Summary
Le protocole de dosage vert malachite est une méthode simple et rentable pour découvrir les suppresseurs de la protéine de choc thermique 90 (Hsp90), ainsi que d’autres composés inhibiteurs contre les enzymes dépendantes de l’ATP.
Abstract
La protéine de choc thermique 90 (Hsp90) est une cible anticancéreuse prometteuse en raison de son effet chaperonnant sur de multiples protéines oncogènes. L’activité de Hsp90 dépend de sa capacité à hydrolyser l’adénosine triphosphate (ATP) en adénosine diphosphate (ADP) et phosphate libre. L’activité ATPase de Hsp90 est liée à sa fonction chaperonnante ; L’ATP se lie au domaine N-terminal du Hsp90, et la perturbation de sa liaison s’est avérée être la stratégie la plus efficace pour supprimer la fonction Hsp90. L’activité de l’ATPase peut être mesurée par un dosage colorimétrique du vert malachite, qui détermine la quantité de phosphate libre formée par hydrolyse de l’ATP. Ici, une procédure pour déterminer l’activité ATPase de la levure Hsp90 en utilisant le kit de dosage de phosphate vert malachite est décrite. En outre, des instructions détaillées pour la découverte d’inhibiteurs de Hsp90 en prenant de la geldanamycine comme inhibiteur authentique sont fournies. Enfin, l’application de ce protocole de dosage par le criblage à haut débit (HTS) de molécules inhibitrices contre la levure Hsp90 est discutée.
Introduction
La protéine de choc thermique 90 (Hsp90) est un chaperon moléculaire qui maintient la stabilité des protéines responsables du développement et de la progression du cancer. De plus, les protéines responsables du développement de la résistance aux agents antinéoplasiques sont également clientes de Hsp901. Hsp90 est surexprimé de façon ubiquitaire dans tous les types de cellules cancéreuses (>90% des protéines cellulaires), par rapport aux cellules normales où il peut constituer moins de 2% des protéines totales. De plus, le Hsp90 des cellules cancéreuses réside dans un complexe avec des co-chaperons, alors que dans une cellule normale, il est présent principalement à l’état libreet non complexé 2,3. Au cours des dernières années, il a été démontré que plusieurs inhibiteurs de Hsp90 possèdent des effets sénolytiques dans des études in vitro et in vivo, où ils ont considérablement amélioré la durée de vie des souris 4,5,6. Tous les résultats susmentionnés corroborent le fait que les inhibiteurs de Hsp90 pourraient être efficaces dans plusieurs types de cancer, avec moins d’effets indésirables et moins de risques de développer une résistance. La fonction chaperonnante de Hsp90 est accomplie en liant l’ATP au domaine N-terminal de Hsp90 et en l’hydrolysant en ADP et en phosphate libre7. De petites molécules qui se lient de manière compétitive à la poche de liaison ATP de Hsp90 se sont avérées supprimer avec succès l’effet chaperonnant de la protéine. À ce jour, cela reste la meilleure stratégie pour l’inhibition de Hsp90, ce qui est soutenu par le fait que ces inhibiteurs ont atteint les essais cliniques8. L’un d’eux, Pimitespib, a été approuvé au Japon pour le traitement de la tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) en juin 20229. Il s’agit du premier inhibiteur de Hsp90 approuvé depuis que la pharmacogabilité du chaperon a été établie en 199410.
Le dosage vert malachite est une procédure simple, sensible, rapide et peu coûteuse pour la détection du phosphate inorganique, adaptée à l’automatisation et au criblage à haut débit (HTS) de composés par rapport à sa ciblesouhaitée 11. Le test a été utilisé avec succès pour le criblage des inhibiteurs de Hsp90 dans de petites installations à l’échelle du laboratoire, ainsi que dans un HTS 12,13,14,15,16,17. Le test utilise une méthode colorimétrique qui détermine le phosphate inorganique libre formé en raison de l’activité ATPase de Hsp90. La base de cette quantification est la formation d’un complexe phosphomolybdate entre le phosphate libre et le molybdène, qui réagit ensuite avec le vert malachite pour générer une couleur verte (Figure 1). Cette formation rapide de couleur est mesurée sur un spectrophotomètre, ou sur un lecteur de plaques, entre 600-660 nm18,19.
Dans le présent protocole, la procédure à suivre pour effectuer un dosage au vert de malachite avec la levure Hsp90 et l’identification ultérieure des inhibiteurs contre le chaperon sont décrites. La molécule de produit naturel, la geldanamycine (GA), avec laquelle la pharmacogabilité de Hsp90 a été établie pour la première fois, a été prise comme inhibiteur authentique10. HTS est devenu une partie intégrante du programme actuel de découverte de médicaments, en raison de la disponibilité d’un grand nombre de molécules pour les tests. Cette technique a gagné en importance au cours des 2 dernières années en raison du besoin urgent de réorienter les médicaments pour traiter l’infection Covid-1920,21. Par conséquent, un aperçu détaillé de l’HTS des molécules contre la protéine de levure Hsp90 en adoptant la méthode de dosage vert malachite est présenté.
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Protocol
1. Dosage vert de malachite à l’échelle du laboratoire
- Préparation du tampon de dosage
- Préparer le tampon d’essai, conformément à la composition et à la préparation présentées dans le tableau 1.
- Préparation des étalons phosphate
- Utiliser un phosphate étalon de 1 mM, fourni dans le kit de dosage du phosphate vert malachite (conservé à 4 °C).
- Pipeter 40 μL de phosphate étalon 1 mM dans 960 μL d’eau ultra-pure pour obtenir une solution de phosphate 40 μM (solution de prémélange). Ajouter la solution de prémélange avec de l’eau ultra-pure, selon les instructions du fabricant, pour former une dilution en série du phosphate de 0 à 40 μM.
- Préparation de la levure Hsp90
- Utilisez de la levure Hsp90 avec une concentration stockaire de glycérol de 0,66 mg / mL. Décongeler sur la glace juste avant utilisation.
- Utilisez 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) de levure Hsp90 pour une activité ATPase mesurable. Vérifier que la différence de densité optique après l’ajout du réactif vert malachite entre le témoin blanc et le témoin positif est d’au moins 0,5 et inférieure à 1,0. Ici, la différence d’absorbance entre l’essai (sans Hsp90) et le témoin positif (avec Hsp90) s’est avérée être de 0,510.
- Préparation de l’ATP
- Transférer 1 mg d’ATP dans un flacon contenant 453,39 μL d’eau ultra-pure pour obtenir 4 mM de solution mère. Effectuer des calculs de poids basés sur l’ATP anhydre (masse moléculaire [m.w.] = 551,14). Préparez de l’ATP frais, car il peut s’hydrolyser spontanément avec le temps.
- Ajouter 4 μL de solution mère d’ATP à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 0,2 mM (volume total final du puits d’essai de 80 μL). Ajouter l’ATP comme dernier composant à la réaction, à l’aide d’une pipette multicanal afin que toutes les réactions commencent simultanément.
- Préparation de la geldanamycine (GA)
- Préparer un stock de 10 mM d’AG en dissolvant 1 mg dans 178,37 μL de DMSO (m.w. = 560,64). À l’aide de la solution mère, préparer une solution de 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM et 0,00128 mM dans du DMSO par dilution série.
- Ajouter 2 μL de ces solutions mères à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM et 0,000032 mM, respectivement.
- Préparer les puits comme décrit dans les tableaux 2 et 3, avec les puits contenant le blanc (tampon + eau + DMSO) et le témoin négatif (Hsp90 dans le tampon + eau + DMSO). Les puits contenant GA (Hsp90 en tampon + eau + GA) servent de témoin positif.
- Préparation des plaques de puits et ordre d’addition
- Préparer des plaques à 96 puits selon la disposition présentée au tableau 2. Pour les composés qui présentent une absorbance à 620 nm, préparer un puits séparé pour enregistrer l’absorbance à cette longueur d’onde. Ne pas préparer un puits séparé pour l’AG, car l’AG ne montre pas d’absorbance à 620 nm pour la concentration utilisée dans l’essai.
- Préparer chaque constituant avec le volume total de chaque constituant, tel que présenté dans le tableau 3.
- Installez des puits d’analyse en ajoutant de l’eau ultra-pure à chaque puits. Ensuite, ajoutez la quantité requise de tampon de dosage et une solution composée (par exemple, une solution GA).
- Ensuite, ajoutez Hsp90 aux puits appropriés et agitez les plaques pendant 2 min sur un agitateur à plaques à température ambiante.
- Ajouter 4 μL de solution d’ATP à l’aide d’une pipette multicanal. Envelopper la plaque dans du papier d’aluminium et agiter pendant 2 min sur un agitateur à plaques (200 tr/min) à température ambiante. Incuber la plaque à 37 °C pendant 3 h.
- Préparation et ajout de réactif vert malachite
- Le réactif vert malachite est constitué des réactifs A (molybdate d’ammonium dans 3M HCl) et B (vert malachite et alcool polyvinylique). Porter le réactif à température ambiante avant utilisation. Mélanger les réactifs A et B dans un rapport de 100:1 (1 000 μL:10 μL). Préparez-le dans les 3 heures avant utilisation, car il est instable et commence à se décomposer après 3 heures.
- Après 3 h de l’étape 1.6.5, arrêter la réaction en ajoutant 20 μL de réactif vert malachite, ajouté dans le même ordre que l’ATP, à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Après une incubation de 15 min à température ambiante, mesurer l’absorbance de la plaque à 620 nm dans un lecteur de plaques.
2. Criblage à haut débit des inhibiteurs de Hsp90 par dosage vert malachite
REMARQUE : Le protocole de criblage à haut débit est similaire à la méthodologie à l’échelle du laboratoire. Le volume final du puits dans chaque cas est de 80 μL. Cependant, il existe une légère différence dans l’ordre d’ajout des réactifs. Dans la méthode à l’échelle du laboratoire, il y a cinq étapes d’addition de solution (34 μL d’eau, 32 μL de tampon, 2 μL de composé dans le DMSO, 8 μL de Hsp90 et enfin 4 μL de solution d’ATP). En revanche, avec HTS, il y a trois étapes d’addition (40 μL de solution tampon contenant de la levure Hsp90, 2 μL de DMSO dans 18 μL d’eau contenant les composés, et enfin 20 μL d’ATP dissous dans l’eau). La quantité minimale de solution pouvant être pipetée avec précision dans la configuration HTS est de 20 μL. Par conséquent, une différence de pipetage entre les échelles de laboratoire et HTS est observée.
- Préparation du tampon de dosage (pH 7,4)
- Utiliser le même tampon dans HTS que pour l’essai vert malachite à l’échelle du laboratoire (tableau 1).
- Préparation de la levure Hsp90
- Utilisez des protéines avec une concentration de stock de glycérol de 0,66 mg / mL. Décongeler sur la glace juste avant utilisation.
- Utilisez 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) de levure Hsp90 dans chaque puits, ce qui fournit une activité ATPase mesurable.
- Diluer la protéine (8 μL) dans un tampon (32 μL) pour chaque puits. Le volume de travail total final pour chaque puits est de 40 μL dans un volume d’essai total de 80 μL.
- Préparation de 0,8 mM d’ATP
- Dissoudre 1 mg d’ATP dans 2 267 μL d’eau distillée pour obtenir une solution de 0,8 mM. Le volume de travail total pour chaque puits est de 20 μL dans un volume d’essai total de 80 μL.
- Préparation de la geldanamycine (GA)/composés d’essai
- Préparez un stock de 0,8 mM de GA dans DMSO, comme à l’étape 1.5. Diluer 10 μL du stock GA avec 90 μL d’eau pour obtenir une concentration finale de 80 μM.
- Utiliser 20 μL de la solution GA à 80 μM dans des puits d’essai appropriés (volume total final du puits d’essai = 80 μL), ce qui donne une concentration finale de 20 μM dans le puits. Cela sert de contrôle positif.
- Pour les composés d’essai, préparer les solutions dans du DMSO selon leur concentration souhaitée pour l’évaluation.
- Préparer 10 μL de DMSO dans 90 μL d’eau pour l’ajouter aux puits blancs (tampon + eau + DMSO) et aux puits témoins négatifs (Hsp90 dans le tampon + eau + DMSO). Préparer les composés d’essai de la même manière à une concentration finale de 100 μM dans le puits.
- Conception des plaques d’essai et ordre d’addition
- Utiliser quatre plaques principales, une plaque composée et quatre plaques d’addition contenant des stocks de réactifs pour mettre en place le test (Figure 2 et Tableau 4).
- De plus, la plaque A, ajouter 90 μL de tampon d’essai dans chaque puits; en plus de la plaque B, ajouter 90 μL de tampon avec Hsp90 dans chaque puits; en plus des plaques C et D, ajouter 90 μL d’ATP et 90 μL de réactif vert malachite, respectivement, dans chaque puits (tableaux 5 et 6).
- À partir de la plaque d’addition A et de la plaque B, transférer 40 μL de solution de chaque puits à la plaque principale 1 et 2, et aux plaques 3 et 4, respectivement, à l’aide d’un système de distribution multicanal automatisé. Ici, le poste de travail d’automatisation de laboratoire Biomek(R) FXP a été utilisé (Figure 2 et Tableau 6).
- De chaque puits de la plaque composée, transférer 20 μL de la solution aux plaques principales 1, 2, 3 et 4 (figure 2). Secouer les plaques pendant 1 min dans un shaker (200 tr/min).
- De chaque puits de la plaque d’addition C (ATP), transférer 20 μL de solution aux plaques principales 1, 2, 3 et 4 (figure 2). Secouer les plaques pendant 1 min dans un shaker (200 tr/min).
- Incuber les plaques pendant 3 h à 37 °C.
- Préparez le réactif vert malachite conformément à l’étape 1.7. Après 3 h, transférer 20 μL de réactif vert malachite de la plaque d’addition D dans les puits des plaques principales 1, 2, 3 et 4 (figure 2).
- Après une incubation de 15 min à température ambiante, mesurer l’absorbance de la plaque est à 620 nm dans un lecteur de plaques.
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Representative Results
Les résultats de l’essai sont interprétés en termes d’absorbance due à la concentration en ions phosphate libres. L’absorbance par le phosphate libre due à l’hydrolyse de l’ATP par la levure Hsp90 à 620 nm est considérée comme une activité ATPase à 100%, ou un pourcentage zéro d’inhibition protéique. L’inhibition des protéines conduit à l’arrêt de l’hydrolyse de l’ATP (phosphate moins libre). ce qui se traduit par une diminution de l’absorbance à 620 nm.
Résultats de l’essai au vert de malachite à l’échelle du laboratoire
Le graphique standard de l’étalon phosphate est illustré à la figure 3. L’activité de Hsp90 est mesurée en termes de capacité à hydrolyser l’ATP en ADP et en phosphate inorganique (Pi). Une concentration plus élevée de phosphate libre conduit à une augmentation de la formation de complexes avec le vert malachite, ce qui provoque une couleur verte intense détectable à 620 nm (Figure 4).
Le pourcentage d’inhibition est calculé par l’équation suivante :
% d’inhibition 
L’absorbance de Hsp90 a été considérée comme un pourcentage d’inhibition à zéro (activité ATPase de 100%). Le pourcentage d’activité de l’ATPase est utilisé pour mesurer l’inhibition dose-dépendante de la protéine par GA. Il a été observé que l’AG inhibait la protéine de manière dose-dépendante, avec une valeur IC50 de 0,85 μM (Figure 5 et Tableau 7).
L’approche de la courbe sigmoïdale du logiciel graphique a été utilisée pour déterminer la valeur IC 50 (concentration à laquelle les molécules présentent50 % de l’activité de l’ATPase Hsp90).
Résultats du criblage à haut débit (HTS) des inhibiteurs de Hsp90 par dosage vert de malachite
Le HTS a été réalisé avec des composés d’essai (codes 3 à 96) en double en prenant GA (concentration finale de puits de 20 μM) comme étalon de référence. L’absorbance à 620 nm des composés n’était pas connue et, par conséquent, l’absorbance des composés seuls a été enregistrée (plaques principales 1 et 2; Graphique 6). La valeur d’absorbance pour chaque puits des plaques principales 3 et 4 (avec Hsp90; Graphique 7) a été déduite de l’absorbance correspondante dans les plaques 1 et 2 (composé seul). L’absorbance de Hsp90 a été considérée comme une activité ATPase à 100%.
Le pourcentage d’inhibition a été calculé à l’aide de la formule suivante :
% d’inhibition
La concentration de 20 μM GA a démontré une inhibition de 75,82%. A 100 μM du composé 82 a montré une inhibition de 100% de la protéine de levure Hsp90, tandis que les composés 6 et 95 ont montré une inhibition de 73,07% et 62,88%, respectivement, à 100 μM (tableau 8). Les autres composés ont supprimé la protéine de moins de 50% à 100 μM et ont été considérés comme inactifs.
Figure 1 : Réactions du réactif vert de malachite (MG). (A) Structure du vert de malachite. (B) Réactions du réactif vert de malachite A (molybdate d’ammonium dans 3 M HCl) avec Pi, et réaction ultérieure avec le réactif B (vert de malachite dans l’alcool polyvinylique). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma expérimental pour le protocole HTS. La figure illustre l’ordre d’addition des réactifs à la plaque d’essai principale à partir des plaques d’addition. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Graphique standard pour la concentration standard de phosphate. L’axe des X représente la concentration de Pi en micromolaire, et l’absorbance à 620 nm est représentée sur l’axe des Y. Les barres d’erreur représentent l’écart entre les deux numéros d’échantillon (n = 2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Développement de la couleur après ajout du réactif vert malachite. La couleur verte devient plus intense avec une concentration élevée de phosphate et plus d’activité ATPase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Calcul IC50 de la geldanamycine par rapport à la levure Hsp90. Chaque point est une moyenne de deux déterminations (n = 2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Développement de la couleur après addition du réactif vert malachite. (A) Développement de la couleur dans la plaque principale 1. La couleur rose dans le puits A11 est due à la couleur composée. (B) Développement des couleurs dans la planche principale 2. La couleur rose dans le puits A11 est due à la nature colorée du composé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Développement de la couleur après ajout du réactif vert malachite. Développement de la couleur après l’ajout de réactif vert malachite. (A) Développement des couleurs dans la planche principale 3. (B) Développement des couleurs dans la planche principale 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Solution mère | Conc final. | Dilution (finale/stock) | Quantité requise pour un stock de 100 ml (dilution × volume total) |
| 1000 mM Tris-HCl, pH 7,4 | 200 mM | 0.2 | 20 mL |
| 1000 mM KCl | 40 mM | 0.04 | 4 mL |
| 1000 mM MgCl2 | 12 mM | 0.012 | 1,2 mL |
| De l’eau ultra-pure | NA | NA | Ajouter à 100 mL de volume total |
Tableau 1 : Préparation du tampon de dosage.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Un | De l’eau ultra-pure | De l’eau ultra-pure | Blanc | Blanc | |
| B | 4 μM PB | 4 μM PB | Contrôle négatif | Contrôle négatif | |
| C | 8 μM PB | 8 μM PB | GA(100 μM) + Hsp90 | GA(100 μM) + Hsp90 | |
| D | 12 μM PB | 12 μM PB | GA(20 μM) + Hsp90 | GA(20 μM) + Hsp90 | |
| E | 16 μM PB | 16 μM PB | GA(4 μM) + Hsp90 | GA(4 μM) + Hsp90 | |
| F | 24 μM PB | 24 μM PB | GA(0,8 μM) + Hsp90 | GA(0,8 μM) + Hsp90 | |
| G | 32 μM PB | 32 μM PB | GA(0,16 μM) + Hsp90 | GA(0,16 μM) + Hsp90 | |
| H | 40 μM PB | 40 μM PB | GA(0,032 μM) + Hsp90 | GA(0,032 μM) + Hsp90 | |
| Note: Le volume total du puits est de 80 μL. PB = Étalon tampon phosphate. | |||||
Tableau 2 : La disposition de la plaque de 96 puits.
| # | Blanc | Contrôle négatif | Levure Hsp90 + GA |
| Tampon de dosage | 40 μL | 32 μL | 32 μL |
| DMSO | 2 μL | 2 μL | - |
| GA | - | - | 2 μL |
| HSP90 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mM) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| De l’eau ultra-pure | 34 μL | 34 μL | 34 μL |
| Volume total | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
Tableau 3 : Constituant de chaque puits.
| ID de plaque | Explication |
| 1 | Plaque principale contenant un composé |
| 2 | Plaque principale contenant un composé (duplicata de la planche 1) |
| 3 | Plaque principale avec Hsp90 et composé |
| 4 | Plaque principale avec Hsp90 et composé (duplicata de la planche 3) |
| CP | Solution composée |
| Un | Solution tampon |
| B | Solution tampon avec Hsp90 |
| C | Solution ATP |
| D | Solution de réactif vert malachite |
| Remarque: Toutes les plaques sont transparentes à 96 puits. Plaque principale : plaques où la réaction finale de l’ATPase a lieu. Les plaques CP, A, B, C et D sont des plaques d’addition contenant des réactifs spécifiques. | |
Tableau 4 : Types de plaques utilisées dans le test HTS.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | CP | Un | B | C | D | ||
| Solution composée/GA dans 1:10 DMSO:eau | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 90 μL | - | - | - | - | ||
| Solution Hsp90 : solution tampon (1:4) | - | - | 40 μL | 40 μL | - | - | 90 μL | - | - | ||
| Solution tampon | 40 μL | 40 μL | - | - | - | 90 μL | - | - | - | ||
| ATP (0,8 mM) | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | - | - | - | 90 μL | - | ||
| Réactif vert malachite | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 μL | ||
| Volume total | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | ||
| Note: GA = Geldanamycine. Pour les plaques d’addition CP, A, B, C et D, 10 μL supplémentaires sont pris pour un transfert parfait des solutions vers les plaques principales. | |||||||||||
Tableau 5 : Constituant de chaque puits dans le protocole HTS.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Un | DMSO+W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | GA | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| Remarque : 3-96 sont des codes composés pour évaluer le potentiel d’inhibition de Hsp90. GA = Geldanamycine. W = Eau ultra-pure | ||||||||||||
Tableau 6 : Disposition de la plaque de puits pour les plaques principales 1 et 2 (sans Hsp90), et 3 et 4 (avec Hsp90).
| Constituant de puits | % d’activité ATPase* | % d’inhibition |
| HSP90 | 100 | 0.00 |
| GA(100 μM) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 μM) | 17.77 | 82.23 |
| GA(4 μM) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0,8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0,16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0,032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| *Une moyenne de deux déterminations indépendantes | ||
Tableau 7 : Pourcentage d’inhibition et activité de l’ATPase de la geldanamycine.
| Constituant de puits | Abs (A) | Constituant de puits | Abs (B) | B-A | % d’activité ATPase* | % d’inhibition |
| Blanc | 0.281 | Contrôle négatif | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 μM) | 0.295 | GA (20 μM)+Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| Composé 6 (100 μM) | 0.3 | Composé 6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| Composé 82 (100 μM) | 0.49 | Composé 82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| Composé 95 (100 μM) | 0.327 | Composé 95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
Tableau 8 : Pourcentage d’inhibition et d’activité de l’ATPase de la geldanamycine et de certains composés.
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Discussion
Hsp90 est une cible importante pour la découverte de nouvelles molécules médicamenteuses anticancéreuses. Depuis que sa pharmacogabilité a été établie en 199410, 18 molécules ont atteint les essais cliniques. À l’heure actuelle, sept molécules sont en phase variable d’essais cliniques, seules ou en combinaison22. Toutes ces petites molécules sont des inhibiteurs de liaison à l’ATP N-terminal. Les autres moyens d’inhibition du chaperon (inhibiteurs C-terminal, inhibiteurs du domaine intermédiaire) n’ont pas progressé aussi vite que les inhibiteurs N-terminal. Par conséquent, les composés inhibiteurs de liaison à l’ATP N-terminaux sont toujours prometteurs pour devenir une molécule cliniquement commercialisable. De plus, le seul inhibiteur de Hsp90, approuvé en juin 2022 (Pimitespib pour le traitement des GIST au Japon), est une molécule de liaison à l’ATPN-terminale 9. Cependant, une seule molécule, à ce jour, n’a pas atteint un stade commercialisable dans d’autres parties du monde23,24. Il y a plusieurs raisons principales à cet échec, y compris les problèmes de formulation, le coût de production des molécules en plus de la toxicité comme l’ototoxicité, et la cardiotoxicité associée à quelques composés. Pour surmonter ces effets indésirables, les inhibiteurs sélectifs N-terminaux Hsp90 (alpha et bêta) sont actuellement explorés25,26,27. Toute la discussion susmentionnée justifie le criblage HTS des composés, qui supprimera l’activité de Hsp90 en se liant à sa fente de liaison ATP.
Les tests pour la découverte de médicaments doivent être rapides, rentables, sensibles, facilement reproductibles et utiliser des produits chimiques et/ou des conditions moins dangereux. De plus, il devrait être commodément effectué à l’échelle du laboratoire ainsi que dans une configuration HTS. Une analyse détaillée des tests inhibiteurs de l’ATPase Hsp90 disponibles a été entreprise, et le test de phosphate vert de malachite s’est avéré le plus approprié parmi tous dans la configuration institutionnelle donnée. Les autres systèmes d’essai n’étaient pas faciles à automatiser dans un système HTS (enzyme couplée pyruvate/lactate déshydrogénase)28,29; coûteux comme le test de polarisation de fluorescence30, les essais de proximité par scintillation, le test de résonance plasmonique de surface et le transfert d’énergie par résonance de fluorescence résolue dans le temps (TR-FRET)28,29; chronophage comme (TR-FRET)28,29; ou possédait des risques de rayonnement comme des essais de proximité par scintillation28,29. Par conséquent, un test simple de vert malachite à l’échelle du laboratoire ou HTS pour l’identification de nouveaux inhibiteurs de liaison à l’ATP N-terminal Hsp90 est présenté dans ce protocole.
La principale préoccupation dans ce test est la contamination des tampons et des extraits de plantes à évaluer avec des ions phosphate, ce qui peut conduire à des résultats erronés. L’hydrolyse non enzymatique de l’ATP au pH de réaction peut également conduire à des résultats erronés. Les problèmes susmentionnés ont été résolus en utilisant des tampons sans phosphate (pH 7,4). De plus, un blanc a été effectué avec tampon + eau + DMSO, puis a soustrait la valeur d’absorbance des composés témoins positifs/échantillons de la valeur de l’essai blanc. Une précaution qui doit être suivie dans cette procédure de dosage est le strict respect de l’ajout de réactifs, comme l’ajout d’ATP simultanément à chaque puits via une pipette multicanal. Ceci afin que la réaction commence en même temps dans chaque puits, le même temps d’incubation, et ensuite à la même mesure d’absorbance après l’ajout du réactif vert malachite. La réaction de l’ATPase est très sensible au temps et, par conséquent, un léger changement dans le temps d’initiation et de fin de la réaction, le temps d’incubation et le temps d’enregistrement de l’absorbance peut affecter considérablement les résultats du test. De plus, l’ajout de 10 μL de solution de citrate de sodium à 34% (utilisée pour tremper la réaction d’ATPase) affecte la linéarité de la courbe standard et n’a donc pas été inclus dans notre protocole de dosage.
La seule limite de ce test est l’évaluation des composés qui démontrent une absorbance supérieure à celle démontrée par le phosphate libre libéré par l’ATP par la levure Hsp90 à 620 nm. Un faux positif ou un faux négatif peut entraîner le cas de tels composés. Cependant, les chances de rencontrer de tels composés sont très rares. Cela peut être problématique avec l’évaluation des extraits de plantes et/ou de leurs fractions en particulier, lorsqu’un mélange de composés est présent.
En conclusion, la mise à l’échelle de laboratoire à HTS a été réalisée avec succès avec la levure Hsp90. Le protocole de dosage par étapes à l’échelle du laboratoire ainsi que dans HTS aidera les scientifiques du monde entier à adopter cette procédure pour la découverte de nouveaux inhibiteurs de Hsp90. De plus, le protocole peut être adapté pour la découverte d’inhibiteurs de l’ATPase contre d’autres protéines dépendantes de l’ATP comme Hsp70, Grp94, la protéase Lon, la protéase Ti, les protéases AAA, etc.31,32,33.
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Disclosures
Il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par le programme Korea Research Fellowship (KRF), boursier postdoctoral de la National Research Foundation of Korea (NRF), financé par le ministère des Sciences et des TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Les auteurs remercient la subvention intra-muros du KIST et la subvention numéro 2MRB130 du ministère des Océans et des Pêches pour l’aide financière qu’ils ont apportée à ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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