Qui presentiamo un protocollo per raccogliere cellule aderenti da palloni multistrato in modo semi-automatico chiuso utilizzando un sistema di centrifugazione controcorrente. Questo protocollo può essere applicato per la raccolta di celle aderenti e in sospensione da altre piattaforme di espansione cellulare con poche modifiche ai passaggi esistenti.
Le cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) sono attualmente in fase di studio come promettente modalità terapeutica basata su cellule per varie malattie, con ulteriori approvazioni di mercato per uso clinico previste nei prossimi anni. Per facilitare questa transizione, è fondamentale affrontare i colli di bottiglia di scala, riproducibilità da lotto a lotto, costi, conformità normativa e controllo della qualità. Queste sfide possono essere affrontate chiudendo il processo e adottando piattaforme di produzione automatizzate. In questo studio, abbiamo sviluppato un processo chiuso e semi-automatizzato per il passaggio e la raccolta delle hMSC derivate dalla gelatina di Wharton (WJ) (WJ-hMSC) da palloni multistrato utilizzando la centrifugazione controcorrente. Le WJ-hMSC sono state espanse utilizzando un mezzo privo di siero privo di siero (SFM XF) conforme alle normative e hanno mostrato proliferazione cellulare (raddoppio della popolazione) e morfologia comparabili alle WJ-hMSC espanse nei classici mezzi contenenti siero. Il nostro protocollo di raccolta semi-automatico chiuso ha dimostrato un elevato recupero cellulare (~ 98%) e vitalità (~ 99%). Le cellule lavate e concentrate mediante centrifugazione controcorrente hanno mantenuto l’espressione del marcatore di superficie WJ-hMSC, le unità formanti colonie (CFU-F), il potenziale di differenziazione del trilineaggio e i profili di secrezione di citochine. Il protocollo di raccolta delle celle semi-automatizzato sviluppato nello studio può essere facilmente applicato per l’elaborazione su piccola e media scala di varie celle aderenti e in sospensione collegandosi direttamente a diverse piattaforme di espansione cellulare per eseguire la riduzione del volume, il lavaggio e la raccolta con un basso volume di output.
Le cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) sono un ottimo candidato per applicazioni cliniche, sia nell’ingegneria tissutale che nelle terapie cellulari, dato il loro potenziale terapeutico e l’elevato potenziale di auto-rinnovamento per crescere in vitro, che sono fondamentali per generare dosaggi clinicamente rilevanti delle cellule 1,2,3. Secondo ClinicalTrials.gov, ci sono oltre 1.000 studi clinici attualmente in fase di indagine per varie condizioni di malattia4. Dato il contesto di crescente interesse per l’uso di hMSC, ulteriori studi clinici e approvazioni di mercato sono imminenti nel prossimo futuro 5,6. Tuttavia, la produzione di hMSC presenta molte sfide intrinseche in termini di variabilità da lotto a lotto, l’uso di materie prime ad alto rischio, preoccupazioni relative alla contaminazione dovuta a molti processi aperti e manuali, poiché la produzione comporta operazioni di unità multiple, costi di manodopera più elevati, costi di scalabilità orizzontale o verticale e ostacoli normativi 6,7,8,9,10, 11,12. Questi problemi rimangono un ostacolo significativo all’accesso al mercato attuale e futuro.
Lo sviluppo di soluzioni di produzione chiuse, modulari e automatizzate e l’utilizzo di reagenti ausiliari a basso rischio affronterebbero queste sfide. Ciò garantirebbe anche una qualità costante del prodotto, ridurrebbe la probabilità di guasti dei lotti dovuti a errori umani, ridurrebbe i costi di manodopera e migliorerebbe la standardizzazione dei processi e la conformità normativa, ad esempio in termini di registrazione digitale dei lotti 8,12,13,14. Per essere in grado di ottenere un dosaggio clinicamente rilevante delle cellule, sia esso autologo o allogenico, è fondamentale una produzione semplificata che comporti l’espansione cellulare a monte e l’elaborazione a valle in modo chiuso e automatizzato.
Per l’espansione hMSC upstream, i due metodi di produzione più comuni attualmente utilizzati sono scale-out (monostrato 2D) e scale-up (sistema di sospensione basato su microcarrier 3D)15,16,17,18. Il metodo più tradizionale e ampiamente adottato per l’espansione hMSC è la coltura 2D basata su monostrato a causa del basso costo di produzione e della facilità di configurazione19.
I palloni multistrato composti da vassoi a superficie piatta impilati all’interno di un recipiente di coltura sono comunemente utilizzati per scalare la produzione hMSC. Questi sistemi sono tipicamente disponibili in recipienti di coltura da 1 a 40 strati20 e vengono gestiti manualmente all’interno di armadi di biosicurezza. Le fasi di lavorazione durante il passaggio e la raccolta delle celle comportano l’erogazione e la decantazione manuale del mezzo di espansione, del reagente di dissociazione e del tampone di lavaggio mediante pipettaggio o inclinazione fisica dell’intero serbatoio. Inoltre, la gestione di più unità è impegnativa e richiede tempo a causa delle loro dimensioni e del loro peso.
Successivamente, la post-raccolta da matraccio multistrato, la centrifugazione per lo scambio di supporti, il lavaggio delle cellule e la riduzione del volume sono passaggi essenziali nell’intero flusso di lavoro di produzione delle celle21. La centrifugazione convenzionale da banco è un processo per lo più aperto e manuale che comporta una moltitudine di passaggi, come il trasferimento della sospensione cellulare in tubi o bottiglie tappati all’interno di un armadio di biosicurezza, la rotazione delle cellule, l’aspirazione manuale del surnatante, la risospensione cellulare con il tampone e ripetuti lavaggi cellulari. Ciò aumenta drasticamente sia il rischio di contaminazione dovuto all’apertura e alla chiusura dei tappi sia le possibilità di perdere il pellet cellulare durante il processo manuale di aspirazione/pipettaggio22. Nel contesto della gestione di sistemi di coltura multistrato per cellule aderenti come le hMSC, l’operatore dovrebbe passare ripetutamente attraverso un laborioso processo di spola tra la centrifuga e l’armadio di biosicurezza e maneggiare contemporaneamente un’unità pesante. Queste fasi manuali sono laboriose, comportano rischi in termini di errori umani e contaminazione e devono essere condotte in un ambiente di camera bianca di classe B, che è costoso23. Inoltre, il processo di centrifugazione manuale convenzionale non è scalabile e potrebbe causare taglio cellulare e stress; Pertanto, massimizzare il recupero cellulare, la vitalità e l’efficienza di wash-out delle impurità residue sono altre importanti sfide22. La produzione commerciale su scala cGMP di terapie cellulari richiede soluzioni di automazione chiuse e modulari per ridurre il rischio di contaminazione, garantire una qualità costante del prodotto, ridurre i costi di manodopera e produzione e aumentare l’affidabilità del processo24,25. I palloni multistrato possono essere gestiti come un sistema chiuso avendo un filtro sterile da 0,2 μm in una delle porte per facilitare lo scambio di gas sterile e una seconda porta collegata asetticamente tramite connettori o saldati a tubi direttamente a uno strumento automatizzato per il trattamento delle celle per la raccolta delle cellule. Abbiamo lavorato per chiudere e automatizzare la maggior parte delle fasi di passaggio e raccolta WJ-hMSC valutando un’innovativa centrifuga chiusa in controcorrente destinata alla produzione di prodotti a base di cellule, geni o tessuti. Questa centrifuga controcorrente ha anche la flessibilità di eseguire una varietà di applicazioni di lavorazione cellulare, come la separazione cellulare in base alle dimensioni, allo scambio di mezzi/tamponi, alla concentrazione e alla raccolta per una varietà di tipi di cellule 8,26,27,28. Lo strumento utilizza un kit monouso chiuso che può essere collegato sterile utilizzando saldatura di tubi o connettori asettici per trasferire i sacchi o può essere collegato direttamente a qualsiasi piattaforma di espansione scelta.
In questo studio, abbiamo progettato un gruppo di tubi personalizzato per consentire connessioni sterili chiuse tra il kit di centrifugazione controcorrente monouso e il pallone multistrato. Abbiamo ottimizzato un protocollo per staccare, lavare e raccogliere enzimaticamente le WJ-MSC dal pallone multistrato in modo completamente chiuso e semi-automatizzato all’interno di un singolo ciclo. Le WJ-hMSC raccolte sono state caratterizzate per purezza (analisi dei marcatori di superficie) e potenza (CFU-F, differenziazione del trilineaggio e profili di secrezione di citochine) per garantire che il prodotto finale soddisfacesse gli attributi critici di qualità (CQA) per il rilascio del lotto.
In questo lavoro, abbiamo dimostrato la capacità di chiudere e semi-automatizzare la dissociazione hMSC e il lavaggio e la raccolta sul banco utilizzando uno strumento di centrifugazione controcorrente. Uno dei passaggi critici nell’intero flusso di lavoro è assicurarsi che i tubi siano collegati secondo il protocollo preimpostato definito nel generatore di protocolli del sistema di centrifugazione controcorrente. La configurazione e il funzionamento sono semplici e il tempo necessario per elaborare circa 2 litri di coltura da un pallone a 10 strati dall’assemblaggio del kit alla raccolta delle celle è stato di circa 60 minuti. Uno dei passaggi limitanti di questo flusso di lavoro è il trasferimento del fluido dal pallone multistrato ai sacchi di trasferimento collegati allo strumento di centrifugazione controcorrente. Il kit monouso ad alto flusso può essere utilizzato solo a una portata massima di 165 ml/min, e questo potrebbe essere difficile per la lavorazione, ad esempio, di un pallone a 40 strati. Per accelerare il processo di trasferimento del fluido, è possibile utilizzare pompe esterne ad alta portata per trasferire prima il contenuto tripsinizzato in un sacco di trasferimento, quindi lavare/concentrare e raccogliere le celle dal sacco di trasferimento utilizzando il sistema di centrifugazione controcorrente. Inoltre, questo protocollo può essere applicato anche per il passaggio di celle da matraccio multistrato a 4 strati a 10 strati. Più a monte, il sistema di centrifugazione controcorrente potrebbe anche essere ottimizzato per il lavaggio di hMSC scongelate e la raccolta diretta e la formulazione del terreno in palloni multistrato per avviare il treno di semi. Va notato che il numero minimo di celle necessarie per formare il letto fluidizzato nella camera di centrifugazione controcorrente è di circa 30 milioni di celle e il volume massimo raccomandato per il trattamento per lotto è di 20 L.
Attualmente, il fissaggio del gruppo di tubi personalizzati al pallone multistrato nell’armadio di biosicurezza e l’autoclave delle parti dei componenti non sono desiderabili in un ambiente cGMP. In alternativa, un gruppo di tubi personalizzato sterilizzato con raggi gamma potrebbe essere esternalizzato ai fornitori. I fornitori che forniscono palloni multistrato offrono anche la possibilità di pre-montare i palloni con i gruppi di tubi desiderati, incluso un filtro da 0,2 μm e la sterilizzazione gamma dell’intero equipaggiamento. Ciò garantirebbe che i palloni multistrato e i tubi collegati siano veramente chiusi, il che significa che il processo potrebbe essere completato sul banco in una camera bianca di Classe C.
Questo processo che utilizza il sistema di centrifugazione controcorrente non è limitato alle cellule in coltura a base aderente in un recipiente multistrato e potrebbe essere adattato a piattaforme di espansione cellulare basate su sospensioni dinamiche (serbatoio agitato o ad onda) e statiche (permeabili ai gas). In particolare, per le hMSC espanse in colture di microcarrier 3D, i protocolli possono essere ottimizzati sul sistema di centrifugazione controcorrente per raccogliere, lavare e formulare le hMSC dissociate dai microcarrier.
Nel complesso, il crescente interesse per lo sviluppo di terapie cellulari traslazionali con maggiore robustezza e affidabilità del processo ha portato allo sviluppo di piattaforme di elaborazione cellulare chiuse e automatizzate. Questi sistemi sono fondamentali, in quanto riducono il numero di fasi di movimentazione, prevengono potenziali contaminazioni da connessioni sterili e riducono i costi di produzione riducendo la manodopera e migliorando l’uso efficace dello spazio della camera bianca21. In linea con questo, molti degli sviluppatori di prodotti per terapia cellulare che stanno cercando l’approvazione normativa per tradurre le loro terapie sono consapevoli dell’importanza di chiudere il processo e implementare l’automazione completa o semi-automazione già nella fase di sviluppo del processo 14,31,32.
Con l’uso di un mezzo SFM XF conforme alle normative e insieme a reagenti ausiliari conformi alle 21 CFR GMP Part 11 e alle linee guida internazionali sulla qualità, questo processo semi-automatizzato sarebbe facilmente adatto per la produzione clinica. Abbiamo dimostrato la riproducibilità del processo chiuso e il mantenimento della qualità delle WJ-MSC. Migliorare l’efficienza e la sicurezza della coltura di cellule aderenti in flaconi multistrato andrebbe a beneficio non solo del campo della terapia hMSC, ma anche delle aziende nel settore bancario delle linee cellulari e nella produzione di virus aderenti.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano riconoscere il sostegno del finanziamento Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) (H18/01/a0/021 e H18/AH/a0/001) di A * STAR, Singapore.
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |