Summary
Протокол анализа малахитового зеленого является простым и экономически эффективным методом обнаружения супрессоров белка теплового шока 90 (Hsp90), а также других соединений-ингибиторов против АТФ-зависимых ферментов.
Abstract
Белок теплового шока 90 (Hsp90) является многообещающей противоопухолевой мишенью из-за его сопровождающего действия на несколько онкогенных белков. Активность Hsp90 зависит от его способности гидролизовать аденозинтрифосфат (АТФ) до аденозиндифосфата (АДФ) и свободного фосфата. Активность АТФазы Hsp90 связана с ее сопровождающей функцией; АТФ связывается с N-концевым доменом Hsp90, и нарушение его связывания оказалось наиболее успешной стратегией подавления функции Hsp90. Активность АТФазы можно измерить с помощью колориметрического анализа малахитового зеленого, который определяет количество свободного фосфата, образующегося при гидролизе АТФ. Здесь описана процедура определения АТФазной активности дрожжей Hsp90 с использованием набора для анализа малахитового зеленого фосфата. Кроме того, приведены подробные инструкции по обнаружению ингибиторов Hsp90 путем приема гелданамицина в качестве аутентичного ингибитора. Наконец, обсуждается применение этого протокола анализа посредством высокопроизводительного скрининга (HTS) молекул ингибитора против дрожжей Hsp90.
Introduction
Белок теплового шока 90 (Hsp90) является молекулярным шапероном, который поддерживает стабильность белков, ответственных за развитие и прогрессирование рака. Кроме того, белки, ответственные за развитие резистентности к противоопухолевым средствам, также являются клиентами Hsp901. Hsp90 повсеместно экспрессируется во всех типах раковых клеток (>90% клеточных белков) по сравнению с нормальными клетками, где он может составлять менее 2% от общего количества белков. Более того, Hsp90 раковых клеток находится в комплексе с кошаперонами, тогда как в нормальной клетке он присутствует преимущественно в свободном, некомплексном состоянии 2,3. В последние годы было продемонстрировано, что несколько ингибиторов Hsp90 обладают сенолитическим действием в исследованиях in vitro и in vivo, где они значительно улучшили продолжительность жизни мышей 4,5,6. Все вышеупомянутые результаты подтверждают тот факт, что ингибиторы Hsp90 могут быть эффективными при нескольких типах рака, с меньшими побочными эффектами и сниженными шансами развития резистентности. Сопровождающая функция Hsp90 осуществляется путем связывания АТФ в N-концевом домене Hsp90 и гидролиза его в АДФ и свободный фосфат7. Было обнаружено, что небольшие молекулы, которые конкурентно связываются с АТФ-связывающим карманом Hsp90, успешно подавляют сопровождающий эффект белка. На сегодняшний день это остается лучшей стратегией ингибирования Hsp90, что подтверждается тем фактом, что такие ингибиторы дошли до клинических испытаний8. Один из них, Pimitespib, был одобрен в Японии для лечения гастроинтестинальной стромальной опухоли (GIST) в июне 2022года 9. Это первый ингибитор Hsp90, одобренный с тех пор, как в 1994 году была установлена лекарственная способность шаперона10.
Анализ малахитового зеленого представляет собой простую, чувствительную, быструю и недорогую процедуру обнаружения неорганического фосфата, подходящую для автоматизации и высокопроизводительного скрининга (HTS) соединений по желаемой цели11. Анализ был успешно использован для скрининга ингибиторов Hsp90 в небольших лабораторных установках, а также в HTS 12,13,14,15,16,17. В анализе используется колориметрический метод, который определяет свободный неорганический фосфат, образующийся из-за активности АТФазы Hsp90. Основой этого количественного определения является образование фосфомолибдатного комплекса между свободным фосфатом и молибденом, который впоследствии вступает в реакцию с малахитовым зеленым цветом с образованием зеленого цвета (рис. 1). Это быстрое формирование цвета измеряется на спектрофотометре или на планшетном считывателе в диапазоне 600-660 нм18,19.
В настоящем протоколе описана процедура проведения анализа малахитового зеленого с дрожжами Hsp90 и последующей идентификации ингибиторов против шаперона. Молекула натурального продукта, гелданамицин (GA), с помощью которой впервые была установлена лекарственная способность Hsp90, была принята в качестве подлинного ингибитора10. HTS стала неотъемлемой частью текущей программы открытия лекарств из-за наличия большого количества молекул для тестирования. Этот метод приобрел большее значение в последние 2 года из-за острой необходимости перепрофилирования лекарств для лечения инфекции Covid-1920,21. Таким образом, представлена подробная схема HTS молекул против белка дрожжей Hsp90 с использованием метода анализа малахитового зеленого.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Лабораторный анализ малахитового зеленого
- Приготовление пробирного буфера
- Подготовьте пробирный буфер в соответствии с составом и препаратом, представленными в таблице 1.
- Подготовка стандартов фосфатов
- Используйте стандарт фосфата 1 мМ, входящий в комплект для анализа фосфата малахитового зеленого (хранится при 4 ° C).
- Пипетка 40 мкл 1 мМ фосфатного стандарта в 960 мкл сверхчистой воды для получения 40 мкМ раствора фосфата (раствор премикса). Добавьте раствор премикса со сверхчистой водой в соответствии с инструкциями производителя для получения последовательного разбавления фосфата от 0 до 40 мкМ.
- Приготовление дрожжей Hsp90
- Используйте дрожжи Hsp90 с концентрацией глицерина 0,66 мг / мл. Разморозьте на льду непосредственно перед использованием.
- Используйте 8 мкл (5,98 мкг, 0,80 мкМ) дрожжей Hsp90 для измеримой активности АТФазы. Убедитесь, что разность оптической плотности после добавления малахитового зеленого реагента между заготовкой и положительным контролем составляет не менее 0,5 и менее 1,0. Здесь было обнаружено, что разница поглощения между холостым (без Hsp90) и положительным контролем (с Hsp90) составляет 0,510.
- Подготовка АТФ
- Переведите 1 мг АТФ во флакон, содержащий 453,39 мкл сверхчистой воды, чтобы получить 4 мМ исходного раствора. Выполните расчет веса на основе безводного АТФ (молекулярная масса [м.в.] = 551,14). Готовьте АТФ в свежем виде, так как со временем он может самопроизвольно гидролизоваться.
- Добавьте 4 мкл исходного раствора АТФ в каждую лунку, чтобы получить конечную концентрацию в лунке 0,2 мМ (конечный общий объем пробирной лунки 80 мкл). Добавьте АТФ в качестве последнего компонента в реакцию с помощью многоканальной пипетки, чтобы все реакции начинались одновременно.
- Приготовление гелданамицина (ГА)
- Приготовьте запас GA в 10 мМ, растворив 1 мг в 178,37 мкл ДМСО (мВт = 560,64). Используя исходный раствор, приготовьте раствор 4 мМ, 0,8 мМ, 0,16 мМ, 0,032 мМ, 0,0064 мМ и 0,00128 мМ в ДМСО путем последовательного разведения.
- Добавьте 2 мкл этих исходных растворов в каждую лунку для получения конечной концентрации в скважине 0,1 мМ, 0,02 мМ, 0,004 мМ, 0,0008 мМ, 0,00016 мМ и 0,000032 мМ соответственно.
- Подготовьте скважины, как описано в Таблице 2 и Таблице 3, при этом скважины содержат заготовку (буфер + вода + ДМСО) и отрицательный контроль (Hsp90 в буфере + вода + ДМСО). Скважины, содержащие GA (Hsp90 в буфере + вода + GA), служат положительным контролем.
- Подготовка колодезных плит и порядок добавления
- Подготовьте 96-луночные планшеты с макетом, представленным в таблице 2. Для соединений, которые показывают поглощение на длине волны 620 нм, подготовьте отдельную лунку для регистрации поглощения на этой длине волны. Не готовьте отдельную лунку для ГА, так как GA не показывает поглощения при 620 нм для концентрации, используемой в анализе.
- Подготовьте каждый компонент с общим объемом каждого компонента, как показано в таблице 3.
- Установите пробирные скважины, добавив в каждую скважину сверхчистую воду. После этого добавьте необходимое количество тестового буфера и составной раствор (например, раствор ГА).
- Затем добавьте Hsp90 в соответствующие лунки и встряхивайте пластины в течение 2 минут на шейкере при комнатной температуре.
- Добавьте 4 мкл раствора АТФ с помощью многоканальной пипетки. Заверните тарелку в алюминиевую фольгу и встряхивайте в течение 2 мин на шейкере (200 об/мин) при комнатной температуре. Инкубировать пластину при 37 °C в течение 3 ч.
- Приготовление и добавление малахитового зеленого реагента
- Реагент малахитового зеленого состоит из реагентов А (молибдат аммония в 3М HCl) и В (малахитовый зеленый и поливиниловый спирт). Перед использованием доведите реагент до комнатной температуры. Смешайте реагенты А и В в соотношении 100:1 (1 000 мкл: 10 мкл). Приготовьте его в течение 3 часов перед использованием, так как он нестабилен и начинает разлагаться через 3 часа.
- Через 3 ч этапа 1.6.5 остановите реакцию, добавив 20 мкл малахитового зеленого реагента, добавленного в том же порядке, что и АТФ, с помощью многоканальной пипетки.
- После 15-минутной инкубации при комнатной температуре измерьте поглощение пластины на длине волны 620 нм в планшетном считывателе.
2. Высокопроизводительный скрининг ингибиторов Hsp90 методом анализа малахитового зелени
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол высокопроизводительного скрининга аналогичен лабораторной методологии. Конечный объем лунки в каждом случае составляет 80 мкл. Однако есть небольшая разница в порядке добавления реагентов. В лабораторном методе существует пять стадий добавления раствора (34 мкл воды, 32 мкл буфера, 2 мкл соединения в ДМСО, 8 мкл Hsp90 и, наконец, 4 мкл раствора АТФ). Напротив, при ВТСП существует три стадии присоединения (40 мкл буферного раствора, содержащего дрожжи Hsp90, 2 мкл ДМСО в 18 мкл воды, содержащей соединения, и, наконец, 20 мкл АТФ, растворенного в воде). Минимальное количество раствора, которое можно точно пипетировать в установке HTS, составляет 20 мкл. Следовательно, наблюдается разница в пипетировании между лабораторными и HTS-весами.
- Приготовление пробирного буфера (рН 7,4)
- Используйте в HTS тот же буфер, что и для лабораторного анализа малахитового зеленого (таблица 1).
- Приготовление дрожжей Hsp90
- Используйте белок с концентрацией глицерина 0,66 мг / мл. Разморозьте на льду непосредственно перед использованием.
- Используйте 8 мкл (5,98 мкг, 0,80 мкМ) дрожжей Hsp90 в каждой лунке, что обеспечивает измеримую активность АТФазы.
- Разведите белок (8 мкл) в буфере (32 мкл) для каждой лунки. Окончательный общий рабочий объем для каждой скважины составляет 40 мкл при общем объеме анализа 80 мкл.
- Приготовление 0,8 мМ АТФ
- Растворите 1 мг АТФ в 2,267 мкл дистиллированной воды для получения раствора 0,8 мМ. Общий рабочий объем для каждой скважины составляет 20 мкл при общем объеме анализа 80 мкл.
- Приготовление гелданамицина (ГА)/тест-соединений
- Подготовьте 0,8 мМ запаса GA в ДМСО, как показано на шаге 1.5. Разбавьте 10 мкл сырья GA 90 мкл воды, чтобы получить конечную концентрацию 80 мкМ.
- Используйте 20 мкл раствора 80 мкМ GA в соответствующих пробирных скважинах (конечный общий объем пробирной лунки = 80 мкл), что дает конечную концентрацию в лунке 20 мкМ. Это служит позитивным контролем.
- Для исследуемых соединений приготовьте растворы в ДМСО в соответствии с их желаемой концентрацией для оценки.
- Подготовьте 10 мкл ДМСО в 90 мкл воды для добавления в пустые (буфер + вода + ДМСО) и отрицательные контрольные скважины (Hsp90 в буфере + вода + ДМСО). Подготовьте испытуемые соединения аналогичным образом при конечной концентрации в лунке 100 мкМ.
- Дизайн пробирных табличек и порядок добавления
- Для проведения анализа используйте четыре основные пластины, одну составную пластину и четыре дополнительные пластины, содержащие запасы реагентов (рис. 2 и таблица 4).
- Кроме того, на планшете А добавьте 90 мкл пробирного буфера в каждую лунку; в дополнение к планшету B добавьте 90 мкл буфера с Hsp90 в каждую лунку; в дополнение к планшетам C и D добавляют 90 мкл АТФ и 90 мкл малахитового зеленого реагента соответственно в каждую лунку (таблица 5 и таблица 6).
- Из добавочной пластины А и пластины В перенесите 40 мкл раствора из каждой лунки в основную пластину 1 и 2, а также 3 и 4 соответственно с помощью автоматизированной многоканальной системы дозирования. Здесь использовалась рабочая станция автоматизации лаборатории Biomek(R) FX P (рис. 2 и табл. 6).
- Из каждой лунки составной пластины перенесите 20 мкл раствора на основные пластины 1, 2, 3 и 4 (рис. 2). Встряхивайте тарелки в течение 1 минуты в шейкере (200 об/мин).
- Из каждой лунки добавочной пластины C (АТФ) передайте 20 мкл раствора на основные пластины 1, 2, 3 и 4 (рис. 2). Встряхивайте тарелки в течение 1 минуты в шейкере (200 об/мин).
- Выдерживают пластины в течение 3 ч при 37 °C.
- Приготовьте реагент малахитового зеленого цвета в соответствии с шагом 1.7. Через 3 ч переносят 20 мкл малахитового зеленого реагента из добавочной пластины D в лунки основных пластин 1, 2, 3 и 4 (рис. 2).
- После 15-минутной инкубации при комнатной температуре измерьте поглощение пластины при 620 нм в планшетном считывателе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты анализа интерпретируются с точки зрения поглощения из-за концентрации свободных фосфат-ионов. Поглощение свободным фосфатом в результате гидролиза АТФ дрожжами Hsp90 при 620 нм считается 100% активностью АТФазы или нулевым процентным ингибированием белка. Ингибирование белка приводит к прекращению гидролиза АТФ (меньше свободного фосфата). что отражается на снижении поглощения при 620 нм.
Результаты лабораторного анализа малахитового зеленого
Стандартный график для фосфатного стандарта изображен на рисунке 3. Активность Hsp90 измеряется с точки зрения его способности гидролизовать АТФ до АДФ и неорганического фосфата (Pi). Более высокая концентрация свободного фосфата приводит к увеличению образования комплекса с малахитовым зеленым, что вызывает интенсивный зеленый цвет, обнаруживаемый на длине волны 620 нм (рис. 4).
Процентное торможение рассчитывается по следующему уравнению:
% Ингибиция 
Абсорбция Hsp90 рассматривалась как нулевое процентное ингибирование (100% активность АТФазы). Процентная активность АТФазы используется для измерения дозозависимого ингибирования белка ГА. Было замечено, что GA ингибирует белок дозозависимым образом со значением IC50 0,85 мкМ (рис. 5 и таблица 7).
Для определения значения IC 50 (концентрация, при которой молекулы проявляют50 % активности АТФазы Hsp90) был использован подход сигмоидальной кривой графического программного обеспечения.
Результаты высокопроизводительного скрининга (HTS) ингибиторов Hsp90 методом анализа малахитового зеленого
HTS проводили с испытуемыми соединениями (коды от 3 до 96) в двух экземплярах, принимая GA (конечная концентрация в скважине 20 мкМ) в качестве эталонного стандарта. Поглощение соединений на длине волны 620 нм не было известно, и, следовательно, было зарегистрировано поглощение только соединений (основные пластины 1 и 2; Рисунок 6). Величина поглощения для каждой скважины основных плит 3 и 4 (с Hsp90; Рисунок 7) был вычтен из соответствующей поглощающей способности в пластинах 1 и 2 (только соединение). Поглощение Hsp90 рассматривалось как 100% активность АТФазы.
Процентное торможение рассчитывалось по следующей формуле:
% Ингибиция
Концентрация 20 мкМ ГА продемонстрировала ингибирование 75,82%. 100 мкМ соединения 82 показали 100% ингибирование дрожжевого белка Hsp90, тогда как соединения 6 и 95 проявляли ингибирование 73,07% и 62,88% соответственно при 100 мкМ (таблица 8). Другие соединения подавляли белок менее чем на 50% при 100 мкМ и считались неактивными.
Рисунок 1: Реакции реагента малахитового зеленого (MG). (A) Структура малахитового зеленого. (B) Реакции малахитового зеленого реагента A (молибдат аммония в 3 M HCl) с Pi и последующая реакция с реагентом B (малахитовый зеленый в поливиниловом спирте). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальная схема для протокола HTS. На рисунке изображен порядок добавления реагентов на основную пробирную пластину из добавочных пластин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Стандартный график стандартной концентрации фосфатов. Ось X представляет собой концентрацию Pi в микромолярах, а поглощение при 620 нм изображено на оси Y. Полосы погрешности представляют собой отклонение между двумя номерами выборки (n = 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Проявление цвета после добавления реагента малахитового зеленого. Зеленый цвет становится более интенсивным с высокой концентрацией фосфатов и большей активностью АТФазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Расчет IC50 для гелданамицина против дрожжей Hsp90. Каждая точка является средним из двух определений (n = 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Проявление цвета после добавления реагента малахитового зеленого . (A) Проявление цвета на основной пластине 1. Розовый цвет в колодце A11 обусловлен составным цветом. (B) Развитие цвета основной пластины 2. Розовый цвет в колодце A11 обусловлен цветной природой соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Проявление цвета после добавления реагента малахитового зеленого. Развитие цвета после добавления малахитового зеленого реагента. (A) Развитие цвета на основной пластине 3. (B) Развитие цвета на основной пластине 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Стоковое решение | Заключительный конц. | Разбавление (окончательное/исходное) | Количество, необходимое для 100 мл бульона (разбавление × общего объема) |
| 1000 мМ Tris-HCl, рН 7,4 | 200 мМ | 0.2 | 20 мл |
| 1000 мМ KCl | 40 мМ | 0.04 | 4 мл |
| 1000 мМ MgCl2 | 12 мМ | 0.012 | 1,2 мл |
| Сверхчистая вода | Н.А. | Н.А. | Добавьте к общему объему 100 мл |
Таблица 1: Приготовление пробирного буфера.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| A | Сверхчистая вода | Сверхчистая вода | Пустой | Пустой | |
| B | 4 мкМ ПБ | 4 мкМ ПБ | Отрицательный контроль | Отрицательный контроль | |
| C | 8 мкМ ПБ | 8 мкМ ПБ | GA (100 мкМ) + Hsp90 | GA (100 мкМ) + Hsp90 | |
| D | 12 мкМ ПБ | 12 мкМ ПБ | GA (20 мкМ) + Hsp90 | GA (20 мкМ) + Hsp90 | |
| E | 16 мкМ ПБ | 16 мкМ ПБ | GA (4 мкМ) + Hsp90 | GA (4 мкМ) + Hsp90 | |
| F | 24 мкМ ПБ | 24 мкМ ПБ | GA (0,8 мкМ) + Hsp90 | GA (0,8 мкМ) + Hsp90 | |
| G | 32 мкМ ПБ | 32 мкМ ПБ | GA (0,16 мкМ) + Hsp90 | GA (0,16 мкМ) + Hsp90 | |
| H | 40 мкМ ПБ | 40 мкМ ПБ | GA (0,032 мкМ) + Hsp90 | GA (0,032 мкМ) + Hsp90 | |
| Заметка: Общий объем лунки составляет 80 мкл. PB = стандарт фосфатного буфера. | |||||
Таблица 2: Макет 96-луночной плиты.
| # | Пустой | Отрицательный контроль | Дрожжи Hsp90 + GA |
| Пробирный буфер | 40 мкл | 32 мкл | 32 мкл |
| ДМСО | 2 мкл | 2 мкл | - |
| ГА | - | - | 2 мкл |
| ХСП90 | - | 8 мкл | 8 мкл |
| АТФ (4 мМ) | 4 мкл | 4 мкл | 4 мкл |
| Сверхчистая вода | 34 мкл | 34 мкл | 34 мкл |
| Общий объем | 80 мкл | 80 мкл | 80 мкл |
Таблица 3: Составляющая каждой скважины.
| Идентификатор номерного знака | Объяснение |
| 1 | Основная пластина, содержащая компаунд |
| 2 | Основная пластина, содержащая соединение (дубликат пластины 1) |
| 3 | Основная пластина с Hsp90 и компаундом |
| 4 | Основная пластина с Hsp90 и компаундом (дубликат пластины 3) |
| КП | Составной раствор |
| A | Буферный раствор |
| B | Буферный раствор с Hsp90 |
| C | Раствор АТФ |
| D | Раствор малахитового зеленого реагента |
| Примечание: Все пластины прозрачны на 96 лунок. Основная пластина: пластины, на которых происходит конечная реакция АТФазы. Пластины CP, A, B, C и D представляют собой дополнительные пластины, содержащие определенные реагенты. | |
Таблица 4: Типы планшетов, используемых в анализе HTS.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | КП | A | B | C | D | ||
| Раствор компаунд/ГА в 1:10 ДМСО:вода: вода | 20 мкл | 20 мкл | 20 мкл | 20 мкл | 90 мкл | - | - | - | - | ||
| Раствор Hsp90: буферный раствор (1:4) | - | - | 40 мкл | 40 мкл | - | - | 90 мкл | - | - | ||
| Буферный раствор | 40 мкл | 40 мкл | - | - | - | 90 мкл | - | - | - | ||
| АТФ (0,8 мМ) | 20 мкл | 20 мкл | 20 мкл | 20 мкл | - | - | - | 90 мкл | - | ||
| Малахитовый зеленый реагент | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 мкл | ||
| Общий объем | 80 мкл | 80 мкл | 80 мкл | 80 мкл | 90 мкл | 90 мкл | 90 мкл | 90 мкл | 90 мкл | ||
| Заметка: GA = гелданамицин. Для аддитивных пластин CP, A, B, C и D берется дополнительно 10 мкл для идеального переноса растворов на основные пластины. | |||||||||||
Таблица 5: Составляющая каждой скважины в протоколе HTS.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | ДМСО+Ж | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | ГА | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| Примечание: 3-96 являются составными кодами для оценки потенциала ингибирования Hsp90. GA = гелданамицин. W = сверхчистая вода | ||||||||||||
Таблица 6: Колодец выкладывают для основной плиты 1 и 2 (без Hsp90), а также 3 и 4 (с Hsp90).
| Составляющая скважины | % активности АТФазы* | % ингибирования |
| ХСП90 | 100 | 0.00 |
| GA (100 мкМ) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 мкМ) | 17.77 | 82.23 |
| GA (4 мкМ) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0,8 мкМ) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0,16 мкМ) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0,032 мкМ) | 92.86 | 7.14 |
| *Среднее значение двух независимых определений | ||
Таблица 7: Процентное ингибирование АТФазы и активность гелданамицина.
| Составляющая скважины | Пресс (А) | Составляющая скважины | Пресс (Б) | Б-А | % активности АТФазы* | % ингибирования |
| Пустой | 0.281 | Отрицательный контроль | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 мкМ) | 0.295 | GA (20 мкМ)+Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| Соединение 6 (100 мкМ) | 0.3 | Соединение 6 (100 мкМ) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| Соединение 82 (100 мкМ) | 0.49 | Соединение 82 (100 мкМ) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| Соединение 95 (100 мкМ) | 0.327 | Соединение 95 (100 мкМ) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
Таблица 8: Процентное ингибирование и активность АТФазы гельданамицина и отдельных соединений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hsp90 является важной мишенью для открытия новых противоопухолевых молекул лекарств. С тех пор, как в 1994 году была установлена его лекарственная пригодность,10 молекул достигли клинических испытаний. В настоящее время семь молекул находятся в различных фазах клинических испытаний, как по отдельности, так и в комбинации22. Все такие малые молекулы являются N-концевыми ингибиторами связывания АТФ. Другие средства ингибирования шаперона (С-концевые ингибиторы, ингибиторы среднего домена) действовали не так быстро, как N-концевые ингибиторы. Следовательно, N-концевые соединения-ингибиторы связывания АТФ по-прежнему обещают прогрессировать до клинически продаваемой молекулы. Кроме того, единственный ингибитор Hsp90, одобренный в июне 2022 года (Pimitespib для лечения GIST в Японии), представляет собой N-концевую АТФ-связывающую молекулу9. Однако ни одна молекула на сегодняшний день не достигла товарной стадии в других частях света23,24. Существует несколько основных причин этой неудачи, в том числе проблемы с рецептурой, стоимость производства молекул в дополнение к токсичности, такой как ототоксичность, и кардиотоксичность, связанная с несколькими соединениями. Чтобы преодолеть эти побочные эффекты, в настоящее время исследуются N-концевые селективные ингибиторы Hsp90 (альфа и бета)25,26,27. Все вышеупомянутые обсуждения требуют скрининга HTS соединений, которые будут подавлять активность Hsp90 путем связывания с его АТФ-связывающей щелью.
Анализы для открытия лекарств должны быть быстрыми, экономически эффективными, чувствительными, легко воспроизводимыми и использовать менее опасные химические вещества и / или условия. Кроме того, это должно быть удобно выполнено в лабораторных масштабах, а также в установке HTS. Был проведен подробный анализ доступных ингибирующих анализов АТФазы Hsp90, и анализ малахитового зеленого фосфата был признан наиболее подходящим среди всех в данной институциональной структуре. Другие системы анализа не были благоприятными для автоматизации в системе HTS (фермент, связанный пируват / лактатдегидрогеназа)28,29; дорогие, такие как анализ поляризации флуоресценции30, сцинтилляционные анализы близости, анализ поверхностного плазмонного резонанса и резонансный перенос энергии флуоресценции с временным разрешением (TR-FRET)28,29; трудоемкий (TR-FRET)28,29; или обладали радиационной опасностью, такой как сцинтилляционные анализы близости28,29. Таким образом, в этом протоколе представлен простой анализ малахитового зеленого в лабораторных масштабах или HTS для идентификации новых N-концевых ингибиторов связывания АТФ Hsp90.
Основной проблемой в этом анализе является загрязнение буферов и растительных экстрактов, подлежащих оценке, фосфат-ионами, что может привести к ложным результатам. Неферментативный гидролиз АТФ при рН реакции также может привести к ложным результатам. Вышеупомянутые проблемы были решены с помощью бесфосфатных буферов (рН 7,4). Кроме того, проводили заготовку с буфером + вода + ДМСО, а затем вычитали значение поглощения соединений положительного контроля/образца из пустого значения. Мерой предосторожности, которую необходимо соблюдать в этой процедуре анализа, является строгое соблюдение добавления реагентов, таких как добавление АТФ одновременно в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Это делается для того, чтобы реакция начиналась в одно и то же время в каждой лунке, в одно и то же время инкубации, а затем при одном и том же измерении поглощения после добавления реагента малахитового зеленого. Реакция АТФазы очень чувствительна ко времени, и, следовательно, небольшое изменение времени начала и окончания реакции, времени инкубации и времени регистрации поглощения может резко повлиять на результаты анализа. Кроме того, добавление 10 мкл 34% раствора цитрата натрия (используемого для гашения реакции АТФазы) влияет на линейность стандартной кривой и, следовательно, не было включено в наш протокол анализа.
Единственным ограничением этого анализа является оценка соединений, которые демонстрируют абсорбцию выше, чем у свободного фосфата, высвобождаемого из АТФ дрожжами Hsp90 при 620 нм. Ложноположительный или ложноотрицательный результат может привести к таким соединениям. Однако шансы столкнуться с такими соединениями очень редки. Это может быть проблематичным при оценке растительных экстрактов и/или их фракций, в частности, где присутствует смесь соединений.
В заключение, масштабирование от лабораторного масштаба до HTS было успешно проведено с дрожжами Hsp90. Протокол поэтапного анализа в лабораторных масштабах, а также в HTS поможет ученым во всем мире принять эту процедуру для открытия новых ингибиторов Hsp90. Кроме того, протокол может быть адаптирован для обнаружения ингибиторов АТФазы против других АТФ-зависимых белков, таких как Hsp70, Grp94, протеаза Lon, протеаза Ti, протеазы AAA и т. Д.31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано программой Korea Research Fellowship (KRF), постдокторантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемой Министерством науки и ИКТ (NRF-2019H1D3A1A01102952). Авторы выражают благодарность внутреннему гранту KIST и гранту Министерства океанов и рыболовства No 2MRB130 за оказание финансовой помощи для этого проекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M.
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L.
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
