Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

בדיקת מלכיט ירוק לגילוי מעכבי חלבון הלם חום 90

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64693
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology (KIST), 2School of Life Sciences, University of Sussex

Summary

פרוטוקול הבדיקה הירוק של מלכיט הוא שיטה פשוטה וחסכונית לגילוי מדכאי חלבון הלם חום 90 (Hsp90), כמו גם תרכובות מעכבות אחרות נגד אנזימים תלויי ATP.

Abstract

חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא מטרה אנטי-סרטנית מבטיחה בגלל השפעתו הנלווית על חלבונים אונקוגניים מרובים. הפעילות של Hsp90 תלויה ביכולתו לבצע הידרוליזה של אדנוזין טריפוספט (ATP) לאדנוזין דיפוספט (ADP) ולפוספט חופשי. פעילות ATPase של Hsp90 קשורה לפונקציית הליווי שלו; ATP נקשר לתחום N-terminal של Hsp90, ושיבוש הקשירה שלו נמצא כאסטרטגיה המוצלחת ביותר בדיכוי פונקציית Hsp90. ניתן למדוד את פעילות ה-ATPase על ידי בדיקת מלכיט ירוק קולורימטרי, הקובעת את כמות הפוספט החופשי שנוצר על ידי הידרוליזה של ATP. כאן מתואר הליך לקביעת פעילות ATPase של שמרים Hsp90 באמצעות ערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיט. יתר על כן, הוראות מפורטות לגילוי מעכבי Hsp90 על ידי נטילת geldanamycin כמעכב אותנטי מסופק. לבסוף, נדון היישום של פרוטוקול בדיקה זה באמצעות סינון בתפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות מעכבות כנגד שמרים Hsp90.

Introduction

חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא מלווה מולקולרי השומר על יציבות החלבונים האחראים להתפתחות והתקדמות סרטן. בנוסף, חלבונים האחראים על התפתחות עמידות לחומרים אנטינאופלסטיים הם גם לקוחות של Hsp901. Hsp90 מתבטא יתר על המידה בכל סוגי התאים הסרטניים (>90% מהחלבונים התאיים), בהשוואה לתאים רגילים שבהם הוא עשוי להוות פחות מ-2% מכלל החלבונים. יתר על כן, Hsp90 של תאים סרטניים שוכן בקומפלקס עם מלווים משותפים, בעוד שבתא רגיל הוא נמצא בעיקר במצב חופשי, לא מורכב 2,3. בשנים האחרונות, מספר מעכבי Hsp90 הוכחו כבעלי השפעות סנוליטיות במחקרי in vitro ו-in vivo, שם הם שיפרו באופן משמעותי את תוחלת החיים של עכברים 4,5,6. כל הממצאים הנ"ל מאששים את העובדה שמעכבי Hsp90 יכולים להיות יעילים במספר סוגי סרטן, עם פחות תופעות לוואי וסיכויים מופחתים לפתח עמידות. פונקציית הליווי של Hsp90 מושגת על ידי קשירת ATP בתחום N-terminal של Hsp90 והידרוליזה שלו ל-ADP ולפוספט חופשי7. מולקולות קטנות שנקשרות באופן תחרותי לכיס קשירת ה-ATP של Hsp90 נמצאו כמדכאות בהצלחה את השפעת הליווי של החלבון. נכון להיום, זו נותרה האסטרטגיה הטובה ביותר עבור עיכוב Hsp90, אשר נתמך על ידי העובדה כי מעכבים כאלה הגיעו לניסויים קליניים8. אחד מהם, Pimitespib, אושר ביפן לטיפול בגידול סטרומה במערכת העיכול (GIST) ביוני 20229. זהו מעכב Hsp90 הראשון שאושר מאז הוקמה יכולת הטיפול התרופתי של המלווה בשנת 199410.

בדיקת מלכיט ירוק היא הליך פשוט, רגיש, מהיר וזול לאיתור פוספט אנאורגני, המתאים לאוטומציה ולסינון תפוקה גבוהה (HTS) של תרכובות כנגד היעד הרצוי11. הבדיקה שימשה בהצלחה לסינון מעכבי Hsp90 בתצורות מעבדה קטנות, כמו גם ב- HTS 12,13,14,15,16,17. הבדיקה משתמשת בשיטה קולורימטרית הקובעת את הפוספט האי-אורגני החופשי שנוצר עקב פעילות ATPase של Hsp90. הבסיס לכימות הזה הוא היווצרות קומפלקס פוספוהומוליבדט בין פוספט חופשי למוליבדן, אשר לאחר מכן מגיב עם ירוק מלכיט ליצירת צבע ירוק (איור 1). היווצרות צבע מהירה זו נמדדת על ספקטרופוטומטר, או על קורא לוחות, בין 600-660 ננומטר18,19.

בפרוטוקול הנוכחי מתואר ההליך לביצוע בדיקה ירוקה מלכיט עם שמרים Hsp90 וזיהוי עוקב של מעכבים נגד המלווה. מולקולת המוצר הטבעית, geldanamycin (GA), שבה נקבעה לראשונה יכולת התרופה של Hsp90, נלקחה כמעכב אותנטי10. HTS הפך לחלק בלתי נפרד מתוכנית גילוי התרופות הנוכחית, בשל זמינותן של מספר רב של מולקולות לבדיקה. טכניקה זו קיבלה משמעות רבה יותר בשנתיים האחרונות בגלל הצורך הדחוף בייעוד מחדש של תרופות לטיפול בזיהום Covid-1920,21. לכן, מוצג מתווה מפורט ל-HTS של מולקולות כנגד חלבון שמרים Hsp90 על ידי אימוץ שיטת הבדיקה הירוקה מלכיט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בדיקת מלכיט ירוק בקנה מידה מעבדתי

  1. הכנת מאגר בדיקה
    1. הכינו את מאגר הבדיקה, בהתאם להרכב ולהכנה המוצגים בטבלה 1.
  2. הכנת תקני פוספט
    1. יש להשתמש בתקן פוספט 1 mM, המסופק בערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיט (מאוחסן ב- 4 °C).
    2. פיפטה 40 μL של 1 mM פוספט סטנדרטי ב 960 μL של מים טהורים במיוחד כדי לקבל 40 מיקרומטר פוספט תמיסת (תמיסת premix). הוסף את תמיסת הפרה-ערבוב עם מים טהורים במיוחד, בהתאם להוראות היצרן, ליצירת דילול סדרתי של פוספט מ-0 עד 40 מיקרומטר.
  3. הכנת שמרים Hsp90
    1. יש להשתמש בשמרים Hsp90 עם ריכוז מלאי גליצרול של 0.66 מ"ג/מ"ל. יש להפשיר על קרח ממש לפני השימוש.
    2. יש להשתמש ב-8 μL (5.98 מיקרוגרם, 0.80 מיקרומטר) של שמרים Hsp90 לפעילות ATPase מדידה. בדוק כי הפרש הצפיפות האופטית לאחר הוספת מגיב ירוק מלכיט בין הבקרה הריקה והחיובית הוא לפחות 0.5 ופחות מ -1.0. כאן, הפרש הספיגה בין הבקרה הריקה (ללא Hsp90) לבין הבקרה החיובית (עם Hsp90) נמצא 0.510.
  4. הכנת ATP
    1. העבירו 1 מ"ג ATP לבקבוקון המכיל 453.39 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד כדי לקבל 4 מילימטר של תמיסת מלאי. בצע חישובי משקל המבוססים על ATP נטול מים (משקל מולקולרי [m.w.] = 551.14). הכינו ATP טרי, מכיוון שהוא יכול לבצע הידרוליזה ספונטנית לאורך זמן.
    2. הוסף 4 μL של תמיסת מלאי ATP לכל באר כדי לתת ריכוז באר סופי של 0.2 mM (נפח באר הבדיקה הכולל הסופי של 80 μL). הוסף ATP כמרכיב האחרון לתגובה, באמצעות פיפטה רב ערוצית כך שכל התגובות יתחילו בו זמנית.
  5. הכנת geldanamycin (GA)
    1. הכן מלאי של 10 mM של GA על ידי המסת 1 מ"ג ב 178.37 μL של DMSO (m.w. = 560.64). באמצעות פתרון המלאי, להכין 4 mM, 0.8 mM, 0.16 mM, 0.032 mM, 0.0064 mM, ו 0.00128 mM פתרון ב DMSO על ידי דילול טורי.
    2. הוסף 2 μL של פתרונות מלאי אלה לכל באר כדי לקבל ריכוז באר סופי של 0.1 mMM, 0.02 mM, 0.004 mM, 0.0008 mM, 0.00016 mM, ו 0.000032 mM, בהתאמה.
    3. הכינו את הבארות כמתואר בטבלה 2 ובטבלה 3, כאשר הבארות מכילות את החסר (חיץ + מים + DMSO) ואת הבקרה השלילית (Hsp90 בחיץ + מים + DMSO). הבארות המכילות GA (Hsp90 בחיץ + מים + GA) משמשות כבקרה חיובית.
  6. הכנת צלחות באר וסדר התוספות
    1. הכינו לוחות של 96 בארות עם הפריסה המוצגת בטבלה 2. עבור תרכובות המראות בליעה של 620 ננומטר, הכינו באר נפרדת לרישום הבליעה באורך גל זה. אין להכין באר נפרדת עבור GA, שכן GA אינו מראה ספיגה ב 620 ננומטר עבור הריכוז המשמש בבדיקה.
    2. הכינו לכל מרכיב את הנפח הכולל של כל מרכיב, כפי שמוצג בטבלה 3.
    3. הגדר בארות בדיקה על ידי הוספת מים טהורים במיוחד לכל באר. לאחר מכן, הוסף את הכמות הנדרשת של מאגר הבדיקה ותמיסה מורכבת (לדוגמה, פתרון GA).
    4. לאחר מכן, הוסיפו את Hsp90 לבארות המתאימות, ונערו את הצלחות במשך 2 דקות על שייקר צלחות בטמפרטורת החדר.
    5. הוסף 4 μL של פתרון ATP באמצעות פיפטה רב ערוצית. עוטפים את הצלחת ברדיד אלומיניום ומנערים במשך 2 דקות על שייקר (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר. לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 3 שעות.
  7. הכנה והוספה של מגיב ירוק מלכיט
    1. מגיב ירוק מלכיט מורכב ריאגנטים A (אמוניום מוליבדט ב 3M HCl) ו- B (מלכיט ירוק ואלכוהול פוליוויניל). יש להביא את המגיב לטמפרטורת החדר לפני השימוש. מערבבים ריאגנטים A ו-B ביחס של 100:1 (1,000 μL:10 μL). הכינו אותו תוך 3 שעות לפני השימוש, מכיוון שהוא אינו יציב ומתחיל להתפרק לאחר 3 שעות.
    2. לאחר 3 שעות של שלב 1.6.5, לעצור את התגובה על ידי הוספת 20 μL של מגיב ירוק מלכיט, הוסיף באותו סדר כמו ATP, באמצעות פיפטה רב ערוצית.
    3. לאחר דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, מדדו את ספיגת הצלחת ב-620 ננומטר בקורא לוחות.

2. סינון בתפוקה גבוהה של מעכבי Hsp90 על ידי בדיקת מלכיט ירוק

הערה: הפרוטוקול לסינון בתפוקה גבוהה דומה למתודולוגיה בקנה מידה של מעבדה. נפח הבאר הסופי בכל מקרה הוא 80 μL. עם זאת, יש הבדל קל בסדר של תוספת של ריאגנטים. בשיטה המבוססת על קנה מידה מעבדתי, ישנם חמישה שלבים של חיבור תמיסה (34 μL מים, 32 μL של חיץ, 2 μL תרכובת DMSO, 8 μL של Hsp90, ולבסוף 4 μL של תמיסת ATP). לעומת זאת, עם HTS ישנם שלושה שלבים של חיבור (40 μL של תמיסת חיץ המכילה שמרים Hsp90, 2 μL של DMSO ב 18 μL של מים המכילים את התרכובות, ולבסוף 20 μL של ATP מומס במים). הכמות המינימלית של תמיסה שניתן pipeted במדויק בהגדרת HTS הוא 20 μL. לפיכך, נצפה הבדל בצנרת בין קשקשי מעבדה ו- HTS.

  1. הכנת חיץ בדיקה (pH 7.4)
    1. השתמש באותו מאגר ב- HTS כמו בבדיקת מלכיט ירוק בקנה מידה מעבדתי (טבלה 1).
  2. הכנת שמרים Hsp90
    1. יש להשתמש בחלבון עם ריכוז מלאי גליצרול של 0.66 מ"ג/מ"ל. יש להפשיר על קרח ממש לפני השימוש.
    2. יש להשתמש ב-8 μL (5.98 מיקרוגרם, 0.80 מיקרומטר) של שמרים Hsp90 בכל באר, המספקים פעילות ATPase מדידה.
    3. לדלל את החלבון (8 μL) במאגר (32 μL) עבור כל באר. נפח העבודה הכולל הסופי עבור כל באר הוא 40 μL בנפח בדיקה כולל של 80 μL.
  3. הכנה של 0.8 mM ATP
    1. יש להמיס 1 מ"ג ATP ב-2,267 מיקרוליטר מים מזוקקים לקבלת תמיסה של 0.8 מילימול. נפח העבודה הכולל עבור כל באר הוא 20 μL בנפח בדיקה כולל של 80 μL.
  4. הכנת geldanamycin (GA) / תרכובות בדיקה
    1. הכן מלאי של 0.8 mM של GA ב- DMSO, כמו בשלב 1.5. לדלל 10 μL של מלאי GA עם 90 μL של מים כדי לתת ריכוז סופי של 80 μM.
    2. השתמש ב- 20 μL של תמיסת GA של 80 μM בבארות בדיקה מתאימות (נפח באר הערכה כולל כולל = 80 μL), מה שנותן ריכוז באר סופי של 20 μM. זה משמש שליטה חיובית.
    3. עבור תרכובות בדיקה, להכין תמיסות DMSO לפי הריכוז הרצוי שלהם להערכה.
    4. הכינו 10 מיקרוליטר DMSO ב-90 מיקרוליטר מים לתוספת לבארות ריקות (חיץ + מים + DMSO) ובארות בקרה שליליות (Hsp90 בחיץ + מים + DMSO). הכינו את תרכובות הבדיקה באופן דומה בריכוז באר סופית של 100 מיקרומטר.
  5. עיצוב לוחות בדיקה וסדר התוספות
    1. השתמשו בארבע לוחיות עיקריות, צלחת מורכבת אחת וארבע לוחיות נוספות המכילות מלאי ריאגנטים כדי להגדיר את הבדיקה (איור 2 וטבלה 4).
    2. בנוסף, צלחת A, להוסיף 90 μL של חיץ assay בכל באר; בנוסף צלחת B, להוסיף 90 μL של חיץ עם Hsp90 בכל באר; בנוסף, לוחות C ו-D, מוסיפים 90 μL של ATP ו-90 μL של מגיב ירוק מלכיט, בהתאמה, בכל באר (טבלה 5 וטבלה 6).
    3. מצלחת חיבור A וצלחת B, להעביר 40 μL של פתרון מכל באר לצלחת הראשית 1 ו 2, 3 ו 4, בהתאמה, באמצעות מערכת ניפוק רב ערוצית אוטומטית. כאן נעשה שימוש בתחנת העבודה לאוטומציה של מעבדת Biomek(R) FXP (איור 2 וטבלה 6).
    4. מכל באר של הצלחת התרכובת העבירו 20 מיקרוליטר של התמיסה ללוחות הראשיים 1, 2, 3 ו-4 (איור 2). נערו את הצלחות במשך דקה אחת בשייקר (200 סל"ד).
    5. מכל באר של לוח C (ATP), העבירו 20 מיקרוליטר תמיסה ללוחות הראשיים 1, 2, 3 ו-4 (איור 2). נערו את הצלחות במשך דקה אחת בשייקר (200 סל"ד).
    6. לדגור את הצלחות במשך 3 שעות ב 37 ° C.
    7. הכינו את מגיב ירוק מלכיט לפי שלב 1.7. לאחר 3 שעות, העבירו 20 מיקרוליטר של מגיב ירוק מלכיט מלוח הוספה D לבארות של לוחות ראשיים 1,2, 3 ו-4 (איור 2).
    8. לאחר דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, מודדים את ספיגת הצלחת ב-620 ננומטר בקורא לוחות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות הבדיקה מפורשות במונחים של ספיגה עקב ריכוז יוני פוספט חופשי. ספיגה על ידי פוספט חופשי עקב הידרוליזה ATP על ידי שמרים Hsp90 ב 620 ננומטר נחשב 100% פעילות ATPase, או אפס אחוז עיכוב חלבון. עיכוב החלבון מוביל להפסקת הידרוליזה של ATP (פחות פוספט חופשי). אשר באה לידי ביטוי במונחים של ירידה בספיגה ב 620 ננומטר.

תוצאות בדיקת מלכיט ירוק בקנה מידה מעבדתי
הגרף הסטנדרטי של תקן הפוספט מתואר באיור 3. הפעילות של Hsp90 נמדדת במונחים של יכולתו הידרוליזה ATP ל- ADP ופוספט אנאורגני (Pi). ריכוז גבוה יותר של פוספט חופשי מוביל לעלייה בהיווצרות מורכבת עם ירוק מלכיט, מה שגורם לצבע ירוק עז שניתן לזהות ב-620 ננומטר (איור 4).

עיכוב האחוזים מחושב על ידי המשוואה הבאה:

% עיכוב Equation 1

Equation 2

ספיגת Hsp90 נחשבה כעיכוב באחוז אפס (100% פעילות ATPase). אחוז פעילות ATPase משמש למדידת עיכוב תלוי מינון של חלבון על ידי GA. נצפה כי GA עיכב את החלבון באופן תלוי מינון, עם ערך IC50 של 0.85 מיקרומטר (איור 5 וטבלה 7).

גישת העקומה הסיגמואידית של תוכנת הגרפים נוצלה כדי לקבוע את ערך IC 50 (ריכוז שבו המולקולות מציגות50 % מפעילות Hsp90 ATPase).

תוצאות של בדיקות סקר בעלות תפוקה גבוהה (HTS) של מעכבי Hsp90 על ידי בדיקת מלכיט ירוק
HTS בוצע עם תרכובות בדיקה (קודים 3 עד 96) בשכפול על ידי לקיחת GA (ריכוז באר סופית 20 מיקרומטר) כתקן הייחוס. הספיגה ב-620 ננומטר של התרכובות לא הייתה ידועה ולכן נרשמה ספיגה של התרכובות בלבד (לוחות ראשיים 1 ו-2; איור 6). ערך הספיגה עבור כל באר של לוחות ראשיים 3 ו -4 (עם Hsp90; איור 7) נוכה מהספיגה המתאימה בלוחות 1 ו-2 (תרכובת בלבד). ספיגת Hsp90 נחשבה לפעילות של 100% ATPase.

עיכוב האחוזים חושב באמצעות הנוסחה הבאה:

% עיכוב Equation 3

Equation 4

ריכוז GA של 20 מיקרומטר הראה עיכוב של 75.82%. 100 מיקרומטר של תרכובת 82 הראו עיכוב של 100% של חלבון Hsp90 שמרים, בעוד שתרכובות 6 ו-95 הציגו עיכוב של 73.07% ו-62.88%, בהתאמה, ב-100 מיקרומטר (טבלה 8). התרכובות האחרות דיכאו את החלבון בפחות מ-50% ב-100 מיקרומטר ונחשבו לא פעילות.

Figure 1
איור 1: תגובות של מגיב מלכיט ירוק (MG). (A) מבנה של מלכיט ירוק. (B) תגובות של מגיב ירוק מלכיט A (אמוניום מוליבדט ב-3M HCl) עם פאי, ותגובה עוקבת עם מגיב B (מלכיט ירוק באלכוהול פוליוויניל). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכמה ניסיונית עבור פרוטוקול HTS. האיור מתאר את סדר ההוספה של ריאגנטים לצלחת הבדיקה הראשית מלוחות התוספת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תרשים סטנדרטי לריכוז פוספט סטנדרטי. ציר ה-X מייצג את ריכוז ה-Pi במיקרו-מולרית, והספיגה ב-620 ננומטר מתוארת על ציר ה-Y. קווי השגיאה מייצגים סטייה בין שני מספרי המדגם (n = 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התפתחות צבע לאחר הוספת מגיב ירוק מלכיט. הצבע הירוק הופך אינטנסיבי יותר עם ריכוז פוספט גבוה ופעילות ATPase רבה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: חישוב IC50 עבור geldanamycin מול שמרים Hsp90. כל נקודה היא ממוצע של שתי קביעות (n = 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: התפתחות צבע לאחר הוספת מגיב ירוק מלכיט. (A) התפתחות צבע בלוח ראשי 1. הצבע הוורוד בבאר A11 נובע מהצבע המורכב. (B) התפתחות צבע בלוח ראשי 2. הצבע הוורוד בבאר A11 נובע מאופיו הצבעוני של המתחם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: התפתחות צבע לאחר הוספת מגיב ירוק מלכיט. פיתוח צבע לאחר תוספת של מגיב ירוק מלכיט. (A) התפתחות צבע בלוח הראשי 3. (B) התפתחות צבע בלוח ראשי 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פתרון מלאי קונק סופי. דילול (סופי/מלאי) כמות נדרשת למלאי של 100 מ"ל (דילול × נפח כולל)
1000 מילימטר Tris-HCl, pH 7.4 200 מ"מ 0.2 20 מ"ל
1000 mM KCl 40 מ"מ 0.04 4 מ"ל
1000 מ"מ MgCl2 12 מ"מ 0.012 1.2 מ"ל
מים טהורים במיוחד נה נה הוסף לנפח כולל של 100 מ"ל

טבלה 1: הכנת מאגר מבחן.

#  1 2 3 4 5
A מים טהורים במיוחד מים טהורים במיוחד ריק ריק
B 4 מיקרומטר PB 4 מיקרומטר PB שליטה שלילית שליטה שלילית
C 8 מיקרומטר PB 8 מיקרומטר PB GA(100 מיקרומטר) + Hsp90 GA(100 מיקרומטר) + Hsp90
D 12 מיקרומטר PB 12 מיקרומטר PB GA(20 מיקרומטר) + Hsp90 GA(20 מיקרומטר) + Hsp90
E 16 מיקרומטר PB 16 מיקרומטר PB GA(4 מיקרומטר) + Hsp90 GA(4 מיקרומטר) + Hsp90
F 24 מיקרומטר PB 24 מיקרומטר PB GA(0.8 מיקרומטר) + Hsp90 GA(0.8 מיקרומטר) + Hsp90
G 32 מיקרומטר PB 32 מיקרומטר PB GA(0.16 מיקרומטר) + Hsp90 GA(0.16 מיקרומטר) + Hsp90
H 40 מיקרומטר PB 40 מיקרומטר PB GA(0.032 מיקרומטר) + Hsp90 GA(0.032 מיקרומטר) + Hsp90
הערה: נפח הבאר הכולל הוא 80 μL. PB = תקן חיץ פוספט.

טבלה 2: הפריסה של צלחת 96 באר.

# ריק שליטה שלילית שמרים Hsp90 + GA
מאגר Assay 40 מיקרוליטר 32 מיקרוליטר 32 מיקרוליטר
DMSO 2 μL 2 μL -
GA - - 2 μL
HSP90 - 8 מיקרוליטר 8 מיקרוליטר
ATP (4mM) 4 μL 4 μL 4 μL
מים טהורים במיוחד 34 מיקרוליטר 34 מיקרוליטר 34 מיקרוליטר
עוצמת קול כוללת 80 מיקרוליטר 80 מיקרוליטר 80 מיקרוליטר

טבלה 3: מרכיב של כל באר.

מזהה לוחית הסבר
1 צלחת ראשית המכילה תרכובת
2 צלחת ראשית המכילה תרכובת (העתק של צלחת 1)
3 צלחת ראשית עם Hsp90 ותרכובת
4 צלחת ראשית עם Hsp90 ותרכובת (שכפול של צלחת 3)
CP פתרון מורכב
A פתרון חיץ
B פתרון חיץ עם Hsp90
C פתרון ATP
D פתרון מגיב ירוק מלכיט
הערה: כל הצלחות שקופות 96 היטב. צלחת ראשית: לוחות שבהם מתרחשת תגובת ATPase הסופית. לוחות CP, A, B, C ו-D הם לוחות חיבור המכילים ריאגנטים ספציפיים.

טבלה 4: סוגי צלחות המשמשות במבחן HTS.

# 1 2 3 4 CP A B C D
תמיסת תרכובת/GA ביחס של 1:10 DMSO:מים 20 מיקרוליטר 20 מיקרוליטר 20 מיקרוליטר 20 מיקרוליטר 90 מיקרוליטר - - - -
פתרון Hsp90: תמיסת חיץ (1:4) - - 40 מיקרוליטר 40 מיקרוליטר - - 90 מיקרוליטר - -
פתרון חיץ 40 מיקרוליטר 40 מיקרוליטר - - - 90 מיקרוליטר - - -
ATP (0.8 מילימול) 20 מיקרוליטר 20 מיקרוליטר 20 מיקרוליטר 20 מיקרוליטר - - - 90 מיקרוליטר -
מגיב ירוק מלכיט - - - - - - - - 90 מיקרוליטר
עוצמת קול כוללת 80 מיקרוליטר 80 מיקרוליטר 80 מיקרוליטר 80 מיקרוליטר 90 מיקרוליטר 90 מיקרוליטר 90 מיקרוליטר 90 מיקרוליטר 90 מיקרוליטר
הערה: GA = Geldanamycin. עבור לוחות חיבור CP, A, B, C, ו- D, תוספת של 10 μL נלקחת להעברה מושלמת של פתרונות ללוחות הראשיים.

טבלה 5: מרכיב של כל באר בפרוטוקול HTS.

# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A DMSO+W 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89
B GA 10 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90
C 3 11 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91
D 4 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92
E 5 13 21 29 37 45 53 61 69 77 85 93
F 6 14 22 30 38 46 54 62 70 78 86 94
G 7 15 23 31 39 47 55 63 71 79 87 95
H 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
הערה: 3-96 הם קודים מורכבים להערכת פוטנציאל עיכוב Hsp90. GA = Geldanamycin. W = מים טהורים במיוחד

טבלה 6: ובכן צלחת לפרוס עבור צלחת ראשית 1 ו 2 (ללא Hsp90), ו 3 ו 4 (עם Hsp90).

ובכן מכונן % פעילות ATPase* % עיכוב
HSP90 100 0.00
GA (100 מיקרומטר) 17.46 82.55
GA (20 מיקרומטר) 17.77 82.23
GA(4 מיקרומטר) 18.27 81.73
GA (0.8 מיקרומטר) 58.43 41.57
GA (0.16 מיקרומטר) 91.38 8.62
GA (0.032 מיקרומטר) 92.86 7.14
* ממוצע של שתי קביעות עצמאיות

טבלה 7: עיכוב אחוזים ופעילות ATPase של geldanamycin.

ובכן מכונן ABS (A) ובכן מכונן שרירי בטן (ב) ב-א % פעילות ATPase* % עיכוב
ריק 0.281 שליטה שלילית 0.663 0.383 100 0
GA (20 מיקרומטר) 0.295 GA (20 מיקרומטר)+Hsp90 0.388 0.093 24.18 75.82
תרכובת 6 (100 מיקרומטר) 0.3 תרכובת 6 (100 מיקרומטר) + Hsp90 0.403 0.103 26.93 73.07
תרכובת 82 (100 מיקרומטר) 0.49 תרכובת 82 (100 מיקרומטר) + Hsp90 0.462 -0.028 -7.32 107.32
תרכובת 95 (100 מיקרומטר) 0.327 תרכובת 95 (100 מיקרומטר) + Hsp90 0.469 0.142 37.12 62.88

טבלה 8: עיכוב אחוזים ופעילות ATPase של geldanamycin ותרכובות נבחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hsp90 הוא יעד משמעותי לגילוי מולקולות תרופות אנטי-סרטניות חדשניות. מאז התבססה יכולת הטיפול התרופתי שלה בשנת 1994,10, 18 מולקולות הגיעו לניסויים קליניים. כיום, שבע מולקולות נמצאות בשלבים שונים של ניסויים קליניים, לבדן או בשילוב22. כל המולקולות הקטנות הללו הן מעכבי קשירת ATP N-terminal. האמצעים האחרים לעיכוב המלווה (מעכבי C-terminal, מעכבי תחום אמצעי) לא התקדמו מהר כמו מעכבי N-terminal. לפיכך, תרכובות מעכבי הקישור N-terminal ATP עדיין טומנות בחובן הבטחה להתקדמות למולקולה הניתנת לשיווק קליני. יתר על כן, מעכב Hsp90 היחיד, שאושר ביוני 2022 (Pimitespib לטיפול בגיסט ביפן), הוא מולקולה קושרת N-terminal ATP9. עם זאת, מולקולה אחת, עד כה, לא הגיעה לשלב סחיר בחלקים אחרים של העולם23,24. ישנן מספר סיבות עיקריות לכישלון זה, כולל בעיות ניסוח, עלות הייצור של מולקולות בנוסף לרעילות כגון ototoxicity, ו cardiotoxicity הקשורים תרכובות מעטות. כדי להתגבר על תופעות לוואי אלה, מעכבי Hsp90 N-terminal סלקטיביים (אלפא ובטא) נחקרים כעת25,26,27. כל הדיון הנ"ל מצדיק סינון HTS של תרכובות, שידכאו את פעילות Hsp90 על ידי קשירה לשסע קשירת ATP שלו.

בדיקות לגילוי תרופות צריכות להיות מהירות, חסכוניות, רגישות, ניתנות לשכפול בקלות ומשתמשות בכימיקלים ו/או תנאים פחות מסוכנים. בנוסף, זה צריך להתבצע בנוחות בקנה מידה מעבדתי, כמו גם בהתקנה HTS. בוצע ניתוח מפורט של בדיקות מעכבות Hsp90 ATPase זמינות, ובדיקת פוספט ירוק מלכיט נמצאה המתאימה ביותר מבין כולן במערך המוסדי הנתון. מערכות הבדיקה האחרות לא היו ידידותיות לאוטומציה במערכת HTS (אנזים מצומד פירובט/לקטט דהידרוגנאז)28,29; יקר כמו בדיקת הקיטוב הפלואורסצנטי30, מבחני קרבת נצנצים, בדיקת תהודה פלסמונית פני השטח והעברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית פתורה בזמן (TR-FRET)28,29; גוזל זמן כמו (TR-FRET)28,29; או בעלי סיכוני קרינה כמו מבחני קרבה28,29. לכן, בדיקה פשוטה של מלכיט ירוק כסולם מעבדה או HTS לזיהוי מעכבי קשירת ATP Hsp90 N-terminal חדשים מוצגת בפרוטוקול זה.

החשש העיקרי בבדיקה זו הוא זיהום של חוצצים ותמציות צמחים שיש להעריך עם יוני פוספט, מה שעלול להוביל לתוצאות שגויות. הידרוליזה לא אנזימטית של ATP בתגובה pH עלולה גם להוביל לתוצאות שגויות. הבעיות הנ"ל נפתרו באמצעות מאגרים נטולי פוספט (pH 7.4). בנוסף, בוצע ריק עם חיץ + מים + DMSO, ולאחר מכן הפחית את ערך הספיגה של תרכובות הבקרה / הדגימה החיוביות מהערך הריק. אמצעי זהירות שיש לנקוט בהליך בדיקה זה הוא הקפדה על הוספת ריאגנטים, כמו הוספת ATP בו זמנית לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית. זאת כדי שהתגובה תתחיל באותו זמן בכל באר, באותו זמן דגירה, ולאחר מכן באותה מדידת ספיגה לאחר הוספת מגיב ירוק מלכיט. תגובת ATPase היא רגישה מאוד לזמן, ולכן שינוי קל בזמן התחלת התגובה וסיומה, זמן הדגירה וזמן הספיגה לרישום יכול להשפיע באופן דרסטי על תוצאות הבדיקה. יתר על כן, תוספת של 10 μL של תמיסת נתרן ציטראט 34% (המשמשת להרוות את תגובת ATPase) משפיעה על הלינאריות של העקומה הסטנדרטית, ולכן לא נכללה בפרוטוקול הבדיקה שלנו.

המגבלה היחידה של בדיקה זו היא הערכה של תרכובות המדגימות ספיגה גבוהה יותר ממה שמוצג על ידי פוספט חופשי המשתחרר מ- ATP על ידי שמרים Hsp90 ב 620 ננומטר. תוצאה חיובית כוזבת או שלילית כוזבת עלולה לגרום במקרה של תרכובות כאלה. עם זאת, הסיכוי להיתקל בתרכובות כאלה הוא נדיר מאוד. זה יכול להיות בעייתי עם הערכה של תמציות צמחים ו / או שברים שלהם בפרט, כאשר תערובת של תרכובות נמצאים.

לסיכום, הרחבת קנה מידה ממעבדה ל- HTS בוצעה בהצלחה עם שמרים Hsp90. פרוטוקול הבדיקה המדורגת בקנה מידה מעבדתי כמו גם ב- HTS יסייע למדענים ברחבי העולם לאמץ הליך זה לגילוי מעכבי Hsp90 חדשים. בנוסף, ניתן להתאים את הפרוטוקול לגילוי מעכבי ATPase כנגד חלבונים אחרים תלויי ATP כמו Hsp70, Grp94, Lon protease, Protease Ti, AAA proteases וכו'31,32,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מלגות המחקר של קוריאה (KRF), עמית פוסט-דוקטורט של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), במימון משרד המדע והתקשוב (NRF-2019H1D3A1A01102952). המחברים מודים למענק KIST ולמענק משרד האוקיינוסים והדיג מספר 2MRB130 על מתן סיוע כספי לפרויקט זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1M Magnesium chloride solution in water Sigma-Aldrich 63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water Sigma-Aldrich 60142-100ml
96-well plate SPL Life Sciences Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation Beckman Coulter Not applicable
Compounds 3-96 Not applicable Not applicable Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder AK Scientific, Inc. V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit Sigma-Aldrich MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Synergy HT multi-plate reader Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 Sigma-Aldrich 93313-1L
Yeast Hsp90 Not applicable Not applicable School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
  2. Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
  3. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  4. Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
  5. Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
  6. Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
  7. Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
  8. Park, H. -K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
  9. Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
  10. Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
  11. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  12. Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
  13. Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
  14. Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
  15. Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
  16. Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
  17. Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
  18. Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
  19. Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
  20. Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
  21. Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
  22. Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).
  23. Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
  24. Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
  25. Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
  26. Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
  27. Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
  28. Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
  29. Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
  30. Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
  31. Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
  32. Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
  33. Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).

Tags

ערך ריק גיליון 191 Hsp90 מלכיט ירוק HTS geldanamycin
בדיקת מלכיט ירוק לגילוי מעכבי חלבון הלם חום 90
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gupta, S. D., Song, D. G., Lee, S.,… More

Gupta, S. D., Song, D. G., Lee, S., Lee, J. W., Park, J. S., Prodromou, C., Pan, C. H. Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors. J. Vis. Exp. (191), e64693, doi:10.3791/64693 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter