Summary
El protocolo de ensayo de verde de malaquita es un método simple y rentable para descubrir supresores de la proteína de choque térmico 90 (Hsp90), así como otros compuestos inhibidores contra enzimas dependientes de ATP.
Abstract
La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es un objetivo anticancerígeno prometedor debido a su efecto de acompañamiento en múltiples proteínas oncogénicas. La actividad de Hsp90 depende de su capacidad para hidrolizar trifosfato de adenosina (ATP) a difosfato de adenosina (ADP) y fosfato libre. La actividad ATPasa de Hsp90 está vinculada a su función de acompañamiento; El ATP se une al dominio N-terminal del Hsp90, y se encontró que interrumpir su enlace era la estrategia más exitosa para suprimir la función Hsp90. La actividad de la ATPasa se puede medir mediante un ensayo colorimétrico de verde de malaquita, que determina la cantidad de fosfato libre formado por hidrólisis de ATP. Aquí, se describe un procedimiento para determinar la actividad ATPasa de la levadura Hsp90 utilizando el kit de ensayo de fosfato verde de malaquita. Además, se proporcionan instrucciones detalladas para el descubrimiento de inhibidores de Hsp90 tomando geldanamicina como un inhibidor auténtico. Finalmente, se discute la aplicación de este protocolo de ensayo a través del cribado de alto rendimiento (HTS) de moléculas inhibidoras contra levadura Hsp90.
Introduction
La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es una chaperona molecular que mantiene la estabilidad de las proteínas responsables del desarrollo y la progresión del cáncer. Además, las proteínas responsables del desarrollo de resistencia a los agentes antineoplásicos también son clientes de Hsp901. Hsp90 se sobreexpresa ubicuamente en todos los tipos de células cancerosas (>90% de las proteínas celulares), en comparación con las células normales donde puede constituir menos del 2% del total de proteínas. Además, el Hsp90 de las células cancerosas reside en un complejo con co-chaperonas, mientras que en una célula normal está presente predominantemente en un estado libre y no complejado 2,3. En los últimos años, se ha demostrado que varios inhibidores de Hsp90 poseen efectos senolíticos en estudios in vitro e in vivo, donde han mejorado significativamente la vida útil de ratones 4,5,6. Todos los hallazgos antes mencionados corroboran el hecho de que los inhibidores de Hsp90 podrían ser efectivos en múltiples tipos de cáncer, con menos efectos adversos y menores posibilidades de desarrollar resistencia. La función de acompañamiento de Hsp90 se logra uniendo ATP en el dominio N-terminal de Hsp90 e hidrolizándolo en ADP y fosfato libre7. Se encontró que las moléculas pequeñas que se unen competitivamente al bolsillo de unión al ATP de Hsp90 suprimen con éxito el efecto de acompañamiento de la proteína. Hasta la fecha, esta sigue siendo la mejor estrategia para la inhibición de Hsp90, lo que está respaldado por el hecho de que tales inhibidores han alcanzado ensayos clínicos8. Uno de ellos, Pimitespib, fue aprobado en Japón para el tratamiento del tumor del estroma gastrointestinal (GIST) en junio de 20229. Este es el primer inhibidor de Hsp90 aprobado desde que se estableció la farmacogabilidad de la chaperona en 199410.
El ensayo verde de malaquita es un procedimiento simple, sensible, rápido y económico para la detección de fosfato inorgánico, adecuado para la automatización y el cribado de alto rendimiento (HTS) de compuestos contra su objetivo deseado11. El ensayo se ha empleado con éxito para el cribado de inhibidores de Hsp90 en pequeñas configuraciones a escala de laboratorio, así como en un HTS 12,13,14,15,16,17. El ensayo utiliza un método colorimétrico que determina el fosfato inorgánico libre formado debido a la actividad ATPasa de Hsp90. La base de esta cuantificación es la formación de un complejo de fosfomolibdato entre fosfato libre y molibdeno, que posteriormente reacciona con el verde malaquita para generar un color verde (Figura 1). Esta rápida formación de color se mide en un espectrofotómetro, o en un lector de placas, entre 600-660 nm18,19.
En el presente protocolo, se describe el procedimiento para llevar a cabo un ensayo de verde de malaquita con levadura Hsp90 y la posterior identificación de inhibidores contra la chaperona. La molécula de producto natural, geldanamicina (GA), con la que se estableció por primera vez la farmacogabilidad de Hsp90, fue tomada como un inhibidor auténtico10. HTS se ha convertido en una parte integral del programa actual de descubrimiento de fármacos, debido a la disponibilidad de un gran número de moléculas para pruebas. Esta técnica ha ganado más importancia en los últimos 2 años debido a la necesidad urgente de reutilizar medicamentos para tratar la infección por Covid-1920,21. Por lo tanto, se presenta un esquema detallado para el HTS de moléculas contra la proteína Hsp90 de levadura mediante la adopción del método de ensayo verde de malaquita.
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Protocol
1. Ensayo de verde de malaquita a escala de laboratorio
- Preparación del tampón de ensayo
- Prepare el tampón del ensayo, según la composición y preparación presentadas en la Tabla 1.
- Preparación de patrones de fosfato
- Utilice el estándar de fosfato de 1 mM, proporcionado en el kit de ensayo de fosfato de ensayo verde de malaquita (almacenado a 4 °C).
- Pipetear 40 μL de 1 mM de fosfato patrón en 960 μL de agua ultrapura para obtener 40 μM de solución de fosfato (solución de premezcla). Agregue la solución de premezcla con agua ultrapura, según las instrucciones del fabricante, para formar una dilución en serie de fosfato de 0 a 40 μM.
- Preparación de levadura Hsp90
- Use levadura Hsp90 con una concentración de glicerol de 0.66 mg / ml. Descongelar sobre hielo justo antes de usar.
- Use 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) de levadura Hsp90 para la actividad medible de la ATPasa. Compruebe que la diferencia de densidad óptica después de la adición del reactivo verde de malaquita entre el blanco y el control positivo es de al menos 0,5 y menos de 1,0. Aquí, la diferencia de absorbancia entre el blanco (sin Hsp90) y el control positivo (con Hsp90) se encontró que era 0.510.
- Preparación de ATP
- Transfiera 1 mg de ATP a un vial que contenga 453,39 μL de agua ultrapura para obtener 4 mM de solución madre. Realizar cálculos de peso basados en ATP anhidro (peso molecular [m.w.] = 551.14). Prepare ATP fresco, ya que puede hidrolizarse espontáneamente con el tiempo.
- Añadir 4 μL de solución madre de ATP a cada pocillo para obtener una concentración final del pozo de 0,2 mM (volumen total final del pozo de ensayo de 80 μL). Añadir ATP como último componente a la reacción, utilizando una pipeta multicanal para que todas las reacciones comiencen simultáneamente.
- Preparación de geldanamicina (GA)
- Preparar una reserva de 10 mM de AG disolviendo 1 mg en 178,37 μL de DMSO (m.w. = 560,64). Usando la solución madre, prepare 4 mM, 0.8 mM, 0.16 mM, 0.032 mM, 0.0064 mM y 0.00128 mM en solución DMSO por dilución en serie.
- Agregue 2 μL de estas soluciones madre a cada pozo para obtener una concentración final del pozo de 0.1 mM, 0.02 mM, 0.004 mM, 0.0008 mM, 0.00016 mM y 0.000032 mM, respectivamente.
- Prepare los pozos como se describe en la Tabla 2 y la Tabla 3, con los pozos que contienen el espacio en blanco (tampón + agua + DMSO) y el control negativo (Hsp90 en tampón + agua + DMSO). Los pozos que contienen GA (Hsp90 en tampón + agua + GA) sirven como control positivo.
- Preparación de placas de pozo y orden de adición
- Prepare placas de 96 pocillos con el diseño presentado en la Tabla 2. Para los compuestos que muestran absorbancia a 620 nm, prepare un pocillo separado para registrar la absorbancia en esta longitud de onda. No prepare un pocillo separado para GA, ya que GA no muestra absorbancia a 620 nm para la concentración utilizada en el ensayo.
- Prepare cada componente con el volumen total de cada constituyente, como se presenta en la Tabla 3.
- Establezca pozos de ensayo agregando agua ultrapura a cada pozo. Después de esto, agregue la cantidad requerida de tampón de ensayo y una solución compuesta (por ejemplo, solución GA).
- Luego, agregue Hsp90 a los pocillos apropiados y agite las placas durante 2 minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente.
- Añadir 4 μL de solución de ATP con una pipeta multicanal. Envuelva la placa en papel de aluminio y agite durante 2 minutos en un agitador de placas (200 rpm) a temperatura ambiente. Incubar la placa a 37 °C durante 3 h.
- Preparación y adición de reactivo verde de malaquita
- El reactivo verde de malaquita consiste en los reactivos A (molibdato de amonio en HCl 3M) y B (verde de malaquita y alcohol polivinílico). Lleve el reactivo a temperatura ambiente antes de usarlo. Mezclar los reactivos A y B en una proporción de 100:1 (1.000 μL:10 μL). Prepare esto dentro de las 3 h antes de su uso, ya que es inestable y comienza a descomponerse después de 3 h.
- Después de 3 h del paso 1.6.5, detener la reacción añadiendo 20 μL de reactivo verde de malaquita, añadido en el mismo orden que el ATP, utilizando una pipeta multicanal.
- Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, mida la absorbancia de la placa a 620 nm en un lector de placas.
2. Cribado de alto rendimiento de inhibidores de Hsp90 mediante ensayo de verde de malaquita
NOTA: El protocolo para la detección de alto rendimiento es similar a la metodología a escala de laboratorio. El volumen final del pozo en cada caso es de 80 μL. Sin embargo, hay una ligera diferencia en el orden de la adición de reactivos. En el método basado en escala de laboratorio, hay cinco etapas de adición de solución (34 μL de agua, 32 μL de tampón, 2 μL de compuesto en DMSO, 8 μL de Hsp90 y finalmente 4 μL de solución de ATP). En contraste, con HTS hay tres etapas de adición (40 μL de solución tampón que contiene levadura Hsp90, 2 μL de DMSO en 18 μL de agua que contienen los compuestos, y finalmente 20 μL de ATP disuelto en agua). La cantidad mínima de solución que se puede pipetear con precisión en la configuración HTS es de 20 μL. Por lo tanto, se observa una diferencia en el pipeteo entre las escalas de laboratorio y HTS.
- Preparación del tampón de ensayo (pH 7.4)
- Utilice el mismo tampón en HTS que para el ensayo de verde de malaquita a escala de laboratorio (Tabla 1).
- Preparación de levadura Hsp90
- Use proteínas con una concentración de glicerol de 0.66 mg / ml. Descongelar sobre hielo justo antes de usar.
- Use 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) de levadura Hsp90 en cada pocillo, lo que proporciona una actividad ATPasa medible.
- Diluir la proteína (8 μL) en tampón (32 μL) para cada pocillo. El volumen total de trabajo final para cada pocillo es de 40 μL en un volumen total de ensayo de 80 μL.
- Preparación de 0.8 mM ATP
- Disolver 1 mg de ATP en 2.267 μL de agua destilada para obtener una solución de 0,8 mM. El volumen total de trabajo para cada pocillo es de 20 μL en un volumen total de ensayo de 80 μL.
- Preparación de geldanamicina (GA)/compuestos problema
- Prepare un stock de 0,8 mM de GA en DMSO, como en el paso 1.5. Diluir 10 μL de la cepa de GA con 90 μL de agua para obtener una concentración final de 80 μM.
- Utilizar 20 μL de la solución de GA de 80 μM en pocillos de ensayo apropiados (volumen total final del pozo de ensayo = 80 μL), dando una concentración final del pocillo de 20 μM. Esto sirve como un control positivo.
- Para los compuestos de ensayo, preparar soluciones en DMSO según su concentración deseada para la evaluación.
- Preparar 10 μL de DMSO en 90 μL de agua para agregar a pozos en blanco (tampón + agua + DMSO) y control negativo (Hsp90 en tampón + agua + DMSO). Preparar los compuestos de ensayo de manera similar a una concentración final de pocillo de 100 μM.
- Diseño de placas de ensayo y orden de adición
- Utilice cuatro placas principales, una placa compuesta y cuatro placas de adición que contengan existencias de reactivos para configurar el ensayo (Figura 2 y Tabla 4).
- Además, la placa A, agregue 90 μL de tampón de ensayo en cada pocillo; además de la placa B, añadir 90 μL de tampón con Hsp90 en cada pocillo; además de las placas C y D, añadir 90 μL de ATP y 90 μL de reactivo verde malaquita, respectivamente, en cada pocillo (Tabla 5 y Tabla 6).
- Desde la placa de adición A y la placa B, transferir 40 μL de solución de cada pocillo a la placa principal 1 y 2, y 3 y 4, respectivamente, utilizando un sistema de dosificación multicanal automatizado. Aquí se utilizó la estación de trabajo de automatización de laboratorio Biomek(R) FXP (Figura 2 y Tabla 6).
- Desde cada pocillo de la placa compuesta, transfiera 20 μL de la solución a las placas principales 1, 2, 3 y 4 (Figura 2). Agite los platos durante 1 minuto en una coctelera (200 rpm).
- Desde cada pocillo de la placa de adición C (ATP), transfiera 20 μL de solución a las placas principales 1, 2, 3 y 4 (Figura 2). Agite los platos durante 1 minuto en una coctelera (200 rpm).
- Incubar las placas durante 3 h a 37 °C.
- Preparar el reactivo verde de malaquita según el paso 1.7. Después de 3 h, transferir 20 μL de reactivo verde de malaquita de la placa de adición D a los pocillos de las placas principales 1, 2, 3 y 4 (Figura 2).
- Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, medir la absorbancia de la placa es de 620 nm en un lector de placas.
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Representative Results
Los resultados del ensayo se interpretan en términos de absorbancia debido a la concentración de iones fosfato libres. La absorbancia por fosfato libre debido a la hidrólisis de ATP por la levadura Hsp90 a 620 nm se considera como 100% de actividad ATPasa, o inhibición de proteína de porcentaje cero. La inhibición de la proteína conduce al cese de la hidrólisis del ATP (menos fosfato libre). que se refleja en términos de disminución de la absorbancia a 620 nm.
Resultados del ensayo de verde de malaquita a escala de laboratorio
El gráfico estándar para el estándar de fosfato se representa en la Figura 3. La actividad de Hsp90 se mide en términos de su capacidad para hidrolizar ATP a ADP y fosfato inorgánico (Pi). Una mayor concentración de fosfato libre conduce a un aumento en la formación de complejos con verde malaquita, lo que provoca un color verde intenso detectable a 620 nm (Figura 4).
El porcentaje de inhibición se calcula mediante la siguiente ecuación:
% Inhibición 
La absorbancia de Hsp90 se consideró como inhibición de porcentaje cero (actividad ATPasa 100%). El porcentaje de actividad de la ATPasa se utiliza para medir la inhibición dependiente de la dosis de la proteína por GA. Se observó que el AG inhibió la proteína de manera dependiente de la dosis, con un valor de IC50 de 0,85 μM (Figura 5 y Tabla 7).
El enfoque de curva sigmoidal del software gráfico se utilizó para determinar el valor de IC 50 (concentración en la que las moléculas exhiben el50 % de la actividad de la ATPasa Hsp90).
Resultados del cribado de alto rendimiento (HTS) de inhibidores de Hsp90 mediante ensayo de verde de malaquita
El HTS se llevó a cabo con compuestos de ensayo (códigos 3 a 96) por duplicado tomando GA (concentración final de pozo de 20 μM) como patrón de referencia. No se conocía la absorbancia a 620 nm de los compuestos y, por lo tanto, se registró la absorbancia de los compuestos solos (placas principales 1 y 2; Figura 6). El valor de absorbancia para cada pocillo de las placas principales 3 y 4 (con Hsp90; Figura 7) se dedujo de la absorbancia correspondiente en las placas 1 y 2 (compuesto solo). La absorbancia de Hsp90 se consideró como 100% actividad ATPasa.
El porcentaje de inhibición se calculó utilizando la siguiente fórmula:
% Inhibición
La concentración de GA de 20 μM demostró una inhibición del 75,82%. Un 100 μM del compuesto 82 mostró una inhibición del 100% de la proteína Hsp90 de la levadura, mientras que los compuestos 6 y 95 exhibieron una inhibición del 73,07% y 62,88%, respectivamente, a 100 μM (Tabla 8). Los otros compuestos suprimieron la proteína en menos del 50% a 100 μM y se consideraron inactivos.
Figura 1: Reacciones del reactivo verde de malaquita (MG). (A) Estructura del verde de malaquita. (B) Reacciones del reactivo verde de malaquita A (molibdato de amonio en HCl 3 M) con Pi, y reacción posterior con el reactivo B (verde de malaquita en alcohol polivinílico). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema experimental para el protocolo HTS. La figura representa el orden de adición de reactivos a la placa de ensayo principal de las placas de adición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Gráfica estándar para la concentración estándar de fosfato. El eje X representa la concentración de Pi en micromolar, y la absorbancia a 620 nm se representa en el eje Y. Las barras de error representan la desviación entre los dos números de muestra (n = 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Desarrollo del color después de la adición del reactivo verde malaquita. El color verde se vuelve más intenso con alta concentración de fosfato y más actividad de ATPasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cálculo de IC50 para geldanamicina frente a levadura Hsp90. Cada punto es una media de dos determinaciones (n = 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Desarrollo del color después de la adición del reactivo verde malaquita . (A) Desarrollo del color en la placa principal 1. El color rosa en el pozo A11 se debe al color compuesto. (B) Desarrollo del color en la placa principal 2. El color rosa en el pozo A11 se debe a la naturaleza coloreada del compuesto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Desarrollo del color después de la adición del reactivo verde malaquita. Desarrollo del color después de la adición del reactivo verde malaquita. (A) Desarrollo del color en la placa principal 3. (B) Desarrollo del color en la placa principal 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución de stock | Conc. final | Dilución (final/stock) | Cantidad necesaria para el stock de 100 ml (dilución × volumen total) |
| 1000 mM Tris-HCl, pH 7.4 | 200 mM | 0.2 | 20 ml |
| 1000 mM KCl | 40 mM | 0.04 | 4 ml |
| 1000 mM MgCl2 | 12 mM | 0.012 | 1,2 ml |
| Agua ultrapura | NA | NA | Añadir a 100 ml volumen total |
Tabla 1: Preparación del tampón de ensayo.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Un | Agua ultrapura | Agua ultrapura | Espacio en blanco | Espacio en blanco | |
| B | 4 μM PB | 4 μM PB | Control negativo | Control negativo | |
| C | 8 μM PB | 8 μM PB | GA(100 μM) + Hsp90 | GA(100 μM) + Hsp90 | |
| D | 12 μM PB | 12 μM PB | GA(20 μM) + Hsp90 | GA(20 μM) + Hsp90 | |
| E | 16 μM PB | 16 μM PB | GA(4 μM) + Hsp90 | GA(4 μM) + Hsp90 | |
| F | 24 μM PB | 24 μM PB | GA(0,8 μM) + Hsp90 | GA(0,8 μM) + Hsp90 | |
| G | 32 μM PB | 32 μM PB | GA(0,16 μM) + Hsp90 | GA(0,16 μM) + Hsp90 | |
| H | 40 μM PB | 40 μM PB | GA(0,032 μM) + Hsp90 | GA(0,032 μM) + Hsp90 | |
| Nota: El volumen total del pozo es de 80 μL. PB = Estándar de tampón fosfato. | |||||
Tabla 2: El diseño de la placa de 96 pocillos.
| # | Espacio en blanco | Control negativo | Levadura Hsp90 + GA |
| Tampón de ensayo | 40 μL | 32 μL | 32 μL |
| DMSO | 2 μL | 2 μL | - |
| GA | - | - | 2 μL |
| Hsp90 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mM) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| Agua ultrapura | 34 μL | 34 μL | 34 μL |
| Volumen total | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
Cuadro 3: Constituyente de cada pozo.
| ID de placa | Explicación |
| 1 | Placa principal que contiene compuesto |
| 2 | Placa principal que contiene compuesto (duplicado de la placa 1) |
| 3 | Placa principal con Hsp90 y compuesto |
| 4 | Placa principal con Hsp90 y compuesto (duplicado de la placa 3) |
| CP | Solución compuesta |
| Un | Solución tampón |
| B | Solución tampón con Hsp90 |
| C | Solución ATP |
| D | Solución reactiva verde de malaquita |
| Nota: Todas las placas son transparentes de 96 pocillos. Placa principal: placas donde tiene lugar la reacción final de la ATPasa. Las placas CP, A, B, C y D son placas de adición que contienen reactivos específicos. | |
Tabla 4: Tipos de placas utilizadas en el ensayo HTS.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | CP | Un | B | C | D | ||
| Solución compuesta/GA en 1:10 DMSO:agua | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 90 μL | - | - | - | - | ||
| Solución Hsp90: solución tampón (1:4) | - | - | 40 μL | 40 μL | - | - | 90 μL | - | - | ||
| Solución tampón | 40 μL | 40 μL | - | - | - | 90 μL | - | - | - | ||
| ATP (0,8 mM) | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | - | - | - | 90 μL | - | ||
| Reactivo verde de malaquita | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 μL | ||
| Volumen total | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | ||
| Nota: GA = Geldanamicina. Para las placas de adición CP, A, B, C y D, se toman 10 μL adicionales para la transferencia perfecta de soluciones a las placas principales. | |||||||||||
Cuadro 5: Constituyente de cada pozo en el protocolo HTS.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Un | DMSO+W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | GA | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| Nota: 3-96 son códigos compuestos para evaluar el potencial de inhibición de Hsp90. GA = Geldanamicina. W = Agua ultrapura | ||||||||||||
Cuadro 6: Bien disposición de la placa para la placa principal 1 y 2 (sin Hsp90), y 3 y 4 (con Hsp90).
| Bien Constituyente | % de actividad ATPasa* | % de inhibición |
| Hsp90 | 100 | 0.00 |
| GA(100 μM) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 μM) | 17.77 | 82.23 |
| GA(4 μM) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0,8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0,16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0,032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| *Una media de dos determinación independiente | ||
Cuadro 7: Porcentaje de inhibición y actividad ATPasa de geldanamicina.
| Bien Constituyente | Abdominales (A) | Bien Constituyente | Abdominales (B) | B-A | % de actividad ATPasa* | % de inhibición |
| Espacio en blanco | 0.281 | Control negativo | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 μM) | 0.295 | GA (20 μM)+Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| Compuesto 6 (100 μM) | 0.3 | Compuesto 6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| Compuesto 82 (100 μM) | 0.49 | Compuesto 82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| Compuesto 95 (100 μM) | 0.327 | Compuesto 95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
Cuadro 8: Porcentaje de inhibición y actividad ATPasa de geldanamicina y compuestos seleccionados.
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Discussion
Hsp90 es un objetivo importante para el descubrimiento de nuevas moléculas de fármacos contra el cáncer. Desde que se estableció su farmacogabilidad en 199410, 18 moléculas han llegado a ensayos clínicos. En la actualidad, siete moléculas se encuentran en diversas fases de ensayos clínicos, ya sea solas o en combinación22. Todas estas moléculas pequeñas son inhibidores de unión al ATP N-terminal. Los otros medios para inhibir la chaperona (inhibidores C-terminales, inhibidores de dominio medio) no han procedido tan rápido como los inhibidores N-terminales. Por lo tanto, los compuestos inhibidores de unión al ATP N-terminal siguen siendo prometedores de progresión a una molécula clínicamente comercializable. Además, el único inhibidor de Hsp90, aprobado en junio de 2022 (Pimitespib para el tratamiento de GIST en Japón), es una molécula de unión a ATP N-terminal9. Sin embargo, una sola molécula, hasta la fecha, no ha alcanzado una etapa comercializable en otras partes del mundo23,24. Hay varias razones principales para este fracaso, incluidos los problemas de formulación, el costo de producir moléculas además de la toxicidad, como la ototoxicidad y la cardiotoxicidad asociada con pocos compuestos. Para superar estos efectos adversos, los inhibidores selectivos N-terminales Hsp90 (alfa y beta) están siendo explorados 25,26,27. Toda la discusión antes mencionada justifica el cribado HTS de compuestos, que suprimirá la actividad de Hsp90 al unirse a su hendidura de unión de ATP.
Los ensayos para el descubrimiento de fármacos deben ser rápidos, rentables, sensibles, fácilmente reproducibles y utilizar productos químicos y/o condiciones menos peligrosos. Además, debe llevarse a cabo convenientemente a escala de laboratorio, así como en una configuración HTS. Se realizó un análisis detallado de los ensayos inhibidores de la Hsp90 ATPasa disponibles, y se encontró que el ensayo de fosfato verde de malaquita era el más adecuado entre todos en la configuración institucional dada. Los otros sistemas de ensayo no fueron amigables con la automatización en un sistema HTS (enzima acoplada piruvato/lactato deshidrogenasa)28,29; costosos como el ensayo de polarización de fluorescencia30, los ensayos de proximidad de centelleo, el ensayo de resonancia de plasmones de superficie y la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET)28,29; consume mucho tiempo como (TR-FRET)28,29; o poseía riesgos de radiación como ensayos de proximidad de centelleo28,29. Por lo tanto, en este protocolo se presenta un ensayo simple de verde de malaquita como escala de laboratorio o HTS para la identificación de nuevos inhibidores de unión a ATP N-terminal Hsp90.
La principal preocupación en este ensayo es la contaminación de tampones y extractos de plantas que deben evaluarse con iones fosfato, lo que puede conducir a resultados falsos. La hidrólisis no enzimática del ATP en el pH de reacción también puede conducir a resultados falsos. Los problemas antes mencionados se resolvieron mediante el uso de tampones libres de fosfato (pH 7.4). Además, se realizó un blanco con tampón + agua + DMSO, y posteriormente se restó el valor de absorbancia de los compuestos de control positivo/muestra del valor en blanco. Una precaución que debe seguirse en este procedimiento de ensayo es el cumplimiento estricto de la adición de reactivos, como la adición de ATP simultáneamente a cada pocillo a través de pipetas multicanal. Esto es para que la reacción comience al mismo tiempo en cada pozo, el mismo tiempo de incubación, y posteriormente en la misma medida de absorbancia después de la adición del reactivo verde de malaquita. La reacción ATPasa es altamente sensible al tiempo y, por lo tanto, un ligero cambio en el tiempo de inicio y terminación de la reacción, el tiempo de incubación y el tiempo para registrar la absorbancia puede afectar drásticamente los resultados del ensayo. Además, la adición de 10 μL de solución de citrato de sodio al 34% (utilizada para enfriar la reacción ATPasa) afecta la linealidad de la curva estándar y, por lo tanto, no se incluyó en nuestro protocolo de ensayo.
La única limitación de este ensayo es la evaluación de compuestos que demuestran absorbancia superior a la mostrada por el fosfato libre liberado de ATP por la levadura Hsp90 a 620 nm. Un falso positivo o falso negativo puede resultar en el caso de tales compuestos. Sin embargo, las posibilidades de encontrar tales compuestos son muy raras. Esto puede ser problemático con la evaluación de extractos de plantas y / o sus fracciones en particular, donde hay una mezcla de compuestos presentes.
En conclusión, el escalado de escala de laboratorio a HTS se llevó a cabo con éxito con levadura Hsp90. El protocolo de ensayo paso a paso a escala de laboratorio, así como en HTS, ayudará a los científicos de todo el mundo a adoptar este procedimiento para el descubrimiento de nuevos inhibidores de Hsp90. Además, el protocolo puede adaptarse para el descubrimiento de inhibidores de ATPasa contra otras proteínas dependientes de ATP como Hsp70, Grp94, Lon proteasa, Proteasa Ti, proteasas AAA, etc31,32,33.
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Disclosures
No hay intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el programa Korea Research Fellowship (KRF), becario postdoctoral de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Los autores agradecen la subvención intramuros de KIST y la subvención número 2MRB130 del Ministerio de Océanos y Pesca por proporcionar asistencia financiera para este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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