Summary
O protocolo de ensaio verde de malaquita é um método simples e econômico para descobrir supressores de proteína de choque térmico 90 (Hsp90), bem como outros compostos inibidores contra enzimas dependentes de ATP.
Abstract
A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é um alvo anticâncer promissor devido ao seu efeito de chaperoning sobre múltiplas proteínas oncogênicas. A atividade da Hsp90 é dependente de sua capacidade de hidrolisar adenosina trifosfato (ATP) em adenosina difosfato (ADP) e fosfato livre. A atividade ATPase da Hsp90 está ligada à sua função de chaperoning; ATP liga-se ao domínio N-terminal do Hsp90, e interromper sua ligação foi encontrado para ser a estratégia mais bem sucedida na supressão da função Hsp90. A atividade da ATPase pode ser medida por um ensaio colorimétrico verde de malaquita, que determina a quantidade de fosfato livre formado pela hidrólise de ATP. Aqui, um procedimento para determinar a atividade ATPase da levedura Hsp90 usando o kit de ensaio de fosfato verde de malaquita é descrito. Além disso, instruções detalhadas para a descoberta de inibidores de Hsp90 tomando geldanamicina como um inibidor autêntico é fornecida. Finalmente, a aplicação deste protocolo de ensaio através da triagem de alto rendimento (HTS) de moléculas inibidoras contra a levedura Hsp90 é discutida.
Introduction
A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma chaperona molecular que mantém a estabilidade de proteínas responsáveis pelo desenvolvimento e progressão do câncer. Além disso, proteínas responsáveis pelo desenvolvimento de resistência a agentes antineoplásicos também são clientes da Hsp901. A Hsp90 é superexpressa de forma ubíqua em todos os tipos de células cancerosas (>90% das proteínas celulares), em comparação com as células normais, onde pode constituir menos de 2% das proteínas totais. Além disso, a Hsp90 das células cancerosas reside em um complexo com cochaperonas, enquanto em uma célula normal está presente predominantemente em um estado livre e nãocomplexado 2,3. Nos últimos anos, vários inibidores de Hsp90 demonstraram possuir efeitos senolíticos em estudos in vitro e in vivo, onde melhoraram significativamente o tempo de vida de camundongos 4,5,6. Todos os achados acima corroboram o fato de que os inibidores de Hsp90 poderiam ser efetivos em múltiplos tipos de câncer, com menos efeitos adversos e menores chances de desenvolver resistência. A função de chaperoning da Hsp90 é realizada ligando-se ao ATP no domínio N-terminal da Hsp90 e hidrolisando-o em ADP e fosfato livre7. Pequenas moléculas que se ligam competitivamente à bolsa de ligação de ATP de Hsp90 foram encontradas para suprimir com sucesso o efeito de chaperoning da proteína. Até o momento, essa continua sendo a melhor estratégia para a inibição da Hsp90, o que é apoiado pelo fato de tais inibidores terem chegado a ensaios clínicos8. Um deles, o Pimitespib, foi aprovado no Japão para o tratamento do tumor estromal gastrointestinal (GIST) em junho de 20229. Este é o primeiro inibidor de Hsp90 aprovado desde que a farmacogabilidade da chaperona foi estabelecida em 199410.
O ensaio verde de malaquita é um procedimento simples, sensível, rápido e de baixo custo para a detecção de fosfato inorgânico, adequado para automação e triagem de alto rendimento (HTS) de compostos contra seu alvo desejado11. O ensaio foi empregado com sucesso para a triagem de inibidores de Hsp90 em pequenos montamentos em escala laboratorial, bem como em uma HTS 12,13,14,15,16,17. O ensaio utiliza um método colorimétrico que determina o fosfato inorgânico livre formado devido à atividade ATPase da Hsp90. A base dessa quantificação é a formação de um complexo fosfomolibdato entre fosfato livre e molibdênio, que posteriormente reage com o verde malaquita para gerar uma cor verde (Figura 1). Essa rápida formação de cor é medida em espectrofotômetro, ou em leitor de placas, entre 600-660 nm18,19.
No presente protocolo, descreve-se o procedimento para a realização do ensaio verde de malaquita com a levedura Hsp90 e posterior identificação de inibidores contra a chaperona. A molécula do produto natural, geldanamicina (GA), com a qual a farmacogabilidade da Hsp90 foi estabelecida pela primeira vez, foi tomada como um inibidor autêntico10. A HTS tornou-se parte integrante do atual programa de descoberta de fármacos, devido à disponibilidade de um grande número de moléculas para testes. Essa técnica ganhou mais importância nos últimos 2 anos devido à necessidade urgente de reaproveitamento de medicamentos para o tratamento da infecção por Covid-1920,21. Portanto, um esboço detalhado para a HTS de moléculas contra a proteína Hsp90 da levedura adotando o método de ensaio verde de malaquita é apresentado.
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Protocol
1. Ensaio verde de malaquita em escala de laboratório
- Preparação do tampão de ensaio
- Preparar o tampão de ensaio, de acordo com a composição e preparação apresentadas na Tabela 1.
- Preparação de padrões de fosfato
- Utilizar o padrão de fosfato de 1 mM, fornecido no kit de ensaio de fosfato verde de malaquita (armazenado a 4 °C).
- Pipetar 40 μL de fosfato padrão 1 mM em 960 μL de água ultrapura para obter 40 μM de solução de fosfato (solução de pré-mistura). Adicionar a solução de pré-mistura com água ultrapura, de acordo com as instruções do fabricante, para formar uma diluição em série de fosfato de 0 a 40 μM.
- Preparo da levedura Hsp90
- Use a levedura Hsp90 com uma concentração estoque de glicerol de 0,66 mg/mL. Descongelar no gelo pouco antes de usar.
- Use 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) de levedura Hsp90 para atividade ATPase mensurável. Verifique se a diferença de densidade óptica após a adição do reagente verde de malaquita entre o branco e o controle positivo é de pelo menos 0,5 e inferior a 1,0. Aqui, a diferença de absorbância entre o branco (sem Hsp90) e o controle positivo (com Hsp90) foi de 0,510.
- Preparação de ATP
- Transferir 1 mg de ATP para um frasco para injetáveis contendo 453,39 μL de água ultrapura para obter 4 mM de solução-mãe. Realizar cálculos de peso com base no ATP anidro (peso molecular [m.p.] = 551,14). Prepare o ATP fresco, pois ele pode hidrolisar espontaneamente com o tempo.
- Adicionar 4 μL de solução-mãe de ATP a cada poço para obter uma concentração final do poço de 0,2 mM (volume total final do poço de ensaio de 80 μL). Adicione ATP como último componente à reação, usando uma pipeta multicanal para que todas as reações comecem simultaneamente.
- Preparação de geldanamicina (GA)
- Preparar um estoque de 10 mM de GA dissolvendo 1 mg em 178,37 μL de DMSO (m.w. = 560,64). Usando a solução-mãe, preparar soluções de 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM e 0,00128 mM em DMSO por diluição seriada.
- Adicionar 2 μL dessas soluções-estoque a cada poço para obter uma concentração final de 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM e 0,000032 mM, respectivamente.
- Preparar os poços conforme descrito na Tabela 2 e Tabela 3, sendo que os poços contêm o controle branco (tampão + água + DMSO) e negativo (Hsp90 em tampão + água + DMSO). Os poços contendo GA (Hsp90 em tampão + água + GA) servem como controle positivo.
- Preparação de placas de poço e ordem de adição
- Prepare placas de 96 poços com o layout apresentado na Tabela 2. Para compostos que apresentam absorbância a 620 nm, prepare um poço separado para registrar a absorbância neste comprimento de onda. Não prepare um poço separado para GA, pois o GA não mostra absorbância a 620 nm para a concentração utilizada no ensaio.
- Preparar cada constituinte com o volume total de cada constituinte, conforme apresentado na Tabela 3.
- Configure poços de ensaio adicionando água ultrapura a cada poço. Em seguida, adicione a quantidade necessária de tampão de ensaio e uma solução composta (por exemplo, solução de GA).
- Em seguida, adicione Hsp90 aos poços apropriados e agite as placas por 2 min em um agitador de placas à temperatura ambiente.
- Adicionar 4 μL de solução de ATP utilizando uma pipeta multicanal. Embrulhe a placa em papel alumínio e agite por 2 min em um agitador de placas (200 rpm) à temperatura ambiente. Incubar a placa a 37 °C durante 3 h.
- Preparação e adição de reagente verde de malaquita
- O reagente verde de malaquita é composto pelos reagentes A (molibdato de amônio em HCl 3M) e B (verde de malaquita e álcool polivinílico). Levar o reagente à temperatura ambiente antes de utilizar. Misturar os reagentes A e B na proporção de 100:1 (1.000 μL:10 μL). Prepare em até 3 h antes do uso, pois é instável e começa a se decompor após 3 h.
- Após 3 h do passo 1.6.5, parar a reação adicionando 20 μL de reagente verde de malaquita, adicionado na mesma ordem do ATP, usando uma pipeta multicanal.
- Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, medir a absorbância da placa a 620 nm em um leitor de placas.
2. Triagem de alto rendimento de inibidores de Hsp90 pelo ensaio verde de malaquita
NOTA: O protocolo para triagem de alto rendimento é semelhante à metodologia em escala de laboratório. O volume final do poço em cada caso é de 80 μL. No entanto, há uma pequena diferença na ordem de adição dos reagentes. No método baseado em escala de laboratório, há cinco estágios de adição da solução (34 μL de água, 32 μL de tampão, 2 μL de composto em DMSO, 8 μL de Hsp90 e, finalmente, 4 μL de solução de ATP). Em contraste, com HTS há três estágios de adição (40 μL de solução tampão contendo levedura Hsp90, 2 μL de DMSO em 18 μL de água contendo os compostos e, finalmente, 20 μL de ATP dissolvido em água). A quantidade mínima de solução que pode ser pipetada com precisão na configuração HTS é de 20 μL. Assim, observa-se uma diferença na pipetagem entre as escalas de laboratório e HTS.
- Preparação do tampão de ensaio (pH 7,4)
- Use o mesmo tampão no HTS que para o ensaio verde de malaquita em escala laboratorial (Tabela 1).
- Preparo da levedura Hsp90
- Use proteína com uma concentração estoque de glicerol de 0,66 mg/mL. Descongelar no gelo pouco antes de usar.
- Use 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) de levedura Hsp90 em cada poço, o que fornece atividade ATPase mensurável.
- Diluir a proteína (8 μL) em tampão (32 μL) para cada poço. O volume total de trabalho final para cada poço é de 40 μL em um volume total de ensaio de 80 μL.
- Preparação de 0,8 mM ATP
- Dissolver 1 mg de ATP em 2.267 μL de água destilada para obter uma solução de 0,8 mM. O volume total de trabalho para cada poço é de 20 μL em um volume total de ensaio de 80 μL.
- Preparação de geldanamicina (GA)/compostos de ensaio
- Prepare um estoque de 0,8 mM de GA no DMSO, como na etapa 1.5. Diluir 10 μL do estoque de GA com 90 μL de água para obter uma concentração final de 80 μM.
- Utilizar 20 μL da solução de 80 μM de GA em poços de ensaio apropriados (volume total final do poço de ensaio = 80 μL), obtendo-se uma concentração final do poço de 20 μM. Isso serve como um controle positivo.
- Para compostos de teste, preparar soluções em DMSO de acordo com sua concentração desejada para avaliação.
- Preparar 10 μL de DMSO em 90 μL de água para adição em poços de controle branco (tampão + água + DMSO) e negativo (Hsp90 em tampão + água + DMSO). Preparar os compostos de ensaio de forma semelhante a uma concentração final de poço de 100 μM.
- Projeto de placas de ensaio e ordem de adição
- Utilizar quatro placas principais, uma placa composta e quatro placas de adição contendo estoques de reagentes para montar o ensaio (Figura 2 e Tabela 4).
- Além disso, placa A, adicionar 90 μL de tampão de ensaio em cada poço; além da placa B, adicionar 90 μL de tampão com Hsp90 em cada poço; além das placas C e D, adicionar 90 μL de ATP e 90 μL de reagente verde de malaquita, respectivamente, em cada poço (Tabela 5 e Tabela 6).
- Da placa de adição A e da placa B, transferir 40 μL de solução de cada poço para as placas principais 1 e 2, e 3 e 4, respectivamente, usando um sistema de dosagem multicanal automatizado. Utilizou-se a estação de trabalho de automação laboratorial Biomek(R) FXP (Figura 2 e Tabela 6).
- De cada poço da placa composta, transferir 20 μL da solução para as placas principais 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agite as placas por 1 min em um agitador (200 rpm).
- De cada poço da placa de adição C (ATP), transferir 20 μL de solução para as placas principais 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agite as placas por 1 min em um agitador (200 rpm).
- Incubar as placas durante 3 h a 37 °C.
- Preparar o reagente verde de malaquita de acordo com o passo 1.7. Após 3 h, transferir 20 μL do reagente verde de malaquita da placa de adição D para os poços das placas principais 1, 2, 3 e 4 (Figura 2).
- Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, meça a absorvância da placa a 620 nm em um leitor de placas.
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Representative Results
Os resultados do ensaio são interpretados em termos de absorbância devido à concentração livre do íon fosfato. A absorbância por fosfato livre devido à hidrólise de ATP pela levedura Hsp90 a 620 nm é considerada como 100% de atividade da ATPase, ou zero porcentagem de inibição proteica. A inibição da proteína leva à cessação da hidrólise de ATP (menos fosfato livre). o que se reflete em termos de diminuição da absorbância a 620 nm.
Resultados do ensaio verde de malaquita em escala laboratorial
O gráfico padrão para o padrão de fosfato é mostrado na Figura 3. A atividade da Hsp90 é medida em termos de sua capacidade de hidrolisar ATP para ADP e fosfato inorgânico (Pi). Uma maior concentração de fosfato livre leva a um aumento na formação de complexos com verde malaquita, o que causa uma cor verde intensa detectável a 620 nm (Figura 4).
A inibição percentual é calculada pela seguinte equação:
% Inibição 
A absorbância da Hsp90 foi considerada como inibição percentual zero (100% de atividade da ATPase). A porcentagem de atividade da ATPase é usada para medir a inibição dose-dependente da proteína pelo GA. Observou-se que o GA inibiu a proteína de forma dose-dependente, com IC50 de 0,85 μM (Figura 5 e Tabela 7).
A abordagem da curva sigmoidal do software gráfico foi utilizada para determinar o valor de CI 50 (concentração na qual as moléculas exibem50 % de atividade da Hsp90 ATPase).
Resultados da triagem de alto rendimento (HTS) de inibidores de Hsp90 pelo ensaio verde de malaquita
O HTS foi realizado com compostos de teste (códigos 3 a 96) em duplicata, tomando-se GA (concentração final do poço de 20 μM) como padrão de referência. A absorbância a 620 nm dos compostos não era conhecida e, portanto, a absorbância dos compostos isoladamente foi registrada (placas principais 1 e 2; Gráfico 6). O valor de absorbância para cada poço das placas principais 3 e 4 (com Hsp90; Gráfico 7) foi deduzida da absorbância correspondente nas placas 1 e 2 (composto isoladamente). A absorbância da Hsp90 foi considerada como 100% da atividade da ATPase.
A porcentagem de inibição foi calculada utilizando-se a seguinte fórmula:
% Inibição
A concentração de 20 μM de GA demonstrou 75,82% de inibição. A 100 μM do composto 82 mostrou 100% de inibição da proteína Hsp90 da levedura, enquanto os compostos 6 e 95 exibiram 73,07% e 62,88% de inibição, respectivamente, a 100 μM (Tabela 8). Os demais compostos suprimiram a proteína em menos de 50% a 100 μM e foram considerados inativos.
Figura 1: Reações do reagente verde de malaquita (MG). (A) Estrutura do verde de malaquita. (B) Reações do reagente A do verde de malaquita (molibdato de amônio em HCl 3 M) com Pi, e subsequente reação com o reagente B (verde de malaquita em álcool polivinílico). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema experimental para protocolo HTS. A figura representa a ordem de adição dos reagentes à placa de ensaio principal das placas de adição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gráfico padrão para a concentração padrão de fosfato. O eixo X representa a concentração de Pi em micromolares e a absorbância a 620 nm é representada no eixo Y. As barras de erro representam o desvio entre os dois números da amostra (n = 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Evolução da cor após adição do reagente verde malaquita. A cor verde torna-se mais intensa com alta concentração de fosfato e maior atividade da ATPase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cálculo do CI50 para geldanamicina contra a levedura Hsp90. Cada ponto é uma média de duas determinações (n = 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Evolução da cor após adição do reagente verde de malaquita . (A) Desenvolvimento da cor na placa principal 1. A cor rosa no poço A11 é devido à cor composta. (B) Desenvolvimento da cor na placa principal 2. A cor rosa no poço A11 é devido à natureza colorida do composto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Evolução da cor após adição do reagente verde malaquita. Desenvolvimento da cor após a adição do reagente verde de malaquita. (A) Desenvolvimento da cor na placa principal 3. (B) Desenvolvimento da cor na placa principal 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução de estoque | Conc. final | Diluição (Final/Estoque) | Quantidade necessária para 100 ml de estoque (diluição × volume total) |
| 1000 mM Tris-HCl, pH 7,4 | 200 mM | 0.2 | 20 mL |
| KCl 1000 mM | 40 mM | 0.04 | 4 mL |
| 1000 mM MgCl2 | 12 mM | 0.012 | 1,2 mL |
| Água ultra-pura | NA | NA | Adicionar a 100 mL de volume total |
Tabela 1: Preparação do tampão de ensaio.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Um | Água ultra-pura | Água ultra-pura | Em branco | Em branco | |
| B | 4 μM PB | 4 μM PB | Controle Negativo | Controle negativo | |
| C | 8 μM PB | 8 μM PB | GA(100 μM) + Hsp90 | GA(100 μM) + Hsp90 | |
| D | 12 μM PB | 12 μM PB | GA(20 μM) + Hsp90 | GA(20 μM) + Hsp90 | |
| E | 16 μM PB | 16 μM PB | GA(4 μM) + Hsp90 | GA(4 μM) + Hsp90 | |
| F | 24 μM PB | 24 μM PB | GA(0,8 μM) + Hsp90 | GA(0,8 μM) + Hsp90 | |
| G | 32 μM PB | 32 μM PB | GA(0,16 μM) + Hsp90 | GA(0,16 μM) + Hsp90 | |
| H | 40 μM PB | 40 μM PB | GA(0,032 μM) + Hsp90 | GA(0,032 μM) + Hsp90 | |
| Nota: O volume total do poço é de 80 μL. PB = Padrão tampão fosfato. | |||||
Tabela 2: O layout da placa de 96 poços.
| # | Em branco | Controle negativo | Levedura Hsp90 + GA |
| Buffer de ensaio | 40 μL | 32 μL | 32 μL |
| DMSO | 2 μL | 2 μL | - |
| GA | - | - | 2 μL |
| Hsp90 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mM) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| Água ultra-pura | 34 μL | 34 μL | 34 μL |
| Volume total | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
Tabela 3: Constituinte de cada poço.
| ID da placa | Explicação |
| 1 | Placa principal contendo composto |
| 2 | Placa principal contendo composto (duplicata da placa 1) |
| 3 | Placa principal com Hsp90 e composto |
| 4 | Placa principal com Hsp90 e composto (duplicata da placa 3) |
| CP | Solução composta |
| Um | Solução tampão |
| B | Solução tampão com Hsp90 |
| C | Solução ATP |
| D | Solução de reagente verde de malaquita |
| Nota: Todas as placas são transparentes de 96 poços. Placa principal: placas onde ocorre a reação final da ATPase. As placas CP, A, B, C e D são placas de adição contendo reagentes específicos. | |
Tabela 4: Tipos de placas utilizadas no ensaio HTS.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | CP | Um | B | C | D | ||
| Solução composta/GA em 1:10 DMSO: água | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 90 μL | - | - | - | - | ||
| Solução de Hsp90: solução tampão (1:4) | - | - | 40 μL | 40 μL | - | - | 90 μL | - | - | ||
| Solução tampão | 40 μL | 40 μL | - | - | - | 90 μL | - | - | - | ||
| ATP (0,8 mM) | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | - | - | - | 90 μL | - | ||
| Reagente verde de malaquita | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 μL | ||
| Volume total | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | ||
| Nota: GA = Geldanamicina. Para as placas de adição CP, A, B, C e D, são retirados 10 μL extras para a perfeita transferência das soluções para as placas principais. | |||||||||||
Tabela 5: Constituinte de cada poço no protocolo HTS.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Um | DMSO+W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | GA | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| Nota: 3-96 são códigos compostos para avaliar o potencial de inibição de Hsp90. GA = Geldanamicina. W=Água ultrapura | ||||||||||||
Tabela 6: Disposição da placa de poço para as placas principais 1 e 2 (sem Hsp90) e 3 e 4 (com Hsp90).
| Bem Constituinte | % de atividade da ATPase* | % de inibição |
| Hsp90 | 100 | 0.00 |
| GA(100 μM) | 17.46 | 82.55 |
| IG (20 μM) | 17.77 | 82.23 |
| GA(4 μM) | 18.27 | 81.73 |
| IG (0,8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| IG (0,16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| IG (0,032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| *Uma média de duas determinações independentes | ||
Tabela 7: Porcentagem de inibição e atividade ATPase da geldanamicina.
| Bem Constituinte | Abs (A) | Bem Constituinte | Abs (B) | B-A | % de atividade da ATPase* | % de inibição |
| Em branco | 0.281 | Controle negativo | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| IG (20 μM) | 0.295 | IG (20 μM)+Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| Composto 6 (100 μM) | 0.3 | Composto 6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| Composto 82 (100 μM) | 0.49 | Composto 82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| Composto 95 (100 μM) | 0.327 | Composto 95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
Tabela 8: Porcentagem de inibição e atividade da ATPase da geldanamicina e compostos selecionados.
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Discussion
Hsp90 é um alvo significativo para a descoberta de novas moléculas de drogas anticancerígenas. Desde que sua farmacogabilidade foi estabelecida em 199410, 18 moléculas chegaram a ser experimentadas clinicamente. Atualmente, sete moléculas estão em várias fases de ensaios clínicos, isoladamente ou em combinação22. Todas essas pequenas moléculas são inibidores de ligação do ATP N-terminal. Os outros meios de inibir a chaperona (inibidores C-terminais, inibidores do domínio médio) não procederam tão rápido quanto os inibidores N-terminais. Assim, os compostos inibidores de ligação do ATP N-terminal ainda mantêm a promessa de progressão para uma molécula clinicamente comercializável. Além disso, o único inibidor de Hsp90, aprovado em junho de 2022 (Pimitespib para o tratamento de GIST no Japão), é uma molécula N-terminal de ligação ao ATP9. No entanto, uma única molécula, até o momento, não atingiu um estágio comercializável em outras partes do mundo23,24. Existem várias razões principais para essa falha, incluindo questões de formulação, o custo de produção de moléculas, além da toxicidade, como ototoxicidade, e cardiotoxicidade associada a poucos compostos. Para superar esses efeitos adversos, inibidores seletivos N-terminal da Hsp90 (alfa e beta) estão sendo explorados25,26,27. Toda a discussão acima mencionada justifica a triagem HTS de compostos, que suprimirá a atividade da Hsp90 ligando-se à sua fenda de ligação ao ATP.
Os ensaios para a descoberta de drogas precisam ser rápidos, econômicos, sensíveis, facilmente reprodutíveis e utilizar produtos químicos e/ou condições menos perigosas. Além disso, ele deve ser convenientemente realizado em uma escala de laboratório, bem como em uma configuração HTS. Uma análise detalhada dos ensaios inibitórios de Hsp90 ATPase disponíveis foi realizada, e o ensaio de fosfato verde de malaquita foi considerado o mais adequado entre todos na configuração institucional dada. Os demais sistemas de ensaio não foram amigáveis à automação em um sistema HTS (enzima acoplada piruvato/lactato desidrogenase)28,29; dispendiosos como o ensaio de polarização fluorescente30, ensaios de proximidade de cintilação, ensaio de ressonância de plásmons de superfície e transferência de energia de ressonância de fluorescência resolvida no tempo (TR-FRET)28,29; como (TR-FRET)28,29; ou possuíam riscos de radiação, como ensaios de proximidade de cintilação28,29. Portanto, um ensaio simples de malaquita verde em escala laboratorial ou HTS para a identificação de novos inibidores de ligação ao ATP N-terminal de Hsp90 é apresentado neste protocolo.
A maior preocupação neste ensaio é a contaminação de tampões e extratos vegetais a serem avaliados com íons fosfato, o que pode levar a falsos resultados. A hidrólise não enzimática do ATP no pH da reação também pode levar a falsos resultados. Os problemas acima mencionados foram resolvidos com o uso de tampões livres de fosfato (pH 7,4). Adicionalmente, foi realizado um blank com tampão + água + DMSO e, posteriormente, subtraído o valor de absorbância dos compostos de controle positivo/amostra do valor de blank. Um cuidado que precisa ser seguido neste procedimento de ensaio é a adesão estrita à adição de reagentes, como a adição de ATP simultaneamente a cada poço via pipeta multicanal. Isto é para que a reação comece ao mesmo tempo em todos os poços, o mesmo tempo de incubação e, posteriormente, na mesma medição de absorbância após a adição do reagente verde de malaquita. A reação ATPase é altamente sensível ao tempo e, portanto, uma pequena mudança no tempo de início e término da reação, tempo de incubação e tempo para registrar a absorbância pode afetar drasticamente os resultados do ensaio. Além disso, a adição de 10 μL de solução de citrato de sódio a 34% (usada para extinguir a reação de ATPase) afeta a linearidade da curva padrão e, portanto, não foi incluída em nosso protocolo de ensaio.
A única limitação deste ensaio é a avaliação de compostos que demonstram absorbância superior à demonstrada pelo fosfato livre liberado de ATP pela levedura Hsp90 a 620 nm. Um falso positivo ou falso negativo pode resultar no caso de tais compostos. No entanto, as chances de encontrar tais compostos é muito rara. Isso pode ser problemático com a avaliação de extratos vegetais e/ou suas frações em particular, onde uma mistura de compostos está presente.
Em conclusão, o scale-up de escala laboratorial para HTS foi realizado com sucesso com a levedura Hsp90. O protocolo de ensaio passo a passo, tanto em escala laboratorial quanto em HTS, ajudará cientistas de todo o mundo a adotar esse procedimento para a descoberta de novos inibidores de Hsp90. Adicionalmente, o protocolo pode ser adaptado para a descoberta de inibidores de ATPase contra outras proteínas dependentes de ATP como Hsp70, Grp94, protease de Lon, Protease Ti, proteases AAA, etc31,32,33.
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Disclosures
Não há interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo programa Korea Research Fellowship (KRF), pós-doutorado da National Research Foundation of Korea (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência e ICT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Os autores agradecem à subvenção intramuros KIST e à subvenção número 2MRB130 do Ministério dos Oceanos e Pescas por fornecerem assistência financeira para este projeto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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