Summary
Het malachiet green assay protocol is een eenvoudige en kosteneffectieve methode om heat shock protein 90 (Hsp90) suppressors te ontdekken, evenals andere remmers tegen ATP-afhankelijke enzymen.
Abstract
Heat shock protein 90 (Hsp90) is een veelbelovend doelwit tegen kanker vanwege het chaperonerende effect op meerdere oncogene eiwitten. De activiteit van Hsp90 is afhankelijk van het vermogen om adenosinetrifosfaat (ATP) te hydrolyseren tot adenosinedifosfaat (ADP) en vrij fosfaat. De ATPase-activiteit van Hsp90 is gekoppeld aan zijn chaperoningfunctie; ATP bindt aan het N-terminale domein van de Hsp90 en het verstoren van de binding bleek de meest succesvolle strategie te zijn in het onderdrukken van de Hsp90-functie. De ATPase-activiteit kan worden gemeten met een colorimetrische malachietgroene assay, die de hoeveelheid vrij fosfaat bepaalt die wordt gevormd door ATP-hydrolyse. Hier wordt een procedure beschreven voor het bepalen van de ATPase-activiteit van gist Hsp90 met behulp van de malachietgroene fosfaattestkit. Verder worden gedetailleerde instructies gegeven voor de ontdekking van Hsp90-remmers door geldanamycine als een authentieke remmer te nemen. Tot slot wordt de toepassing van dit assay protocol door middel van de high-throughput screening (HTS) van remmermoleculen tegen gist Hsp90 besproken.
Introduction
Heat shock protein 90 (Hsp90) is een moleculaire chaperonne die de stabiliteit van eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling en progressie van kanker handhaaft. Daarnaast zijn eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van resistentie tegen antineoplastische middelen ook klanten van Hsp901. Hsp90 wordt alomtegenwoordig overexpressie gegeven in alle soorten kankercellen (>90% van de cellulaire eiwitten), vergeleken met normale cellen waar het minder dan 2% van de totale eiwitten kan vormen. Bovendien bevindt de Hsp90 van kankercellen zich in een complex met co-chaperones, terwijl het in een normale cel voornamelijk aanwezig is in een vrije, niet-gecomplexeerde toestand 2,3. In de afgelopen jaren is aangetoond dat verschillende Hsp90-remmers senolytische effecten hebben in in vitro en in vivo studies, waar ze de levensduur van muizen aanzienlijk hebben verbeterd 4,5,6. Alle bovengenoemde bevindingen onderbouwen het feit dat Hsp90-remmers effectief kunnen zijn bij meerdere soorten kanker, met minder bijwerkingen en verminderde kans op het ontwikkelen van resistentie. De chaperoningfunctie van Hsp90 wordt bereikt door ATP te binden aan het N-terminale domein van Hsp90 en het te hydrolyseren tot ADP en vrij fosfaat7. Kleine moleculen die competitief binden aan de ATP-bindingspocket van Hsp90 bleken met succes het chaperoning-effect van het eiwit te onderdrukken. Tot op heden blijft dit de beste strategie voor Hsp90-remming, wat wordt ondersteund door het feit dat dergelijke remmers klinische onderzoeken hebben bereikt8. Een daarvan, Pimitespib, werd in juni 2022 in Japan goedgekeurd voor de behandeling van gastro-intestinale stromale tumor (GIST)9. Dit is de eerste Hsp90-remmer die is goedgekeurd sinds de druggability van de chaperonne werd vastgesteld in 199410.
De malachietgroene test is een eenvoudige, gevoelige, snelle en goedkope procedure voor de detectie van anorganisch fosfaat, geschikt voor automatisering en high-throughput screening (HTS) van verbindingen tegen het gewenste doel11. De test is met succes gebruikt voor de screening van Hsp90-remmers in kleine laboratoriumopstellingen, evenals in een HTS 12,13,14,15,16,17. De test maakt gebruik van een colorimetrische methode die het vrije anorganische fosfaat bepaalt dat wordt gevormd door de ATPase-activiteit van Hsp90. De basis van deze kwantificering is de vorming van een fosfolybdaatcomplex tussen vrij fosfaat en molybdeen, dat vervolgens reageert met malachietgroen om een groene kleur te genereren (figuur 1). Deze snelle kleurvorming wordt gemeten op een spectrofotometer, of op een plaatlezer, tussen 600-660 nm18,19.
In dit protocol wordt de procedure beschreven voor het uitvoeren van een malachietgroene test met gist Hsp90 en de daaropvolgende identificatie van remmers tegen de chaperonne. Het natuurlijke productmolecuul, geldanamycine (GA), waarmee de druggability van Hsp90 voor het eerst werd vastgesteld, werd als een authentieke remmer10 genomen. HTS is een integraal onderdeel geworden van het huidige programma voor het ontdekken van geneesmiddelen, vanwege de beschikbaarheid van een groot aantal moleculen voor testen. Deze techniek heeft de afgelopen 2 jaar meer betekenis gekregen vanwege de dringende behoefte aan herbestemming van geneesmiddelen voor de behandeling van Covid-19-infectie20,21. Daarom wordt een gedetailleerd overzicht gepresenteerd voor de HTS van moleculen tegen gist Hsp90-eiwit door de malachietgroene testmethode toe te passen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Malachiet groene test op laboratoriumschaal
- Voorbereiding van de testbuffer
- Bereid de testbuffer voor, volgens de samenstelling en het preparaat in tabel 1.
- Opstellen van fosfaatnormen
- Gebruik de fosfaatstandaard van 1 mM, geleverd in de alachietgroene testfosfaattestkit (bewaard bij 4 °C).
- Pipetteer 40 μL van 1 mM fosfaatstandaard in 960 μL ultrazuiver water om 40 μM fosfaatoplossing (premixoplossing) te verkrijgen. Voeg de premixoplossing toe met ultrazuiver water, volgens de instructies van de fabrikant, om een seriële verdunning van fosfaat van 0 tot 40 μM te vormen.
- Bereiding van gist Hsp90
- Gebruik gist Hsp90 met een glycerolvoorraadconcentratie van 0,66 mg/ml. Ontdooi op ijs vlak voor gebruik.
- Gebruik 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) gist Hsp90 voor meetbare ATPase-activiteit. Controleer of het optische dichtheidsverschil na toevoeging van malachietgroen reagens tussen de blanco en positieve controle ten minste 0,5 en minder dan 1,0 bedraagt. Hier bleek het absorptieverschil tussen de blanco (zonder Hsp90) en positieve controle (met Hsp90) 0,510 te zijn.
- Voorbereiding van ATP
- Breng 1 mg ATP over in een injectieflacon met 453,39 μl ultrazuiver water om 4 mM stamoplossing te verkrijgen. Voer gewichtsberekeningen uit op basis van watervrije ATP (molecuulgewicht [m.w.] = 551,14). Bereid ATP vers, omdat het na verloop van tijd spontaan kan hydrolyseren.
- Voeg 4 μL ATP-stamoplossing toe aan elke put om een uiteindelijke putconcentratie van 0,2 mM te verkrijgen (uiteindelijk totaal testputvolume van 80 μL). Voeg ATP als laatste component toe aan de reactie, met behulp van een meerkanaalspipet, zodat alle reacties tegelijkertijd beginnen.
- Bereiding van geldanamycine (GA)
- Bereid een voorraad GA van 10 mM door 1 mg op te lossen in 178,37 μL DMSO (m.w. = 560,64). Bereid met behulp van de stamoplossing 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM en 0,00128 mM-oplossing in DMSO door seriële verdunning.
- Voeg 2 μL van deze stamoplossingen toe aan elke put om een uiteindelijke putconcentratie van respectievelijk 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM en 0,000032 mM te verkrijgen.
- Bereid de putten voor zoals beschreven in tabel 2 en tabel 3, met de putten die de blanco (buffer + water + DMSO) en negatieve controle (Hsp90 in buffer + water + DMSO) bevatten. De putten met GA (Hsp90 in buffer + water + GA) dienen als positieve controle.
- Voorbereiding van putplaten en volgorde van toevoeging
- Bereid borden met 96 putten voor met de lay-out in tabel 2. Voor verbindingen die absorptie vertonen bij 620 nm, bereidt u een aparte put voor voor het registreren van de absorptie op deze golflengte. Bereid geen aparte put voor GA, omdat GA geen absorptie vertoont bij 620 nm voor de concentratie die in de test wordt gebruikt.
- Bereid elk bestanddeel met het totale volume van elk bestanddeel, zoals weergegeven in tabel 3.
- Stel testputten in door ultrazuiver water aan elke put toe te voegen. Voeg hierna de vereiste hoeveelheid testbuffer en een samengestelde oplossing (bijvoorbeeld GA-oplossing) toe.
- Voeg vervolgens Hsp90 toe aan de juiste putten en schud de platen gedurende 2 minuten op een plaatschudder bij kamertemperatuur.
- Voeg 4 μL ATP-oplossing toe met behulp van een meerkanaals pipet. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en schud gedurende 2 minuten op een plaatschudder (200 rpm) bij kamertemperatuur. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 3 uur.
- Bereiding en toevoeging van malachietgroen reagens
- Het malachietgroene reagens bestaat uit reagentia A (ammoniummolybdaat in 3M HCl) en B (malachietgroen en polyvinylalcohol). Breng het reagens voor gebruik op kamertemperatuur. Meng reagentia A en B in een verhouding van 100:1 (1.000 μL:10 μL). Bereid dit binnen 3 uur voor gebruik voor, omdat het onstabiel is en na 3 uur begint te ontbinden.
- Stop na 3 uur van stap 1.6.5 de reactie door 20 μL malachietgroen reagens toe te voegen, toegevoegd in dezelfde volgorde als ATP, met behulp van een meerkanaalspipet.
- Meet na een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur de absorptie van de plaat bij 620 nm in een plaatlezer.
2. High-throughput screening van Hsp90-remmers door malachiet groene assay
OPMERKING: Het protocol voor screening met hoge doorvoer is vergelijkbaar met de methodologie op laboratoriumschaal. Het uiteindelijke putvolume is in elk geval 80 μL. Er is echter een klein verschil in de volgorde van de toevoeging van reagentia. In de op laboratoriumschaal gebaseerde methode zijn er vijf stadia van toevoeging van de oplossing (34 μL water, 32 μL buffer, 2 μL-verbinding in DMSO, 8 μL Hsp90 en ten slotte 4 μL ATP-oplossing). Bij HTS daarentegen zijn er drie stadia van toevoeging (40 μL bufferoplossing met gist Hsp90, 2 μL DMSO in 18 μL water dat de verbindingen bevat, en ten slotte 20 μL ATP opgelost in water). De minimale hoeveelheid oplossing die nauwkeurig kan worden gepipetteerd in de HTS-opstelling is 20 μL. Vandaar dat een verschil in pipetteren tussen laboratorium- en HTS-schalen wordt waargenomen.
- Bereiding van de testbuffer (pH 7,4)
- Gebruik dezelfde buffer in HTS als voor de malachietgroene test op laboratoriumschaal (tabel 1).
- Bereiding van gist Hsp90
- Gebruik eiwit met een glycerolvoorraadconcentratie van 0,66 mg / ml. Ontdooi op ijs vlak voor gebruik.
- Gebruik 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) gist Hsp90 in elk putje, wat meetbare ATPase-activiteit oplevert.
- Verdun het eiwit (8 μL) in buffer (32 μL) voor elk putje. Het uiteindelijke totale werkvolume voor elke put is 40 μL bij een totaal testvolume van 80 μL.
- Bereiding van 0,8 mM ATP
- Los 1 mg ATP op in 2.267 μL gedestilleerd water om een oplossing van 0,8 mM te verkrijgen. Het totale werkvolume voor elke put is 20 μL bij een totaal testvolume van 80 μL.
- Bereiding van geldanamycine (GA)/teststoffen
- Bereid een voorraad GA van 0,8 mM voor in DMSO, zoals in stap 1.5. Verdun 10 μL van de GA-bouillon met 90 μL water tot een eindconcentratie van 80 μM.
- Gebruik 20 μL van de 80 μM GA-oplossing in geschikte testputten (eindtotaal testputvolume = 80 μL), wat een uiteindelijke putconcentratie van 20 μM oplevert. Dit dient als een positieve controle.
- Bereid voor teststoffen oplossingen in DMSO volgens de gewenste concentratie voor evaluatie.
- Bereid 10 μL DMSO voor in 90 μL water voor toevoeging aan blanco (buffer + water + DMSO) en negatieve controleputten (Hsp90 in buffer + water + DMSO). Bereid de teststoffen op vergelijkbare wijze bij een uiteindelijke putconcentratie van 100 μM.
- Ontwerp van de testplaten en volgorde van toevoeging
- Gebruik vier hoofdplaten, één samengestelde plaat en vier additieplaten met voorraden reagentia om de bepaling op te zetten (figuur 2 en tabel 4).
- Voeg bovendien op plaat A 90 μL testbuffer toe in elk put; voeg bovendien plaat B 90 μL buffer met Hsp90 toe in elk putje; voeg bovendien in de platen C en D respectievelijk 90 μl ATP en 90 μl malachietgroen reagens toe in elk putje (tabel 5 en tabel 6).
- Breng vanaf additieplaat A en plaat B 40 μL oplossing over van elke put naar hoofdplaat 1 en 2, respectievelijk 3 en 4, met behulp van een geautomatiseerd meerkanaals doseersysteem. Hier is gebruik gemaakt van het Biomek(R) FXP laboratoriumautomatiseringswerkstation (figuur 2 en tabel 6).
- Breng vanuit elk putje van de samengestelde plaat 20 μL van de oplossing over naar de hoofdplaten 1, 2, 3 en 4 (figuur 2). Schud de platen gedurende 1 minuut in een shaker (200 rpm).
- Breng vanuit elk putje van de additieplaat C (ATP) 20 μL oplossing over op de hoofdplaten 1, 2, 3 en 4 (figuur 2). Schud de platen gedurende 1 minuut in een shaker (200 rpm).
- Incubeer de platen gedurende 3 uur bij 37 °C.
- Bereid het malachietgroene reagens volgens stap 1.7. Breng na 3 uur 20 μL malachietgroen reagens van additieplaat D over in de putjes van de hoofdplaten 1, 2, 3 en 4 (figuur 2).
- Meet na een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur de absorptie van de plaat bij 620 nm in een plaatlezer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten van de test worden geïnterpreteerd in termen van absorptie als gevolg van vrije fosfaationenconcentratie. De absorptie door vrij fosfaat als gevolg van ATP-hydrolyse door de gist Hsp90 bij 620 nm wordt beschouwd als 100% ATPase-activiteit, of nul percentage eiwitremming. De remming van eiwit leidt tot het stoppen van ATP-hydrolyse (minder vrij fosfaat). wat tot uiting komt in een verminderde absorptie bij 620 nm.
Resultaten van malachiet groene assay op laboratoriumschaal
De standaardgrafiek voor de fosfaatnorm is weergegeven in figuur 3. De activiteit van Hsp90 wordt gemeten in termen van zijn vermogen om ATP te hydrolyseren tot ADP en anorganisch fosfaat (Pi). Een hogere vrije fosfaatconcentratie leidt tot een toename van complexe vorming met malachietgroen, wat een intens groene kleur veroorzaakt die detecteerbaar is bij 620 nm (figuur 4).
De procentuele remming wordt berekend met de volgende vergelijking:
% remming 
De absorptie van Hsp90 werd beschouwd als nul procent remming (100% ATPase-activiteit). Het percentage ATPase-activiteit wordt gebruikt voor het meten van de dosisafhankelijke remming van het eiwit door GA. Er werd waargenomen dat GA het eiwit remde op een dosisafhankelijke manier, met een IC50-waarde van 0,85 μM (figuur 5 en tabel 7).
De sigmoïdale curvebenadering van grafische software werd gebruikt om de IC 50-waarde te bepalen (concentratie waarbij de moleculen50 % van de Hsp90 ATPase-activiteit vertonen).
Resultaten van high-throughput screening (HTS) van Hsp90-remmers door malachiet groene assay
De HTS werd uitgevoerd met teststoffen (codes 3 tot en met 96) in tweevoud door GA (20 μM eindputconcentratie) als referentiestandaard te nemen. De absorptie bij 620 nm van de verbindingen was niet bekend en daarom werd alleen de absorptie van de verbindingen geregistreerd (hoofdplaten 1 en 2; Figuur 6). De absorptiewaarde voor elke put van hoofdplaten 3 en 4 (met Hsp90; Figuur 7) werd afgetrokken van de overeenkomstige absorptie in de platen 1 en 2 (alleen verbinding). De absorptie van Hsp90 werd beschouwd als 100% ATPase-activiteit.
Het percentage remming werd berekend met behulp van de volgende formule:
% remming
De GA-concentratie van 20 μM vertoonde 75,82% remming. Een 100 μM van verbinding 82 vertoonde 100% remming van het gist Hsp90-eiwit, terwijl verbindingen 6 en 95 respectievelijk 73,07% en 62,88% remming vertoonden bij 100 μM (tabel 8). De andere verbindingen onderdrukten het eiwit met minder dan 50% bij 100 μM en werden als inactief beschouwd.
Figuur 1: Reacties van malachietgroen (MG) reagens. (A) Structuur van malachietgroen. (B) Reacties van malachietgroen reagens A (ammoniummolybdaat in 3 M HCl) met Pi en daaropvolgende reactie met reagens B (malachietgroen in polyvinylalcohol). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Experimenteel schema voor HTS-protocol. De figuur toont de volgorde van toevoeging van reagentia aan de hoofdtestplaat van de additieplaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Standaard plot voor standaard fosfaatconcentratie. De X-as vertegenwoordigt de Pi-concentratie in micromolar en de absorptie bij 620 nm wordt weergegeven op de Y-as. De foutbalken geven de afwijking tussen de twee monsternummers weer (n = 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kleurontwikkeling na toevoeging van malachietgroen reagens. De groene kleur wordt intenser met een hoge fosfaatconcentratie en meer ATPase-activiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: IC50 berekening voor geldanamycine tegen gist Hsp90. Elk punt is een gemiddelde van twee bepalingen (n = 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Kleurontwikkeling na toevoeging van malachietgroen reagens. (A) Kleurontwikkeling in hoofdplaat 1. De roze kleur in de A11 put komt door de samengestelde kleur. (B) Kleurontwikkeling in hoofdplaat 2. De roze kleur in de A11-put is te wijten aan de gekleurde aard van de verbinding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Kleurontwikkeling na toevoeging van malachietgroen reagens. Kleurontwikkeling na toevoeging van malachietgroen reagens. (A) Kleurontwikkeling in hoofdplaat 3. (B) Kleurontwikkeling in hoofdplaat 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Voorraad oplossing | Laatste conc. | Verdunning (definitief/voorraad) | Benodigde hoeveelheid voor 100 ml bouillon (verdunning × totaal volume) |
| 1000 mM Tris-HCl, pH 7,4 | 200 mM | 0.2 | 20 ml |
| 1000 mM KCl | 40 mM | 0.04 | 4 ml |
| 1000 mM MgCl2 | 12mM | 0.012 | 1,2 ml |
| Ultrazuiver water | Nv | Nv | Voeg toe aan 100 ml totaal volume |
Tabel 1: Voorbereiding van testbuffer.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Een | Ultrazuiver water | Ultrazuiver water | Blanco | Blanco | |
| B | 4 μM PB | 4 μM PB | Negatieve controle | Negatieve controle | |
| C | 8 μM PB | 8 μM PB | GA(100 μM) + Hsp90 | GA(100 μM) + Hsp90 | |
| D | 12 μM PB | 12 μM PB | GA(20 μM) + Hsp90 | GA(20 μM) + Hsp90 | |
| E | 16 μM PB | 16 μM PB | GA(4 μM) + Hsp90 | GA(4 μM) + Hsp90 | |
| F | 24 μM PB | 24 μM PB | GA(0,8 μM) + Hsp90 | GA(0,8 μM) + Hsp90 | |
| G | 32 μM PB | 32 μM PB | GA(0,16 μM) + Hsp90 | GA(0,16 μM) + Hsp90 | |
| H | 40 μM PB | 40 μM PB | GA (0,032 μM) + Hsp90 | GA (0,032 μM) + Hsp90 | |
| Notitie: Het totale putvolume is 80 μL. PB = Fosfaatbuffernorm. | |||||
Tabel 2: De lay-out van de 96-well plaat.
| # | Blanco | Negatieve controle | Gist Hsp90 + GA |
| Testbuffer | 40 μL | 32 μL | 32 μL |
| DMSO | 2 μL | 2 μL | - |
| GA | - | - | 2 μL |
| HSP90 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mm) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| Ultrazuiver water | 34 μL | 34 μL | 34 μL |
| Totaal volume | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
Tabel 3: Bestanddeel van elke put.
| Plaat-ID | Uitleg |
| 1 | Hoofdplaat die verbinding bevat |
| 2 | Hoofdplaat met verbinding (duplicaat van plaat 1) |
| 3 | Hoofdplaat met Hsp90 en compound |
| 4 | Hoofdplaat met Hsp90 en compound (duplicaat van plaat 3) |
| CP | Samengestelde oplossing |
| Een | Bufferoplossing |
| B | Bufferoplossing met Hsp90 |
| C | ATP-oplossing |
| D | Malachiet groene reagensoplossing |
| Opmerking: Alle platen zijn 96-goed transparant. Hoofdplaat: platen waar de uiteindelijke ATPase-reactie plaatsvindt. Plaat CP, A, B, C en D zijn additieplaten die specifieke reagentia bevatten. | |
Tabel 4: Soorten platen die worden gebruikt in de HTS-test.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | CP | Een | B | C | D | ||
| Compound/GA-oplossing in 1:10 DMSO:water | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 90 μL | - | - | - | - | ||
| Hsp90-oplossing: bufferoplossing (1:4) | - | - | 40 μL | 40 μL | - | - | 90 μL | - | - | ||
| Bufferoplossing | 40 μL | 40 μL | - | - | - | 90 μL | - | - | - | ||
| ATP (0,8 mM) | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | - | - | - | 90 μL | - | ||
| Malachiet groen reagens | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 μL | ||
| Totaal volume | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | ||
| Notitie: GA = Geldanamycine. Voor de optelplaten CP, A, B, C en D wordt een extra 10 μL genomen voor de perfecte overdracht van oplossingen naar de hoofdplaten. | |||||||||||
Tabel 5: Bestanddeel van elke put in het HTS-protocol.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Een | DMSO +W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | GA | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| Opmerking: 3-96 zijn samengestelde codes voor het evalueren van het Hsp90-remmingspotentieel. GA = Geldanamycine. W=Ultrazuiver water | ||||||||||||
Tabel 6: Putplaatindeling voor hoofdplaat 1 en 2 (zonder Hsp90) en 3 en 4 (met Hsp90).
| Goed Constituerend | % ATPase activiteit* | % remming |
| HSP90 | 100 | 0.00 |
| GA(100 μM) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 μM) | 17.77 | 82.23 |
| GA(4 μM) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0,8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0,16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0,032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| *Een gemiddelde van twee onafhankelijke determinaties | ||
Tabel 7: Procentuele remming en ATPase-activiteit van geldanamycine.
| Goed Constituerend | Abs (A) | Goed Constituerend | Abs (B) | B-A | % ATPase activiteit* | % remming |
| Blanco | 0.281 | Negatieve controle | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 μM) | 0.295 | GA (20 μM)+Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| Verbinding 6 (100 μM) | 0.3 | Verbinding 6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| Verbinding 82 (100 μM) | 0.49 | Verbinding 82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| Verbinding 95 (100 μM) | 0.327 | Verbinding 95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
Tabel 8: Procentuele remming en ATPase-activiteit van geldanamycine en geselecteerde verbindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hsp90 is een belangrijk doelwit voor de ontdekking van nieuwe moleculen tegen kanker. Sinds de druggability werd vastgesteld in 199410, 18 moleculen hebben klinische proeven bereikt. Op dit moment bevinden zeven moleculen zich in verschillende fasen van klinische onderzoeken, alleen of in combinatie22. Al deze kleine moleculen zijn N-terminale ATP-bindingsremmers. De andere middelen om de chaperonne te remmen (C-terminale remmers, middendomeinremmers) zijn niet zo snel gegaan als N-terminale remmers. Vandaar dat de N-terminale ATP-bindende remmerverbindingen nog steeds veelbelovend zijn voor progressie naar een klinisch verhandelbaar molecuul. Bovendien is de enige Hsp90-remmer, goedgekeurd in juni 2022 (Pimitespib voor de behandeling van GIST in Japan), een N-terminale ATP-bindende molecule9. Een enkel molecuul heeft echter tot op heden geen verhandelbaar stadium bereikt in andere delen van de wereld23,24. Er zijn verschillende belangrijke redenen voor dit falen, waaronder formuleringsproblemen, de kosten van het produceren van moleculen naast toxiciteit zoals ototoxiciteit en cardiotoxiciteit geassocieerd met weinig verbindingen. Om deze bijwerkingen te overwinnen, worden Hsp90 N-terminale selectieve remmers (alfa en bèta) nu onderzocht25,26,27. Alle bovengenoemde discussie rechtvaardigt de HTS-screening van verbindingen, die Hsp90-activiteit zal onderdrukken door zich te binden aan de ATP-bindingsspleet.
Assays voor de ontdekking van geneesmiddelen moeten snel, kosteneffectief, gevoelig, gemakkelijk reproduceerbaar zijn en minder gevaarlijke chemicaliën en / of omstandigheden gebruiken. Bovendien moet het gemakkelijk worden uitgevoerd op laboratoriumschaal en in een HTS-opstelling. Een gedetailleerde analyse van beschikbare Hsp90 ATPase-remmende assays werd uitgevoerd en malachietgroene fosfaattest bleek de meest geschikte van alle in de gegeven institutionele opstelling. De andere testsystemen waren niet automatiseringsvriendelijk in een HTS-systeem (pyruvaat/lactaatdehydrogenase gekoppeld enzym)28,29; duur zoals de fluorescentiepolarisatietest30, scintillatienabijheidstests, oppervlakteplasmonresonantietest en tijd-opgeloste fluorescentieronantie-energieoverdracht (TR-FRET)28,29; tijdrovend zoals (TR-FRET)28,29; of bezeten stralingsgevaren zoals scintillatie proximity assays28,29. Daarom wordt in dit protocol een eenvoudige malachietgroene test als laboratoriumschaal of HTS voor de identificatie van nieuwe Hsp90 N-terminale ATP-bindingsremmers gepresenteerd.
De grootste zorg in deze test is de verontreiniging van buffers en plantenextracten die moeten worden geëvalueerd met fosfaationen, wat tot valse resultaten kan leiden. De niet-enzymatische hydrolyse van ATP bij de reactie-pH kan ook leiden tot valse resultaten. De bovengenoemde problemen zijn opgelost door gebruik te maken van fosfaatvrije buffers (pH 7,4). Bovendien werd een blanco uitgevoerd met buffer + water + DMSO en vervolgens de absorptiewaarde van de positieve controle-/monsterverbindingen afgetrokken van de blancowaarde. Een voorzorgsmaatregel die in deze testprocedure moet worden gevolgd, is strikte naleving van de toevoeging van reagentia, zoals de gelijktijdige toevoeging van ATP aan elke put via een meerkanaals pipet. Dit is zodat de reactie op hetzelfde moment begint in elke put, dezelfde incubatietijd en daarna bij dezelfde meting van de absorptie na de toevoeging van het malachietgroene reagens. De ATPase-reactie is zeer tijdgevoelig en daarom kan een kleine verandering in de reactie-initiatie- en beëindigingstijd, incubatietijd en tijd voor registratieabsorptie de testresultaten drastisch beïnvloeden. Verder beïnvloedt de toevoeging van 10 μL 34% natriumcitraatoplossing (gebruikt voor het blussen van de ATPase-reactie) de lineariteit van de standaardcurve en was daarom niet opgenomen in ons testprotocol.
De enige beperking van deze test is de evaluatie van verbindingen die een hogere absorptie aantonen dan aangetoond door vrij fosfaat dat vrijkomt uit ATP door de gist Hsp90 bij 620 nm. Een vals positief of vals negatief kan resulteren in het geval van dergelijke verbindingen. De kans om dergelijke verbindingen tegen te komen is echter zeer zeldzaam. Dit kan problematisch zijn bij de evaluatie van plantenextracten en/of hun fracties in het bijzonder, wanneer een mengsel van verbindingen aanwezig is.
Kortom, opschaling van labschaal naar HTS is succesvol uitgevoerd met gist Hsp90. Het stapsgewijze testprotocol op laboratoriumschaal en in HTS zal wetenschappers wereldwijd helpen om deze procedure voor de ontdekking van nieuwe Hsp90-remmers toe te passen. Bovendien kan het protocol worden aangepast voor de ontdekking van ATPase-remmers tegen andere ATP-afhankelijke eiwitten zoals Hsp70, Grp94, Lon protease, Protease Ti, AAA-proteasen, enz.31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Korea Research Fellowship (KRF) -programma, postdoctoraal fellow van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van wetenschap en ICT (NRF-2019H1D3A1A01102952). De auteurs zijn KIST intramurale subsidie en ministerie van Oceanen en Visserij subsidienummer 2MRB130 dankbaar voor het verstrekken van financiële steun voor dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M.
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L.
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
