Summary
マラカイトグリーンアッセイプロトコルは、ヒートショックタンパク質90(Hsp90)サプレッサー、およびATP依存性酵素に対する他の阻害剤化合物を発見するための簡単で費用効果の高い方法です。
Abstract
ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、複数の発癌性タンパク質に対するシャペロン効果があるため、有望な抗がん標的です。Hsp90の活性は、アデノシン三リン酸(ATP)をアデノシン二リン酸(ADP)および遊離リン酸に加水分解する能力に依存します。Hsp90のATPアーゼ活性は、そのシャペロン機能に関連しています。ATPはHsp90のN末端ドメインに結合し、その結合を破壊することがHsp90の機能を抑制する上で最も成功した戦略であることがわかった。ATPアーゼ活性は、ATP加水分解によって形成される遊離リン酸の量を決定する比色マラカイトグリーンアッセイによって測定することができる。ここでは、マラカイトグリーンリン酸測定キットを用いて酵母Hsp90のATPase活性を測定する手順について説明する。さらに、ゲルダナマイシンを真正な阻害剤として服用することによるHsp90阻害剤の発見のための詳細な指示書が提供される。最後に、酵母Hsp90に対する阻害剤分子のハイスループットスクリーニング(HTS)を介したこのアッセイプロトコルの適用について説明します。
Introduction
ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、癌の発症と進行に関与するタンパク質の安定性を維持する分子シャペロンです。さらに、抗悪性腫瘍剤に対する耐性の発達に関与するタンパク質もHsp901のクライアントである。Hsp90は、全タンパク質の2%未満を占める可能性のある正常細胞と比較して、すべての癌細胞タイプ(細胞タンパク質の>90%)に遍在的に過剰発現しています。さらに、がん細胞のHsp90はコシャペロンとの複合体に存在しますが、正常細胞では、主に遊離で複合体のない状態で存在します2,3。近年、いくつかのHsp90阻害剤が、インビトロおよびインビボ研究において老化細胞除去効果を有することが実証されており、マウスの寿命を有意に改善している4,5,6。前述のすべての発見は、Hsp90阻害剤が複数の種類の癌に有効であり、副作用が少なく、耐性を発症する可能性が低いという事実を実証しています。Hsp90のシャペロン機能は、Hsp90のN末端ドメインにATPを結合し、それをADPと遊離リン酸に加水分解することによって達成されます7。Hsp90のATP結合ポケットに競合的に結合する低分子は、タンパク質のシャペロン化効果を抑制することに成功した。今日まで、これはHsp90阻害のための最良の戦略であり、そのような阻害剤が臨床試験に達したという事実によって裏付けられています8。そのうちの1つであるピミテスピブは、2022年6月に消化管間質腫瘍(GIST)の治療薬として日本で承認されました9。これは、シャペロンの創薬性が1994年に確立されて以来、承認された最初のHsp90阻害剤です10。
マラカイトグリーンアッセイは、無機リン酸塩を検出するためのシンプルで高感度、高速かつ安価な手順であり、目的のターゲットに対する化合物の自動化およびハイスループットスクリーニング(HTS)に適しています11。このアッセイは、小規模なラボスケールのセットアップやHTS 12、13、14、15、16、17でのHsp90阻害剤のスクリーニングに成功しています。このアッセイは、Hsp90のATPアーゼ活性により形成される遊離無機リン酸を測定する比色法を使用します。この定量の基礎は、遊離リン酸とモリブデンの間にリンモリブデン酸錯体が形成され、その後マラカイトグリーンと反応して緑色を生成することです(図1)。この急速な発色は、分光光度計またはプレートリーダー上で、600〜660nmの間で測定される18,19。
本プロトコールでは、酵母Hsp90を用いたマラカイトグリーンアッセイを実施する手順およびその後のシャペロンに対する阻害剤の同定が記載されている。Hsp90の創薬性が最初に確立された天然物分子であるゲルダナマイシン(GA)は、本物の阻害剤として摂取されました10。HTSは、テスト用の多数の分子が利用可能であるため、現在の創薬プログラムの不可欠な部分になっています。この技術は、Covid-19感染症を治療するための薬物の転用が緊急に必要であるため、過去2年間でより重要性を増しています20,21。そこで、マラカイトグリーンアッセイ法を採用した酵母Hsp90タンパク質に対するHTSの分子について詳細な概要が提示される。
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Protocol
1.ラボスケールのマラカイトグリーンアッセイ
- アッセイバッファーの調製
- アッセイバッファーを調製し、 表1に示す組成および調製物に従って調製する。
- リン酸塩標準物質の作成
- マラカイトグリーンアッセイリン酸塩アッセイキットで提供される1 mMリン酸標準を使用してください(4°Cで保存)。
- 960 μLの超純水に1 mMリン酸標準物質40 μLをピペットで入れ、40 μMリン酸溶液(プレミックス溶液)を得た。製造元の指示に従って、プレミックス溶液を超純水を加えて、0〜40μMのリン酸塩の段階希釈を形成します。
- 酵母Hsp90の調製
- グリセロールストック濃度が0.66 mg / mLの酵母Hsp90を使用してください。使用直前に氷上で解凍してください。
- 測定可能なATPアーゼ活性を得るには、8 μL(5.98 μg、0.80 μM)の酵母Hsp90を使用してください。ブランクとポジティブコントロールの間のマラカイトグリーン試薬添加後の光学濃度差が0.5以上1.0未満であることを確認してください。ここで、ブランク(Hsp90なし)とポジティブコントロール(Hsp90あり)の吸光度差は0.510であることがわかった。
- ATPの準備
- 453.39 μLの超純水を含むバイアルに1 mgのATPを移し、4 mMのストック溶液を得た。無水ATPに基づいて重量計算を実行します(分子量[m.w.] = 551.14)。ATPは時間の経過とともに自然に加水分解する可能性があるため、新鮮に準備します。
- 各ウェルに4 μLのATPストック溶液を加え、最終ウェル濃度0.2 mM(最終総アッセイウェル容量80 μL)を得た。マルチチャンネルピペットを使用して、反応の最後の成分としてATPを追加し、すべての反応が同時に開始されるようにします。
- ゲルダナマイシン(GA)の調製
- 1 mgを178.37 μLのDMSOに溶解して、10 mMのGAストックを調製します(m.w. = 560.64)。ストック溶液を使用して、連続希釈によりDMSO中の4 mM、0.8 mM、0.16 mM、0.032 mM、0.0064 mM、および0.00128 mM溶液を調製します。
- これらのストック溶液を各ウェルに2 μL添加し、それぞれ0.1 mM、0.02 mM、0.004 mM、0.0008 mM、0.00016 mM、および0.000032 mMの最終ウェル濃度を得ます。
- 表 2 および 表3に記載のようにウェルを準備し、ブランク(緩衝液+水+DMSO)および陰性対照(Hsp90緩衝液+水+DMSO)を含むウェルを調製する。GA(緩衝液+水+GA中のHsp90)を含むウェルは、ポジティブコントロールとして機能します。
- ウェルプレートの調製と添加順序
- 表2に示すレイアウトで96ウェルプレートを準備します。620nmで吸光度を示す化合物については、この波長の吸光度を記録するための別のウェルを調製する。GAはアッセイで使用された濃度に対して620 nmの吸光度を示さないため、GA用に別のウェルを調製しないでください。
- 表3に示すように、各成分の総体積で各成分を準備します。
- 各ウェルに超純水を添加してアッセイウェルを設置します。これに続いて、必要量のアッセイバッファーと化合物溶液(GA溶液など)を追加します。
- 次に、Hsp90を適切なウェルに加え、プレートシェーカーで室温で2分間プレートを振とうします。
- マルチチャンネルピペットを使用して4 μLのATP溶液を追加します。プレートをアルミホイルで包み、プレートシェーカー(200 rpm)で室温で2分間振とうします。プレートを37°Cで3時間インキュベートします。
- マラカイトグリーン試薬の調製と添加
- マラカイトグリーン試薬は、試薬A(3M HCl中のモリブデン酸アンモニウム)およびB(マラカイトグリーンおよびポリビニルアルコール)からなる。使用前に試薬を室温に戻してください。試薬AとBを100:1の比率(1,000 μL:10 μL)で混合します。不安定で3時間後に分解が始まるため、使用前3時間以内に準備してください。
- ステップ1.6.5の3時間後、マルチチャンネルピペットを使用して、ATPと同じ順序で添加した20 μLのマラカイトグリーン試薬を加えて反応を停止します。
- 室温で15分間インキュベートした後、プレートリーダーで620 nmにおけるプレートの吸光度を測定します。
2. マラカイトグリーンアッセイによるHsp90阻害剤のハイスループットスクリーニング
注:ハイスループットスクリーニングのプロトコルは、ラボスケールの方法論に似ています。いずれの場合も最終的なウェル容量は80μLです。ただし、試薬の添加順序には若干の違いがあります。ラボスケールベースの方法では、溶液添加の5段階があります(34 μLの水、32 μLのバッファー、2 μLのDMSO溶液中の化合物、8 μLのHsp90、そして最後に4 μLのATP溶液)。対照的に、HTSでは、3段階の添加があります(酵母Hsp90を含む緩衝液40 μL、化合物を含む18 μLの水に2 μLのDMSO、最後に水に溶解した20 μLのATP)。HTSセットアップで正確にピペッティングできる溶液の最小量は20μLです。 したがって、ラボスケールとHTSスケールの間でピペッティングの違いが観察されます。
- アッセイバッファー(pH 7.4)の調製
- HTSでは、ラボスケールのマラカイトグリーンアッセイと同じバッファーを使用します(表1)。
- 酵母Hsp90の調製
- グリセロールストック濃度が0.66 mg / mLのタンパク質を使用してください。.使用直前に氷上で解凍してください。
- 測定可能なATPアーゼ活性を提供する酵母Hsp90を各ウェルに8 μL(5.98 μg、0.80 μM)使用します。
- 各ウェルのバッファー(32 μL)でタンパク質(8 μL)を希釈します。各ウェルの最終的な総作業量は、総アッセイ容量80 μLで40 μLです。
- 0.8 mM ATPの調製
- 1 mgのATPを2,267 μLの蒸留水に溶解し、0.8 mMの溶液を得る。各ウェルの総作業量は、80 μLの総アッセイ容量で20 μLです。
- ゲルダナマイシン(GA)/試験化合物の調製
- ステップ1.5のように、DMSOで0.8 mMのGAストックを準備します。GAストック10 μLを90 μLの水で希釈し、最終濃度80 μMにします。
- 20 μLの80 μM GA溶液を適切なアッセイウェル(最終総アッセイウェル容量=80 μL)で使用し、最終ウェル濃度を20 μMにします。これはポジティブコントロールとして機能します。
- 試験化合物については、評価に必要な濃度に従ってDMSO溶液を準備します。
- ブランク(バッファー+水+DMSO)およびネガティブコントロールウェル(Hsp90バッファー+水+DMSO)に添加するために、90 μLの水中に10 μLのDMSOを調製します。同様の方法で、100 μMの最終ウェル濃度で試験化合物を調製します。
- アッセイプレートの設計と添加順序
- 4つのメインプレート、1つのコンパウンドプレート、および試薬ストックを含む4つの添加プレートを使用してアッセイをセットアップします(図2 および 表4)。
- さらに、プレートAに、各ウェルに90 μLのアッセイバッファーを加える;プレートBを加えて、各ウェルにHsp90を含む90 μLのバッファーを追加します。プレートCおよびDを添加し、各ウェルにそれぞれ90μLのATPおよび90μLのマラカイトグリーン試薬を添加する(表5 および 表6)。
- 添加プレートAとプレートBから、自動マルチチャンネル分注システムを使用して、各ウェルからそれぞれメインプレート1と2、および3と4に40 μLの溶液を移します。ここでは、Biomek(R) FXP ラボラトリーオートメーションワークステーションを使用しました(図2 および 表6)。
- コンパウンドプレートの各ウェルから、20 μLの溶液をメインプレート1、2、3、および4に移します(図2)。プレートをシェーカー(200 rpm)で1分間振とうします。
- 添加プレートC(ATP)の各ウェルから、20 μLの溶液をメインプレート1、2、3、および4に移します(図2)。プレートをシェーカー(200 rpm)で1分間振とうします。
- プレートを37°Cで3時間インキュベートします。
- ステップ1.7に従ってマラカイトグリーン試薬を準備します。3時間後、20 μLのマラカイトグリーン試薬を追加プレートDからメインプレート1、2、3、4のウェルに移します(図2)。
- 室温で15分間インキュベートした後、プレートリーダーで620nmであるプレートの吸光度を測定する。
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Representative Results
アッセイの結果は、遊離リン酸イオン濃度による吸光度の観点から解釈される。620 nmでの酵母Hsp90によるATP加水分解による遊離リン酸による吸光度は、100%ATPase活性、またはゼロパーセントタンパク質阻害と見なされます。タンパク質の阻害はATP加水分解の停止をもたらす(遊離リン酸が少ない)。これは、620nmでの吸光度の低下という点で反映されます。
ラボスケールのマラカイトグリーンアッセイの結果
リン酸塩標準の標準グラフを 図3に示します。Hsp90の活性は、ATPをADPおよび無機リン酸(Pi)に加水分解する能力の観点から測定されます。遊離リン酸濃度が高くなると、マラカイトグリーンとの複合体形成が増加し、620 nmで検出可能な強い緑色になります(図4)。
阻害率は、次の式で計算されます。
%阻害 
Hsp90の吸光度はゼロパーセント阻害(100%ATPase活性)と考えられた。ATPase活性の百分率は、GAによるタンパク質の用量依存的阻害を測定するために使用される。GAは用量依存的にタンパク質を阻害し、IC50 値は0.85μMであることが観察されました(図5 および 表7)。
グラフ作成ソフトウェアのシグモイド曲線アプローチを利用して、IC50 値(分子がHsp90 ATPase活性の50%を示す濃度)を決定しました。
マラカイトグリーンアッセイによるHsp90阻害剤のハイスループットスクリーニング(HTS)の結果
HTSは、GA(20 μM最終ウェル濃度)を参照標準として使用して、テスト化合物(コード3〜96)を複製して実施しました。化合物の620 nmでの吸光度は不明であったため、化合物のみの吸光度が記録されました(メインプレート1および2; 図6)。メインプレート3及び4の各ウェルの吸光度値(Hsp90; 図7)プレート1および2(化合物単独)における対応する吸光度から差し引いた。Hsp90の吸光度を100%ATPase活性とした。
阻害率は、以下の式を用いて計算した:
%阻害
20 μM GA濃度は75.82%の阻害を示しました。化合物82の100 μMは酵母Hsp90タンパク質の100%阻害を示したのに対し、化合物6および95は100 μMでそれぞれ73.07%および62.88%の阻害を示した(表8)。他の化合物は、100 μMでタンパク質を50%未満抑制し、不活性であると考えられました。
図1:マラカイトグリーン(MG)試薬の反応 。 (A)マラカイトグリーンの構造。(B)マラカイトグリーン試薬A(3 M HCl中のモリブデン酸アンモニウム)とPiとの反応、およびその後の試薬B(ポリビニルアルコール中のマラカイトグリーン)との反応。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:HTSプロトコルの実験スキーム。 図は、添加プレートからメインアッセイプレートへの試薬の添加順序を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:標準リン酸塩濃度の標準プロット。 X軸はPi濃度をマイクロモルで表し、620nmの吸光度はY軸に表しています。エラーバーは、2つのサンプル番号間の偏差を表します(n = 2)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マラカイトグリーン試薬添加後の発色。 緑色は、高いリン酸塩濃度およびより多くのATPアーゼ活性と共により強くなる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:酵母Hsp90に対するゲルダナマイシンのIC50 計算。 各点は、2つの決定の平均です(n = 2)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マラカイトグリーン試薬添加後の発色 。 (A)メインプレート1の発色。A11ウェルのピンク色は複合色によるものです。(B)メインプレート2の発色。A11ウェルのピンク色は、化合物の着色された性質によるものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:マラカイトグリーン試薬添加後の発色。 マラカイトグリーン試薬添加後の発色。(A)メインプレートの発色 3.(B)メインプレートの発色 4. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ストックソリューション | 最終コンク | 希釈(最終/ストック) | 100mlストックに必要な量(希釈×全量) |
| 1000 mM トリス塩酸塩、pH 7.4 | 200ミリメートル | 0.2 | 20ミリリットル |
| 1000 ミリリットル KCl | 40ミリメートル | 0.04 | 4ミリリットル |
| 1000 mM マグネシウムCl2 | 12ミリメートル | 0.012 | 1.2ミリリットル |
| 超純水 | 該当なし | 該当なし | 総容量100 mLに追加 |
表 1: アッセイバッファーの調製。
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| ある | 超純水 | 超純水 | 空砲 | 空砲 | |
| B | 4 μM PB | 4 μM PB | ネガティブコントロール | ネガティブコントロール | |
| C | 8 μM PB | 8 μM PB | GA(100 μM) + Hsp90 | GA(100 μM) + Hsp90 | |
| D | 12 μM PB | 12 μM PB | GA(20 μM) + Hsp90 | GA(20 μM) + Hsp90 | |
| E | 16 μM PB | 16 μM PB | GA(4 μM) + Hsp90 | GA(4 μM) + Hsp90 | |
| F | 24 μM PB | 24 μM PB | GA(0.8 μM) + Hsp90 | GA(0.8 μM) + Hsp90 | |
| G | 32 μM PB | 32 μM PB | GA(0.16 μM) + Hsp90 | GA(0.16 μM) + Hsp90 | |
| H | 40 μM PB | 40 μM PB | GA(0.032 μM) + Hsp90 | GA(0.032 μM) + Hsp90 | |
| 手記： 総ウェル容量は80μLです。PB = リン酸緩衝液標準。 | |||||
表 2: 96ウェルプレートのレイアウト。
| # | 空砲 | ネガティブコントロール | 酵母Hsp90 + GA |
| アッセイバッファー | 40 μL | 32 μL | 32 μL |
| ティッカー | 2 μL | 2 μL | - |
| ジョージア 州 | - | - | 2 μL |
| Hsp90 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mM) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| 超純水 | 34 μL | 34 μL | 34 μL |
| 総量 | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
表 3: 各ウェルの構成要素。
| プレート ID | 説明 |
| 1 | コンパウンド含有メインプレート |
| 2 | コンパウンド含有メインプレート(プレート1の複製) |
| 3 | Hsp90とコンパウンドを備えたメインプレート |
| 4 | Hsp90とコンパウンドを含むメインプレート(プレート3の複製) |
| ティッカー | 複合溶液 |
| ある | 緩衝液 |
| B | Hsp90を含む緩衝液 |
| C | ATP ソリューション |
| D | マラカイトグリーン試薬溶液 |
| 注:すべてのプレートは96ウェル透明です。メインプレート:最終的なATPアーゼ反応が起こるプレート。プレートCP、A、B、C、およびDは、特定の試薬を含む添加プレートです。 | |
表 4: HTSアッセイで使用されるプレートの種類。
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | ティッカー | ある | B | C | D | ||
| 1:10 DMSO:水中の化合物/GA溶液 | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 90 μL | - | - | - | - | ||
| Hsp90溶液:緩衝液(1:4) | - | - | 40 μL | 40 μL | - | - | 90 μL | - | - | ||
| 緩衝液 | 40 μL | 40 μL | - | - | - | 90 μL | - | - | - | ||
| ATP (0.8 ミリリットル) | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | - | - | - | 90 μL | - | ||
| マラカイトグリーン試薬 | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 μL | ||
| 総量 | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | ||
| 手記： GA =ゲルダナマイシン。添加プレートCP、A、B、C、Dの場合、溶液をメインプレートに完全に移すために、さらに10μLが使用されます。 | |||||||||||
表 5: HTSプロトコルにおける各ウェルの構成成分。
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ある | DMSO+W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | ジョージア 州 | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| 注: 3-96はHsp90阻害電位を評価するための化合物コードである。GA =ゲルダナマイシン。W=超純水 | ||||||||||||
表 6: ウェルプレートは、メインプレート1と2(Hsp90なし)、および3と4(Hsp90あり)に配置されます。
| 井戸構成員 | %ATPアーゼ活性* | %阻害 |
| Hsp90 | 100 | 0.00 |
| GA(100 μM) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 μM) | 17.77 | 82.23 |
| GA(4 μM) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0.8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0.16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0.032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| *2つの独立した決定の平均 | ||
表 7: ゲルダナマイシンの阻害率およびATPアーゼ活性。
| 井戸構成員 | 腹筋(A) | 井戸構成員 | 腹筋(B) | B-A | %ATPアーゼ活性* | %阻害 |
| 空砲 | 0.281 | ネガティブコントロール | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 μM) | 0.295 | GA (20 μM)+Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| 化合物6 (100 μM) | 0.3 | 化合物6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| 化合物82 (100 μM) | 0.49 | 化合物82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| 化合物95 (100 μM) | 0.327 | 化合物95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
表 8: ゲルダナマイシンおよび選択された化合物の阻害率およびATPase活性。
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Discussion
Hsp90は、新規抗がん剤分子の発見のための重要な標的である。1994年に創薬性が確立されて以来、10、18分子が臨床試験に達しています。現在、7つの分子が単独で、または組み合わせて、臨床試験のさまざまな段階にあります22。このような小分子はすべてN末端ATP結合阻害剤である。シャペロンを阻害する他の手段(C末端阻害剤、ミドルドメイン阻害剤)は、N末端阻害剤ほど速くは進んでいない。したがって、N末端ATP結合阻害剤化合物は、臨床的に市場性のある分子への進行を依然として有望である。さらに、2022年6月に承認された唯一のHsp90阻害剤(日本におけるGIST治療薬ピミテスピブ)は、N末端ATP結合分子9です。しかしながら、単一分子は、今日まで、世界の他の地域では市場性のある段階に達していない23,24。この失敗には、製剤の問題、耳毒性などの毒性に加えて分子を製造するコスト、少数の化合物に関連する心毒性など、いくつかの主な理由があります。これらの有害作用を克服するために、Hsp90 N末端選択的阻害剤(アルファおよびベータ)が現在探索されている25,26,27。前述のすべての議論は、そのATP結合クレフトに結合することによってHsp90活性を抑制する化合物のHTSスクリーニングを保証する。
薬物を発見するためのアッセイは、迅速で費用対効果が高く、感度が高く、再現性が高く、危険性の低い化学物質や条件を利用する必要があります。さらに、ラボ規模でもHTSセットアップでも便利に実行する必要があります。利用可能なHsp90 ATPase阻害アッセイの詳細な分析が行われ、マラカイトグリーンリン酸アッセイが、与えられた施設設定の中で最も適していることがわかりました。他のアッセイシステムは、HTSシステム(ピルビン酸/乳酸デヒドロゲナーゼ結合酵素)では自動化に適していませんでした28,29;蛍光偏光アッセイ30、シンチレーション近接アッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、および時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)のように高価である28,29;(TR-FRET)28,29のように時間がかかります。またはシンチレーション近接アッセイ28,29のような放射線ハザードを所有していました。したがって、新規Hsp90 N末端ATP結合阻害剤の同定のためのラボスケールまたはHTSとしての単純なマラカイトグリーンアッセイがこのプロトコルに提示されています。
このアッセイの主な懸念は、リン酸イオンで評価されるバッファーと植物抽出物の汚染であり、誤った結果につながる可能性があります。反応pHでのATPの非酵素的加水分解もまた、誤った結果をもたらす可能性がある。前述の問題は、リン酸塩を含まない緩衝液(pH 7.4)を用いることで解決した。さらに、バッファー+水+DMSOを用いてブランクを行い、その後、ブランク値からポジティブコントロール/サンプル化合物の吸光度値を差し引いた。このアッセイ手順で従う必要のある予防措置は、マルチチャンネルピペット を介して 各ウェルにATPを同時に添加するなど、試薬の添加を厳守することです。これは、マラカイトグリーン試薬を添加した後、同じ吸光度の測定で、同じインキュベーション時間で、毎ウェルで同時に反応を開始するようにするためである。ATPase反応は非常に時間に敏感であるため、反応の開始時間と終了時間、インキュベーション時間、および吸光度を記録する時間のわずかな変化がアッセイ結果に大きな影響を与える可能性があります。さらに、10 μLの34%クエン酸ナトリウム溶液(ATPase反応のクエンチに使用)の添加は、標準曲線の直線性に影響を与えるため、アッセイプロトコルには含まれていませんでした。
このアッセイの唯一の制限は、620nmで酵母Hsp90によってATPから放出された遊離リン酸によって示されるよりも高い吸光度を示す化合物の評価である。偽陽性または偽陰性は、そのような化合物の場合には生じ得る。ただし、そのような化合物に遭遇する可能性は非常にまれです。これは、特に化合物の混合物が存在する植物抽出物および/またはその画分の評価で問題になる可能性があります。
結論として、ラボスケールからHTSへのスケールアップは、酵母Hsp90で成功裏に実施されました。ラボスケールおよびHTSでのステップワイズアッセイプロトコルは、世界中の科学者が新しいHsp90阻害剤の発見にこの手順を採用するのに役立ちます。さらに、このプロトコルは、Hsp70、Grp94、Ronプロテアーゼ、プロテアーゼTi、AAAプロテアーゼなどの他のATP依存性タンパク質に対するATPase阻害剤の発見に適合され得る31、32、33。
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Disclosures
競合する金銭的利益はありません。
Acknowledgments
この研究は、科学情報通信部(NRF-2019H1D3A1A01102952)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)のポスドクフェローである韓国研究フェローシップ(KRF)プログラムの支援を受けました。著者らは、KISTの壁内助成金と海洋水産省の助成金番号2MRB130に、このプロジェクトに財政支援を提供してくれたことに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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