

用于发现药物的检测需要快速、经济高效、灵敏、易于重现，并且使用危害较小的化学品和/或条件。此外，它应该在实验室规模和 HTS 设置中方便地进行。对可用的Hsp90 ATPase抑制测定进行了详细分析，发现孔雀石绿磷酸盐测定是给定机构设置中最合适的。其他检测系统在HTS系统中对自动化不友好（丙酮酸/乳酸脱氢酶偶联酶）28，29;昂贵的荧光偏振测定30，闪烁邻近测定，表面等离子体共振测定和时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）28，29;耗时，如（TR-FRET）28，29;或具有辐射危害，如闪烁接近测定28，29。因此，本协议中提出了一个简单的孔雀石绿测定作为实验室规模或HTS，用于鉴定新型Hsp90 N末端ATP结合抑制剂。

该测定的主要问题是要用磷酸根离子评估的缓冲液和植物提取物的污染，这可能会导致错误的结果。ATP在反应pH值下的非酶水解也可能导致错误的结果。使用无磷酸盐缓冲液（pH 7.4）解决了上述问题。此外，用缓冲液+水+DMSO进行空白，然后从空白值中减去阳性对照/样品化合物的吸光度值。在该测定程序中需要遵循的预防措施是严格遵守试剂的添加，例如通过多通道移液器 同时 向每个孔中添加ATP。这样反应在每一孔中同时开始，孵育时间相同，此后在加入孔雀石绿试剂后以相同的吸光度测量。ATP酶反应具有高度的时间敏感性，因此反应起始和终止时间、孵育时间和记录吸光度时间的微小变化都会极大地影响测定结果。此外，加入 10 μL 34% 柠檬酸钠溶液（用于淬灭 ATP 酶反应）会影响标准曲线的线性，因此不包括在我们的测定方案中。

该测定的唯一限制是评估显示吸光度高于酵母Hsp90在620nm处从ATP释放的游离磷酸盐所显示的化合物。假阳性或假阴性可能导致此类化合物的情况。然而，遇到这种化合物的机会非常罕见。这对于评估植物提取物和/或其馏分时可能会出现问题，特别是在存在化合物混合物的情况下。

总之，酵母Hsp90成功地从实验室规模放大到HTS。实验室规模和HTS的逐步测定方案将帮助全球科学家采用该程序来发现新型Hsp90抑制剂。此外，该方案可能适用于发现针对其他ATP依赖性蛋白质的ATP酶抑制剂，如Hsp70，Grp94，Lon蛋白酶，蛋白酶Ti，AAA蛋白酶等31，32，33。

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Disclosures

没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项研究得到了韩国研究奖学金（KRF）计划的支持，该计划是韩国国家研究基金会（NRF）的博士后研究员，由科学与信息通信技术部（NRF-2019H1D3A1A01102952）资助。作者感谢KIST校内赠款和海洋和渔业部第2MRB130号赠款为该项目提供财政援助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1M Magnesium chloride solution in water Sigma-Aldrich 63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water Sigma-Aldrich 60142-100ml
96-well plate SPL Life Sciences Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation Beckman Coulter Not applicable
Compounds 3-96 Not applicable Not applicable Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder AK Scientific, Inc. V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit Sigma-Aldrich MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Synergy HT multi-plate reader Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 Sigma-Aldrich 93313-1L
Yeast Hsp90 Not applicable Not applicable School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829

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References

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空值，第 191 期，Hsp90，孔雀石绿，HTS，凝胶霉素
孔雀石绿测定法用于发现热休克蛋白 90 抑制剂
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Gupta, S. D., Song, D. G., Lee, S.,… More

Gupta, S. D., Song, D. G., Lee, S., Lee, J. W., Park, J. S., Prodromou, C., Pan, C. H. Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors. J. Vis. Exp. (191), e64693, doi:10.3791/64693 (2023).

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