Summary
Il protocollo di analisi del verde malachite è un metodo semplice ed economico per scoprire i soppressori della proteina da shock termico 90 (Hsp90) e altri composti inibitori contro gli enzimi ATP-dipendenti.
Abstract
La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un promettente bersaglio antitumorale a causa del suo effetto chaperoning su più proteine oncogeniche. L'attività di Hsp90 dipende dalla sua capacità di idrolizzare l'adenosina trifosfato (ATP) in adenosina difosfato (ADP) e fosfato libero. L'attività ATPasi di Hsp90 è legata alla sua funzione chaperoning; L'ATP si lega al dominio N-terminale dell'Hsp90 e interrompere il suo legame si è rivelata la strategia di maggior successo nel sopprimere la funzione Hsp90. L'attività dell'ATPasi può essere misurata mediante un saggio colorimetrico di verde malachite, che determina la quantità di fosfato libero formato dall'idrolisi dell'ATP. Qui viene descritta una procedura per determinare l'attività dell'ATPasi del lievito Hsp90 utilizzando il kit di analisi del fosfato verde malachite. Inoltre, vengono fornite istruzioni dettagliate per la scoperta degli inibitori Hsp90 assumendo geldanamicina come inibitore autentico. Infine, viene discussa l'applicazione di questo protocollo di analisi attraverso lo screening ad alta produttività (HTS) di molecole inibitrici contro il lievito Hsp90.
Introduction
La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un chaperone molecolare che mantiene la stabilità delle proteine responsabili dello sviluppo e della progressione del cancro. Inoltre, le proteine responsabili dello sviluppo della resistenza agli agenti antineoplastici sono anche clienti di Hsp901. Hsp90 è sovraespresso ubiquitariamente in tutti i tipi di cellule tumorali (>90% delle proteine cellulari), rispetto alle cellule normali dove può costituire meno del 2% delle proteine totali. Inoltre, l'Hsp90 delle cellule tumorali risiede in un complesso con co-chaperoni, mentre in una cellula normale è presente prevalentemente in uno stato libero e non complessato 2,3. Negli ultimi anni, diversi inibitori di Hsp90 hanno dimostrato di possedere effetti senolitici in studi in vitro e in vivo, dove hanno migliorato significativamente la durata della vita dei topi 4,5,6. Tutti i risultati di cui sopra confermano il fatto che gli inibitori Hsp90 potrebbero essere efficaci in più tipi di cancro, con meno effetti avversi e minori possibilità di sviluppare resistenza. La funzione chaperoning di Hsp90 si ottiene legando l'ATP al dominio N-terminale di Hsp90 e idrolizzandolo in ADP e fosfato libero7. Piccole molecole che si legano in modo competitivo alla tasca di legame ATP di Hsp90 sono state trovate per sopprimere con successo l'effetto chaperoning della proteina. Ad oggi, questa rimane la migliore strategia per l'inibizione di Hsp90, che è supportata dal fatto che tali inibitori hanno raggiunto studi clinici8. Uno di questi, Pimitespib, è stato approvato in Giappone per il trattamento del tumore stromale gastrointestinale (GIST) nel giugno 20229. Questo è il primo inibitore Hsp90 approvato da quando la farmacogabilità dello chaperone è stata stabilita nel 199410.
Il test del verde malachite è una procedura semplice, sensibile, veloce ed economica per la rilevazione del fosfato inorganico, adatta per l'automazione e lo screening ad alta produttività (HTS) dei composti rispetto al target desiderato11. Il test è stato impiegato con successo per lo screening degli inibitori Hsp90 in piccole configurazioni su scala di laboratorio, nonché in un HTS 12,13,14,15,16,17. Il test utilizza un metodo colorimetrico che determina il fosfato inorganico libero formato a causa dell'attività ATPasi di Hsp90. La base di questa quantificazione è la formazione di un complesso fosfomolibdato tra fosfato libero e molibdeno, che successivamente reagisce con il verde malachite per generare un colore verde (Figura 1). Questa rapida formazione di colore viene misurata su uno spettrofotometro, o su un lettore di piastre, tra 600-660 nm18,19.
Nel presente protocollo, viene descritta la procedura per eseguire un test verde malachite con lievito Hsp90 e successiva identificazione degli inibitori contro lo chaperone. La molecola del prodotto naturale, la geldanamicina (GA), con la quale è stata stabilita per la prima volta la farmacogabilità di Hsp90, è stata assunta come un autentico inibitore10. L'HTS è diventato parte integrante dell'attuale programma di scoperta di farmaci, grazie alla disponibilità di un gran numero di molecole per i test. Questa tecnica ha acquisito maggiore importanza negli ultimi 2 anni a causa dell'urgente necessità di riutilizzare i farmaci per il trattamento dell'infezione da Covid-1920,21. Pertanto, viene presentato uno schema dettagliato per l'HTS delle molecole contro la proteina Hsp90 del lievito adottando il metodo del saggio verde malachite.
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Protocol
1. Saggio verde malachite su scala di laboratorio
- Preparazione del tampone di analisi
- Preparare il tampone di analisi, secondo la composizione e la preparazione presentate nella Tabella 1.
- Preparazione di norme sui fosfati
- Utilizzare 1 mM di fosfato standard, fornito nel kit di dosaggio del fosfato verde malachite (conservato a 4 °C).
- Pipettare 40 μL di 1 mM fosfato standard in 960 μL di acqua ultrapura per ottenere una soluzione di fosfato 40 μM (soluzione premiscelata). Aggiungere la soluzione premiscelata con acqua ultrapura, secondo le istruzioni del produttore, per formare una diluizione seriale di fosfato da 0 a 40 μM.
- Preparazione del lievito Hsp90
- Utilizzare lievito Hsp90 con una concentrazione di glicerolo di 0,66 mg / ml. Scongelare sul ghiaccio poco prima dell'uso.
- Utilizzare 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) di lievito Hsp90 per misurare l'attività dell'ATPasi. Verificare che la differenza di densità ottica dopo l'aggiunta di reagente verde malachite tra il controllo bianco e il controllo positivo sia almeno 0,5 e inferiore a 1,0. Qui, la differenza di assorbanza tra il bianco (senza Hsp90) e il controllo positivo (con Hsp90) è risultata essere 0,510.
- Preparazione di ATP
- Trasferire 1 mg di ATP in un flaconcino contenente 453,39 μL di acqua ultrapura per ottenere 4 mM di soluzione madre. Eseguire calcoli di peso basati su ATP anidro (peso molecolare [m.w.] = 551,14). Preparare l'ATP fresco, in quanto può idrolizzarsi spontaneamente nel tempo.
- Aggiungere 4 μL di soluzione madre di ATP a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale del pozzo di 0,2 mM (volume totale finale del pozzo di analisi di 80 μL). Aggiungere ATP come ultimo componente alla reazione, utilizzando una pipetta multicanale in modo che tutte le reazioni inizino contemporaneamente.
- Preparazione di geldanamicina (GA)
- Preparare una scorta di 10 mM di GA sciogliendo 1 mg in 178,37 μL di DMSO (m.p. = 560,64). Utilizzando la soluzione madre, preparare 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM e 0,00128 mM in soluzione DMSO mediante diluizione seriale.
- Aggiungere 2 μL di queste soluzioni madre a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale del pozzetto di 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM e 0,000032 mM, rispettivamente.
- Preparare i pozzetti come descritto nella Tabella 2 e nella Tabella 3, con i pozzetti contenenti il bianco (buffer + acqua + DMSO) e il controllo negativo (Hsp90 in buffer + acqua + DMSO). I pozzi contenenti GA (Hsp90 in buffer + acqua + GA) fungono da controllo positivo.
- Preparazione delle piastre del pozzo e ordine di aggiunta
- Preparare piastre da 96 pozzetti con il layout presentato nella Tabella 2. Per i composti che mostrano assorbanza a 620 nm, preparare un pozzetto separato per registrare l'assorbanza a questa lunghezza d'onda. Non preparare un pozzetto separato per GA, poiché GA non mostra assorbanza a 620 nm per la concentrazione utilizzata nel test.
- Preparare ciascun componente con il volume totale di ciascun componente, come illustrato nella tabella 3.
- Impostare pozzi di analisi aggiungendo acqua ultrapura a ciascun pozzo. Successivamente, aggiungere la quantità richiesta di tampone di analisi e una soluzione composta (ad esempio, soluzione GA).
- Quindi, aggiungere Hsp90 ai pozzetti appropriati e agitare le piastre per 2 minuti su uno shaker a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4 μL di soluzione ATP utilizzando una pipetta multicanale. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e agitare per 2 minuti su uno shaker (200 rpm) a temperatura ambiente. Incubare la piastra a 37 °C per 3 ore.
- Preparazione e aggiunta di reagente verde malachite
- Il reagente verde malachite è costituito da reagenti A (molibdato di ammonio in 3M HCl) e B (verde malachite e alcool polivinilico). Portare il reagente a temperatura ambiente prima dell'uso. Miscelare i reagenti A e B con un rapporto 100:1 (1.000 μL:10 μL). Preparalo entro 3 ore prima dell'uso, poiché è instabile e inizia a decomporsi dopo 3 ore.
- Dopo 3 ore del punto 1.6.5, interrompere la reazione aggiungendo 20 μL di reagente verde malachite, aggiunto nello stesso ordine dell'ATP, utilizzando una pipetta multicanale.
- Dopo un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, misurare l'assorbanza della piastra a 620 nm in un lettore di piastre.
2. Screening ad alto rendimento degli inibitori di Hsp90 mediante saggio verde malachite
NOTA: il protocollo per lo screening ad alta produttività è simile alla metodologia su scala di laboratorio. Il volume finale del pozzo in ciascun caso è di 80 μL. Tuttavia, c'è una leggera differenza nell'ordine di aggiunta dei reagenti. Nel metodo basato su scala di laboratorio, ci sono cinque fasi di aggiunta della soluzione (34 μL di acqua, 32 μL di tampone, 2 μL di composto in DMSO, 8 μL di Hsp90 e infine 4 μL di soluzione di ATP). Al contrario, con HTS ci sono tre fasi di aggiunta (40 μL di soluzione tampone contenente lievito Hsp90, 2 μL di DMSO in 18 μL di acqua contenente i composti e infine 20 μL di ATP disciolto in acqua). La quantità minima di soluzione che può essere pipettata con precisione nella configurazione HTS è di 20 μL. Pertanto, si osserva una differenza nel pipettaggio tra le bilance di laboratorio e HTS.
- Preparazione del tampone dosato (pH 7,4)
- Utilizzare lo stesso tampone in HTS come per il test di verde malachite su scala di laboratorio (Tabella 1).
- Preparazione del lievito Hsp90
- Utilizzare proteine con una concentrazione di glicerolo di 0,66 mg / ml. Scongelare sul ghiaccio poco prima dell'uso.
- Utilizzare 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) di lievito Hsp90 in ciascun pozzetto, che fornisce attività misurabile dell'ATPasi.
- Diluire la proteina (8 μL) in tampone (32 μL) per ciascun pozzetto. Il volume di lavoro totale finale per ciascun pozzetto è di 40 μL in un volume totale di analisi di 80 μL.
- Preparazione di 0,8 mM ATP
- Sciogliere 1 mg di ATP in 2.267 μL di acqua distillata per ottenere una soluzione da 0,8 mM. Il volume di lavoro totale per ciascun pozzetto è di 20 μL su un volume totale di analisi di 80 μL.
- Preparazione di geldanamicina (GA)/composti in esame
- Preparare una scorta di 0,8 mM di GA in DMSO, come nel passaggio 1.5. Diluire 10 μL del materiale madre GA con 90 μL di acqua per ottenere una concentrazione finale di 80 μM.
- Utilizzare 20 μL della soluzione di 80 μM GA in pozzetti di analisi appropriati (volume totale finale del pozzo di analisi = 80 μL), ottenendo una concentrazione finale del pozzetto di 20 μM. Questo serve come controllo positivo.
- Per i composti di prova, preparare le soluzioni in DMSO secondo la concentrazione desiderata per la valutazione.
- Preparare 10 μL di DMSO in 90 μL di acqua per l'aggiunta a pozzi di controllo bianco (tampone + acqua + DMSO) e negativi (Hsp90 in tampone + acqua + DMSO). Preparare i composti in esame in modo simile a una concentrazione finale di 100 μM.
- Progettazione delle piastre di analisi e ordine di aggiunta
- Utilizzare quattro piastre principali, una piastra composta e quattro piastre di aggiunta contenenti scorte di reagenti per impostare il saggio (Figura 2 e Tabella 4).
- Inoltre, piastra A, aggiungere 90 μL di tampone di saggio in ciascun pozzetto; in aggiunta piastra B, aggiungere 90 μL di tampone con Hsp90 in ciascun pozzetto; in aggiunta alle piastre C e D, aggiungere 90 μL di ATP e 90 μL di reagente verde malachite, rispettivamente, in ciascun pozzetto (Tabella 5 e Tabella 6).
- Dalla piastra di addizione A e dalla piastra B, trasferire 40 μL di soluzione da ciascun pozzetto alla piastra principale 1 e 2 e 3 e 4, rispettivamente, utilizzando un sistema di erogazione multicanale automatizzato. Qui è stata utilizzata la stazione di lavoro di automazione di laboratorio Biomek(R) FXP (Figura 2 e Tabella 6).
- Da ciascun pozzetto della piastra composta, trasferire 20 μL della soluzione alle piastre principali 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agitare le piastre per 1 minuto in uno shaker (200 rpm).
- Da ciascun pozzetto della piastra di addizione C (ATP), trasferire 20 μL di soluzione alle piastre principali 1, 2, 3 e 4 (Figura 2). Agitare le piastre per 1 minuto in uno shaker (200 rpm).
- Incubare le piastre per 3 h a 37 °C.
- Preparare il reagente verde malachite come da punto 1.7. Dopo 3 ore, trasferire 20 μL di reagente verde malachite dalla piastra di addizione D nei pozzetti delle piastre principali 1,2, 3 e 4 (Figura 2).
- Dopo un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, misurare l'assorbanza della piastra a 620 nm in un lettore di piastre.
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Representative Results
I risultati del saggio sono interpretati in termini di assorbanza dovuta alla concentrazione di ioni fosfato libero. L'assorbanza da parte del fosfato libero dovuta all'idrolisi dell'ATP da parte del lievito Hsp90 a 620 nm è considerata come attività dell'ATPasi al 100%, o inibizione proteica a percentuale zero. L'inibizione delle proteine porta alla cessazione dell'idrolisi dell'ATP (meno fosfato libero). che si riflette in termini di diminuzione dell'assorbanza a 620 nm.
Risultati del test di verde malachite su scala di laboratorio
Il grafico standard per lo standard del fosfato è illustrato nella figura 3. L'attività di Hsp90 è misurata in termini di capacità di idrolizzare ATP in ADP e fosfato inorganico (Pi). Una maggiore concentrazione di fosfato libero porta ad un aumento della formazione di complessi con verde malachite, che provoca un colore verde intenso rilevabile a 620 nm (Figura 4).
L'inibizione percentuale è calcolata dalla seguente equazione:
% Inibizione 
L'assorbanza di Hsp90 è stata considerata come inibizione percentuale zero (attività ATPasi al 100%). La percentuale di attività dell'ATPasi viene utilizzata per misurare l'inibizione dose-dipendente della proteina da parte di GA. È stato osservato che GA ha inibito la proteina in modo dose-dipendente, con un valore IC50 di 0,85 μM (Figura 5 e Tabella 7).
L'approccio della curva sigmoidale del software grafico è stato utilizzato per determinare il valore IC 50 (concentrazione alla quale le molecole mostrano il50 % dell'attività dell'ATPasi Hsp90).
Risultati dello screening ad alta produttività (HTS) degli inibitori di Hsp90 mediante saggio verde malachite
L'HTS è stato effettuato con composti di prova (codici da 3 a 96) in duplice copia prendendo come standard di riferimento GA (concentrazione finale del pozzo 20 μM). L'assorbanza a 620 nm dei composti non era nota e quindi è stata registrata l'assorbanza dei composti da sola (piastre principali 1 e 2; Figura 6). Il valore di assorbanza per ciascun pozzetto delle piastre principali 3 e 4 (con Hsp90; Figura 7) è stato dedotto dalla corrispondente assorbanza nelle piastre 1 e 2 (solo composto). L'assorbanza di Hsp90 è stata considerata come attività ATPasi al 100%.
L'inibizione percentuale è stata calcolata utilizzando la seguente formula:
% Inibizione
La concentrazione di 20 μM GA ha dimostrato un'inibizione del 75,82%. Un 100 μM del composto 82 hanno mostrato un'inibizione del 100% della proteina Hsp90 del lievito, mentre i composti 6 e 95 hanno mostrato un'inibizione rispettivamente del 73,07% e del 62,88% a 100 μM (Tabella 8). Gli altri composti hanno soppresso la proteina di meno del 50% a 100 μM e sono stati considerati inattivi.
Figura 1: Reazioni del reagente verde malachite (MG). (A) Struttura del verde malachite. (B) Reazioni del reattivo verde malachite A (molibdato di ammonio in 3 M HCl) con Pi e successiva reazione con il reagente B (verde malachite in alcool polivinilico). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Schema sperimentale per il protocollo HTS. La figura rappresenta l'ordine di aggiunta dei reagenti alla piastra principale di analisi dalle piastre di addizione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Grafico standard per la concentrazione standard di fosfato. L'asse X rappresenta la concentrazione di Pi greco in micromolare e l'assorbanza a 620 nm è rappresentata sull'asse Y. Le barre di errore rappresentano la deviazione tra i due numeri campione (n = 2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Sviluppo del colore dopo aggiunta di reagente verde malachite. Il colore verde diventa più intenso con un'alta concentrazione di fosfato e più attività dell'ATPasi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Calcolo IC50 per geldanamicina contro lievito Hsp90. Ogni punto è una media di due determinazioni (n = 2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Sviluppo del colore dopo aggiunta di reagente verde malachite . (A) Sviluppo del colore nella piastra principale 1. Il colore rosa nel pozzo A11 è dovuto al colore composto. (B) Sviluppo del colore nella piastra principale 2. Il colore rosa nel pozzo A11 è dovuto alla natura colorata del composto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Sviluppo del colore dopo aggiunta di reagente verde malachite. Sviluppo del colore dopo l'aggiunta di reagente verde malachite. (A) Sviluppo del colore nella piastra principale 3. (B) Sviluppo del colore nella piastra principale 4. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Soluzione madre | Conc. finale | Diluizione (finale/stock) | Quantità necessaria per 100 ml di brodo (Diluizione × volume totale) |
| 1000 mM Tris-HCl, pH 7,4 | 200 mM | 0.2 | 20 ml |
| 1000 mM KCl | 40 mM | 0.04 | 4 ml |
| 1000 mM MgCl2 | 12 mM | 0.012 | 1,2 ml |
| Acqua ultrapura | NA | NA | Aggiungi a 100 mL di volume totale |
Tabella 1: Preparazione del tampone di analisi.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Un | Acqua ultrapura | Acqua ultrapura | Vuoto | Vuoto | |
| B | 4 μM PB | 4 μM PB | Controllo negativo | Controllo negativo | |
| C | 8 μM PB | 8 μM PB | GA(100 μM) + Hsp90 | GA(100 μM) + Hsp90 | |
| D | 12 μM PB | 12 μM PB | GA(20 μM) + Hsp90 | GA(20 μM) + Hsp90 | |
| E | 16 μM PB | 16 μM PB | GA(4 μM) + Hsp90 | GA(4 μM) + Hsp90 | |
| F | 24 μM PB | 24 μM PB | GA(0,8 μM) + Hsp90 | GA(0,8 μM) + Hsp90 | |
| G | 32 μM PB | 32 μM PB | GA(0,16 μM) + Hsp90 | GA(0,16 μM) + Hsp90 | |
| H | 40 μM PB | 40 μM PB | GA(0,032 μM) + Hsp90 | GA(0,032 μM) + Hsp90 | |
| Nota: Il volume totale del pozzo è di 80 μL. PB = Tampone fosfato standard. | |||||
Tabella 2: Il layout della piastra a 96 pozzetti.
| # | Vuoto | Controllo negativo | Lievito Hsp90 + GA |
| Tampone di analisi | 40 μL | 32 μL | 32 μL |
| DMSO | 2 μL | 2 μL | - |
| GA | - | - | 2 μL |
| HSP90 | - | 8 μL | 8 μL |
| ATP (4mM) | 4 μL | 4 μL | 4 μL |
| Acqua ultrapura | 34 μL | 34 μL | 34 μL |
| Volume totale | 80 μL | 80 μL | 80 μL |
Tabella 3: Costituente di ogni pozzo.
| ID targa | Spiegazione |
| 1 | Piastra principale contenente composto |
| 2 | Piastra principale contenente composto (duplicato della piastra 1) |
| 3 | Piastra principale con Hsp90 e mescola |
| 4 | Piastra principale con Hsp90 e mescola (duplicato della piastra 3) |
| CP | Soluzione composta |
| Un | Soluzione tampone |
| B | Soluzione tampone con Hsp90 |
| C | Soluzione ATP |
| D | Soluzione di reagente verde malachite |
| Nota: tutte le piastre sono trasparenti a 96 pozzetti. Piastra principale: piastre in cui avviene la reazione finale dell'ATPasi. Le piastre CP, A, B, C e D sono piastre di addizione contenenti reagenti specifici. | |
Tabella 4: Tipi di piastre utilizzate nel test HTS.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | CP | Un | B | C | D | ||
| Soluzione composta/GA in 1:10 DMSO:acqua | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 90 μL | - | - | - | - | ||
| Soluzione Hsp90: soluzione tampone (1:4) | - | - | 40 μL | 40 μL | - | - | 90 μL | - | - | ||
| Soluzione tampone | 40 μL | 40 μL | - | - | - | 90 μL | - | - | - | ||
| ATP (0,8 mM) | 20 μL | 20 μL | 20 μL | 20 μL | - | - | - | 90 μL | - | ||
| Reagente verde malachite | - | - | - | - | - | - | - | - | 90 μL | ||
| Volume totale | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | 90 μL | ||
| Nota: GA = Geldanamicina. Per le piastre di addizione CP, A, B, C e D, vengono prelevati ulteriori 10 μL per il perfetto trasferimento delle soluzioni alle piastre principali. | |||||||||||
Tabella 5: Costituente di ciascun pozzetto nel protocollo HTS.
| # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Un | DMSO+W | 9 | 17 | 25 | 33 | 41 | 49 | 57 | 65 | 73 | 81 | 89 |
| B | GA | 10 | 18 | 26 | 34 | 42 | 50 | 58 | 66 | 74 | 82 | 90 |
| C | 3 | 11 | 19 | 27 | 35 | 43 | 51 | 59 | 67 | 75 | 83 | 91 |
| D | 4 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 | 52 | 60 | 68 | 76 | 84 | 92 |
| E | 5 | 13 | 21 | 29 | 37 | 45 | 53 | 61 | 69 | 77 | 85 | 93 |
| F | 6 | 14 | 22 | 30 | 38 | 46 | 54 | 62 | 70 | 78 | 86 | 94 |
| G | 7 | 15 | 23 | 31 | 39 | 47 | 55 | 63 | 71 | 79 | 87 | 95 |
| H | 8 | 16 | 24 | 32 | 40 | 48 | 56 | 64 | 72 | 80 | 88 | 96 |
| Nota: 3-96 sono codici composti per la valutazione del potenziale di inibizione di Hsp90. GA = Geldanamicina. W=Acqua ultrapura | ||||||||||||
Tabella 6: Layout della piastra del pozzo per la piastra principale 1 e 2 (senza Hsp90) e 3 e 4 (con Hsp90).
| Bene costituente | % attività ATPasi* | % inibizione |
| HSP90 | 100 | 0.00 |
| GA(100 μM) | 17.46 | 82.55 |
| GA (20 μM) | 17.77 | 82.23 |
| GA(4 μM) | 18.27 | 81.73 |
| GA (0,8 μM) | 58.43 | 41.57 |
| GA (0,16 μM) | 91.38 | 8.62 |
| GA (0,032 μM) | 92.86 | 7.14 |
| *Una media di due determinazioni indipendenti | ||
Tabella 7: Inibizione percentuale e attività ATPasi della geldanamicina.
| Bene costituente | Abs (A) | Bene costituente | Abs (B) | B-A | % attività ATPasi* | % inibizione |
| Vuoto | 0.281 | Controllo negativo | 0.663 | 0.383 | 100 | 0 |
| GA (20 μM) | 0.295 | GA (20 μM)+Hsp90 | 0.388 | 0.093 | 24.18 | 75.82 |
| Composto 6 (100 μM) | 0.3 | Composto 6 (100 μM) + Hsp90 | 0.403 | 0.103 | 26.93 | 73.07 |
| Composto 82 (100 μM) | 0.49 | Composto 82 (100 μM) + Hsp90 | 0.462 | -0.028 | -7.32 | 107.32 |
| Composto 95 (100 μM) | 0.327 | Composto 95 (100 μM) + Hsp90 | 0.469 | 0.142 | 37.12 | 62.88 |
Tabella 8: Inibizione percentuale e attività ATPasi della geldanamicina e di composti selezionati.
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Discussion
Hsp90 è un obiettivo significativo per la scoperta di nuove molecole di farmaci antitumorali. Da quando la sua farmacogabilità è stata stabilita nel 199410, 18 molecole hanno raggiunto studi clinici. Attualmente, sette molecole sono in varie fasi di studi clinici, da sole o in combinazione22. Tutte queste piccole molecole sono inibitori leganti l'ATP N-terminali. Gli altri mezzi per inibire il chaperone (inibitori C-terminali, inibitori del dominio medio) non hanno proceduto così velocemente come gli inibitori N-terminali. Quindi, i composti inibitori leganti l'ATP N-terminale sono ancora promettenti di progressione verso una molecola clinicamente commercializzabile. Inoltre, l'unico inibitore Hsp90, approvato nel giugno 2022 (Pimitespib per il trattamento del GIST in Giappone), è una molecola legante l'ATP N-terminale9. Tuttavia, una singola molecola, ad oggi, non ha raggiunto uno stadio commerciabile in altre parti del mondo23,24. Ci sono diverse ragioni principali per questo fallimento, tra cui problemi di formulazione, il costo di produzione di molecole oltre alla tossicità come l'ototossicità e la cardiotossicità associata a pochi composti. Per superare questi effetti avversi, gli inibitori selettivi N-terminali Hsp90 (alfa e beta) sono ora in fase di studio25,26,27. Tutta la discussione di cui sopra giustifica lo screening HTS dei composti, che sopprimerà l'attività di Hsp90 legandosi alla sua schisi di legame ATP.
I test per la scoperta di farmaci devono essere veloci, economici, sensibili, facilmente riproducibili e utilizzare sostanze chimiche e / o condizioni meno pericolose. Inoltre, dovrebbe essere comodamente eseguito su scala di laboratorio e in una configurazione HTS. È stata intrapresa un'analisi dettagliata dei saggi inibitori dell'ATPasi Hsp90 disponibili e il saggio del fosfato verde malachite è risultato essere il più adatto tra tutti nella configurazione istituzionale data. Gli altri sistemi di analisi non erano compatibili con l'automazione in un sistema HTS (enzima accoppiato piruvato/lattato deidrogenasi)28,29; costosi come il saggio di polarizzazione della fluorescenza30, i saggi di prossimità della scintillazione, il saggio di risonanza plasmonica di superficie e il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza risolta nel tempo (TR-FRET)28,29; dispendioso in termini di tempo come (TR-FRET)28,29; o possedeva rischi di radiazioni come saggi di prossimità a scintillazione28,29. Pertanto, in questo protocollo viene presentato un semplice saggio verde malachite come scala di laboratorio o HTS per l'identificazione di nuovi inibitori leganti l'ATP N-terminale Hsp90.
La principale preoccupazione in questo test è la contaminazione di tamponi ed estratti vegetali da valutare con ioni fosfato, che può portare a risultati falsi. L'idrolisi non enzimatica dell'ATP al pH di reazione può anche portare a risultati falsi. I problemi di cui sopra sono stati risolti utilizzando tamponi privi di fosfati (pH 7,4). Inoltre, è stato eseguito un bianco con tampone + acqua + DMSO e successivamente sottratto il valore di assorbanza dei composti positivi di controllo / campione dal valore bianco. Una precauzione che deve essere seguita in questa procedura di analisi è la stretta aderenza all'aggiunta di reagenti, come l'aggiunta di ATP simultaneamente a ciascun pozzetto tramite pipetta multicanale. In questo modo la reazione inizia contemporaneamente in ogni pozzetto, nello stesso tempo di incubazione e successivamente nella stessa misurazione dell'assorbanza dopo l'aggiunta del reagente verde malachite. La reazione ATPasi è altamente sensibile al tempo, e quindi un leggero cambiamento nel tempo di inizio e terminazione della reazione, nel tempo di incubazione e nel tempo di registrazione dell'assorbanza può influenzare drasticamente i risultati del test. Inoltre, l'aggiunta di 10 μL di soluzione di citrato di sodio al 34% (utilizzata per temprare la reazione ATPasi) influisce sulla linearità della curva standard e quindi non è stata inclusa nel nostro protocollo di analisi.
L'unica limitazione di questo test è la valutazione di composti che dimostrano un'assorbanza superiore a quella mostrata dal fosfato libero rilasciato dall'ATP dal lievito Hsp90 a 620 nm. Un falso positivo o falso negativo può risultare nel caso di tali composti. Tuttavia, le possibilità di incontrare tali composti sono molto rare. Ciò può essere problematico con la valutazione degli estratti vegetali e/o delle loro frazioni in particolare, dove è presente una miscela di composti.
In conclusione, lo scale-up da scala di laboratorio a HTS è stato eseguito con successo con il lievito Hsp90. Il protocollo di analisi graduale su scala di laboratorio e in HTS aiuterà gli scienziati di tutto il mondo ad adottare questa procedura per la scoperta di nuovi inibitori Hsp90. Inoltre, il protocollo può essere adattato per la scoperta di inibitori dell'ATPasi contro altre proteine ATP dipendenti come Hsp70, Grp94, Lon proteasi, proteasi Ti, AAA proteasi, ecc31,32,33.
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Disclosures
Non vi sono interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal programma Korea Research Fellowship (KRF), borsista post-dottorato della National Research Foundation of Korea (NRF), finanziato dal ministero della scienza e delle TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Gli autori sono grati alla sovvenzione intramurale KIST e alla sovvenzione numero 2MRB130 del Ministero degli Oceani e della Pesca per aver fornito assistenza finanziaria a questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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