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Neuroscience

Microdisección y microscopía electrónica de barrido de montaje completo Visualización del plexo coroideo del ratón

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64733
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB Center for Inflammation Research, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University
* These authors contributed equally

Summary

El plexo coroideo (PC), un tejido poco estudiado en neurociencia, desempeña un papel clave en la salud y la enfermedad del sistema nervioso central. Este protocolo describe una técnica de microdisección para aislar el PC y el uso de microscopía electrónica de barrido para obtener una visión global de su estructura celular.

Abstract

El plexo coroideo (PC), una estructura altamente vascularizada que sobresale en los ventrículos del cerebro, es uno de los tejidos menos estudiados en neurociencia. A medida que cada vez está más claro que esta pequeña estructura desempeña un papel crucial en la salud y la enfermedad del sistema nervioso central (SNC), es de suma importancia diseccionar adecuadamente el PC de los ventrículos cerebrales de una manera que permita el procesamiento posterior, que va desde el análisis funcional hasta el estructural. Aquí, se describe el aislamiento del PC del ratón del ventrículo lateral y del cuarto ventrículo cerebral sin la necesidad de herramientas o equipos especializados. Esta técnica de aislamiento preserva la viabilidad, función y estructura de las células dentro del PC. Debido a su alta vascularización, el PC se puede visualizar flotando dentro de las cavidades ventriculares del cerebro utilizando un microscopio binocular. Sin embargo, la perfusión transcárdica requerida para el análisis posterior puede complicar la identificación del tejido CP. Dependiendo de los pasos de procesamiento adicionales (por ejemplo, análisis de ARN y proteínas), esto se puede resolver visualizando el PC a través de la perfusión transcárdica con azul de bromofenol. Después del aislamiento, el PC se puede procesar utilizando varias técnicas, incluyendo ARN, proteína o análisis de células individuales, para obtener una mayor comprensión de la función de esta estructura cerebral especial. Aquí, la microscopía electrónica de barrido (SEM) en CP de montaje completo se utiliza para obtener una visión general de la estructura.

Introduction

Las barreras estrechas separan el sistema nervioso central (SNC) de la periferia, incluida la barrera hematoencefálica (BBB) y la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (LCR). Estas barreras protegen el SNC contra insultos externos y aseguran un microambiente equilibrado y controlado 1,2,3. Si bien la barrera hematoencefálica se ha estudiado ampliamente a lo largo del tiempo, la barrera sangre-LCR ubicada en el plexo coroideo (PC) solo ha ganado un creciente interés de investigación durante la última década. Esta última barrera se puede encontrar en los cuatro ventrículos del cerebro (Figura 1A, B) y se caracteriza por una sola capa de células epiteliales del plexo coroideo (CPE) que rodean un estroma central, capilares con fugas, fibroblastos y una población de células linfoides y mieloides (Figura 1C)4,5,6. Las células CPE están firmemente interconectadas por uniones estrechas, evitando así la fuga de los capilares sanguíneos fenestrados subyacentes hacia el LCR y el cerebro. Además, el transporte a través de las células CPE está regulado por una serie de sistemas de transporte hacia adentro y hacia afuera que manejan la afluencia de compuestos beneficiosos (por ejemplo, nutrientes y hormonas) de la sangre al LCR y el flujo de salida de moléculas dañinas (por ejemplo, desechos metabólicos, exceso de neurotransmisores) en la otra dirección 1,6. Para poder ejercer su función de transporte activo, las células CPE contienen numerosas mitocondrias en su citoplasma7. Además, el PC es la principal fuente de LCR y actúa como el guardián del cerebro por la presencia de células inflamatorias residentes1. Debido a su ubicación única entre la sangre y el cerebro, el PC también está perfectamente posicionado para llevar a cabo la vigilancia inmune8.

Figure 1
Figura 1: Descripción esquemática de la ubicación y composición del plexo coroideo (PC). El tejido CP (A, B) se encuentra dentro de los dos ventrículos laterales, tercero y cuarto de (A) cerebro humano y (B) de ratón. (C) El tejido CP consiste en una sola capa de células de epitelio CP cuboidal (CPE) estrechamente conectadas que rodean los capilares fenestrados, el tejido conectivo suelto y las células linfoides y mieloides, y forma la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (adaptada y modificada de la referencia23). Figura creada con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Durante la última década, la creciente evidencia, incluyendo varios informes de nuestro grupo de investigación, han revelado que la PC juega un papel central en la salud y la enfermedad 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por ejemplo, se sabe que la barrera sangre-LCR envejecida presenta alteraciones morfológicas en, entre otros, los núcleos, las microvellosidades y la membrana basal 1,19. Además, en el contexto de la enfermedad de Alzheimer, la integridad general de la barrera se ve comprometida y todos estos cambios relacionados con la edad parecen ser aún más pronunciados 1,8,20. Además de los cambios morfológicos, el transcriptoma, el proteoma y el secretoma del PC se alteran durante la enfermedad 12,21,22,23. Por lo tanto, el conocimiento avanzado de la PC es esencial para comprender mejor su papel en las enfermedades neurológicas y potencialmente desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.

Un método eficiente para la microdisección precisa de la PC fuera de los ventrículos cerebrales es el primer paso invaluable para permitir la investigación adecuada de esta pequeña estructura cerebral. Debido a su naturaleza altamente vascularizada (Figura 2B), el PC que flota dentro de las cavidades ventriculares del cerebro se puede identificar utilizando un microscopio binocular. Sin embargo, a menudo se requiere perfusión transcárdica para el análisis posterior, lo que complica la identificación y el aislamiento adecuados del tejido CP (Figura 2C). Si los pasos de procesamiento adicionales lo permiten (por ejemplo, en el caso del análisis de ARN y proteínas), el PC se puede visualizar mediante perfusión transcárdica con azul de bromofenol (Figura 2A). Varias publicaciones ya describen el aislamiento del PC de cerebros de ratas24 y crías de ratón25. Aquí, se describe una técnica de aislamiento de microdisección para aislar el PC de ratones adultos. Es importante destacar que esta técnica de aislamiento preserva la viabilidad, función y estructura de las células dentro del PC. Aquí se describe el aislamiento del PC flotando en el cuarto ventrículo y lateral. En resumen, los ratones son anestesiados terminalmente y, si es necesario, perfundidos transcárdicamente. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la perfusión puede dañar la estructura de las células dentro de la PC. En consecuencia, si la muestra se va a analizar utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBF-SEM) o SEM de haz de iones enfocado (FIB-SEM), no se debe realizar perfusión. A continuación, se aísla todo el cerebro y se utilizan fórceps para hemisectar sagitalmente el cerebro. A partir de aquí, los PC que flotan en los ventrículos laterales se pueden identificar y diseccionar, mientras que el PC del cuarto ventrículo se puede aislar del lado cerebeloso del cerebro.

Figure 2
Figura 2: Visualización del plexo coroideo (PC) del ventrículo lateral (A-C) y (D-F) después de la perfusión (A,D) de azul de bromofenol, (B,E) sin perfusión y (C,F) con PBS/heparina. Las imágenes se toman con un microscopio estéreo (aumento de 8x-32x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una vez que el PC se disecciona adecuadamente de los ventrículos cerebrales, se puede aplicar todo un repertorio de técnicas para obtener una mayor comprensión de la función de esta estructura. Por ejemplo, la citometría de flujo o la secuenciación de ARN unicelular pueden realizarse para cuantificar y analizar fenotípicamente las células inflamatorias infiltrantes bajo ciertas condiciones de enfermedad26,27. Además de la composición celular, la composición molecular del PC puede analizarse para evaluar la presencia de citoquinas y quimiocinas mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoblot o mediante análisis simultáneo de múltiples citoquinas utilizando la matriz de perlas de citoquinas28. Además, se pueden realizar análisis de transcriptoma, vascular, histología de células inmunes y secretoma en los explantes de CP microdisecados29. Aquí, la microscopía electrónica de barrido (SEM) en CP de montaje completo se utiliza para obtener una visión general de la estructura CP. SEM utiliza un haz de electrones enfocados para escanear sobre la superficie y crear una imagen de la topografía y composición de la superficie. Dado que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de la luz, la resolución de SEM está en el rango nanométrico y es superior a la de un microscopio óptico. En consecuencia, los estudios morfológicos a nivel subcelular se pueden realizar a través de SEM. Brevemente, el CP disecado se transfiere inmediatamente a un fijador que contiene glutaraldehído para una fijación durante la noche, seguida de osmicación y tinción de acetato de uranilo. Luego, las muestras se tratan con tinción de aspartato de plomo, se deshidratan y, en última instancia, se incrustan para obtener imágenes.

Por lo tanto, este protocolo facilita el aislamiento eficiente de la PC de los ventrículos cerebrales del ratón, que se pueden analizar más a fondo utilizando una variedad de técnicas posteriores para investigar su estructura y función.

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Protocol

Todos los experimentos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con la legislación nacional (Ley belga 14/08/1986 y 22/12/2003, Real Decreto belga 06/04/2010) y europea (Directivas de la UE 2010/63 / UE, 86/609 / CEE). Todos los experimentos en ratones y protocolos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Gante (número de permiso LA1400091 y EC 2017-026).

1. Preparación

  1. Anestésicos: Preparar un anestésico terminal. Por ejemplo, se puede preparar una solución de pentobarbital sódico (≥100 mg/kg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Solución de perfusión transcárdica: Preparar 10 ml (por ratón) de PBS/heparina (que contiene 0,2% de heparina) solución suplementada con azul de bromofenol al 0,5%.
    NOTA: Si los pasos de procesamiento posteriores lo permiten (por ejemplo, en el caso del análisis de ARN y proteínas), el plexo coroideo (CP) se puede visualizar a través de la perfusión transcárdica con azul de bromofenol. Si el azul de bromofenol no es compatible con los pasos de procesamiento adicionales (por ejemplo, para imágenes), use PBS/heparina para perfundir.
  3. Preparar las soluciones necesarias para el análisis SEM.
    1. Preparar tampón de Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4). Preparar una solución de paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2,5% en tampón Na-cacodilato 0,1 M. Hacer 20 ml de esta solución por muestra.
    2. Preparar tetróxido de osmio al 2% en tampón de Na-cacodilato 0,1 M (5 ml por muestra).
    3. Prepare soluciones de EtOH al 50%, 70%, 85% y 100%. Preparar 5 ml de cada solución de EtOH por muestra.

2. Microdisección del plexo coroideo fuera del ventrículo lateral y cuarto ventrículo

NOTA: En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL / 6 de 9 semanas de edad. Sin embargo, la técnica de aislamiento descrita es independiente de la cepa, el sexo y la edad del ratón adulto.

  1. Aislar el cerebro del ratón.
    1. Inyectar por vía intraperitoneal una dosis letal de un barbitúrico de acción corta (>100 mg/kg, preparado en el paso 1.1) utilizando una aguja de 26G para anestesiar terminalmente al ratón. Compruebe el reflejo del pie del ratón pellizcando su pata trasera con fórceps.
    2. Cuando no haya reflejo del pie, coloque al animal anestesiado terminalmente en la posición de decúbito dorsal y fije el ratón fijando las extremidades en una placa.
      NOTA: Si no se necesita perfusión transcárdica de los ratones, dependiendo del método de análisis posterior (por ejemplo, para imágenes SEM), continúe con el paso 2.1.7. Sin embargo, si se necesita perfusión para eliminar las células sanguíneas u otros componentes de la sangre, el PC se puede visualizar como una estructura azul que flota en los ventrículos cerebrales a través de la perfusión con azul de bromofenol.
    3. Desinfecte el pecho rociando etanol al 70%. Coloque una cortina estéril alrededor del área quirúrgica. Haga una incisión de ~4 cm justo debajo del diafragma con una cuchilla quirúrgica de acero al carbono (consulte la Tabla de materiales).
    4. Abra la piel y exponga el pecho con tijeras quirúrgicas. Corte el diafragma completamente abierto.
    5. Separe el tórax para exponer los pulmones y el corazón latiendo.
    6. Perfundir transcárdicamente a los ratones con 10 ml de la solución de perfusión a una velocidad de 4,5 ml / min, utilizando una bomba de perfusión (ver Tabla de materiales). La perfusión tomará ~2 min. Inserte una aguja de 26G en el ventrículo izquierdo para bombear la solución al circuito sistémico. Además, haga un corte con tijeras quirúrgicas en la aurícula derecha para que la sangre pueda salir de la circulación.
      NOTA: Se prefiere una bomba de perfusión a la administración manual del fluido, ya que suministrará los fluidos a una velocidad programada con precisión y asegurará que las fuerzas de cizallamiento causadas por la perfusión no sean demasiado fuertes. Las fuerzas de cizallamiento excesivas comprometerán la viabilidad y la estructura de las células dentro de la PC. Además, la tasa de flujo de perfusión recomendada aquí es óptima para perfundir ratones adultos a partir de las 7 semanas. Si se utilizan ratones más jóvenes, se debe utilizar un caudal más bajo. También es importante eliminar la sangre que sale de la aurícula derecha para preservar un sitio quirúrgico limpio.
    7. Decapitar al ratón.
      NOTA: Tenga cuidado de cortar la cabeza lo más bajo posible hasta el hombro para preservar la estructura cerebral. Si el corte es demasiado alto, el cerebelo puede dañarse.
    8. Después de la decapitación, abra el cuero cabelludo haciendo una incisión desde entre las orejas hasta la parte superior de los ojos. Tire de la piel lateralmente para exponer el cráneo. Luego, abra el cráneo siguiendo las suturas escamosas, hacia la parte nasal.
      NOTA: Es importante extraer suavemente el cráneo para mantener la integridad del cerebro.
    9. Coloque el cerebro en una placa de Petri helada y agregue 1 ml de PBS 1x helado en el tejido cerebral.
      NOTA: No es necesario recubrir el plato.
  2. Aislar la PC que flota en el cuarto ventrículo.
    1. Corte suavemente el cerebelo del cerebro con un bisturí. El cerebro es la parte más grande del cerebro, mientras que el cerebelo es una parte mucho más pequeña en la parte posterior del cerebro. Si es necesario, retire las partes restantes del tejido del tronco encefálico del cerebelo.
    2. Gire el cerebro para que la línea de corte quede hacia arriba. Asegúrese de que la cuarta cavidad del ventrículo ahora sea visible en el centro de la sección, con el PC flotando en el sitio dorsal. Si es necesario, abra un poco el ventrículo abriendo el tejido conectivo con pinzas afiladas. De esta manera, el PC será más visible y más fácil de alcanzar.
    3. Arranca suavemente la PC de la pared del ventrículo con fórceps diminutos y afilados.
      NOTA Es importante tocar y extraer el CP en este paso para no contaminar la muestra con el tejido circundante. La apertura de los ventrículos como se describe en el paso 2.2.2 facilitará el paso 2.2.3.
  3. Aísle la PC que sobresale del ventrículo lateral.
    1. Use fórceps diminutos y afilados para cortar sagitalmente el cerebro en dos hemisferios.
    2. Gire el cerebro para que la línea de corte quede hacia arriba. Para revelar el ventrículo lateral, retire suavemente la corteza del tálamo.
    3. Retraiga el hipocampo hasta la línea de corte sagital media. El ventrículo lateral ahora es visible con el PC en la parte inferior del ventrículo. Si es necesario, abra un poco el ventrículo abriendo el tejido conectivo con pinzas afiladas. De esta manera, el PC será más visible y más fácil de alcanzar.
    4. Use fórceps diminutas y afiladas para arrancar suavemente la PC de la pared del ventrículo.
      NOTA: Es importante tocar y extraer el PC en este paso para no contaminar la muestra con el tejido circundante. La apertura de los ventrículos como se describe en el paso 2.3.4 facilitará el paso 2.3.5. Tenga las precauciones necesarias en este paso para preservar la estructura del PC tanto como sea posible. Es más fácil comenzar a tirar del CP en la dirección rostral a caudal.

3. Análisis morfológico del tejido CP mediante microscopía electrónica de barrido (SEM)

PRECAUCIÓN: Las soluciones tóxicas se utilizan en los siguientes pasos de procesamiento. Se recomienda realizar la preparación de la muestra en una campana extractora.

  1. Realice la preparación de muestras para SEM como se describe a continuación.
    1. Transfiera el CP aislado fresco a una solución de fijación recién hecha que contenga paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2,5% en tampón de Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4). Incubar durante la noche a 4 °C.
      NOTA: Como el tejido CP es muy frágil y delgado, el tejido debe colocarse en pequeñas cestas de muestras (consulte la Tabla de materiales) para transferirlo entre tampones. De esta manera, la estructura del tejido se conservará mejor. Se utiliza un fijador a base de cacodilato sobre uno basado en PBS, ya que el tampón de cacodilato fuerte puede contrarrestar el bajo pH del glutaraldehído en el fijador EM.
    2. Lavar la muestra 3 veces durante 5 minutos cada una con 3-5 ml de tampón de Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4).
    3. Fijar las muestras en 3-5 mL de tetróxido de osmio al 2% en tampón de Na-cacodilato 0,1 M durante 30 min. Lave las muestras 3 veces durante 5 minutos cada una con 3-5 ml de agua ultrapura.
    4. Deshidratar las muestras en una serie de soluciones heladas de concentraciones crecientes de EtOH (50%, 70%, 85%, 100%), durante 15 min por solución de EtOH. Utilice un secador de punto crítico para secar correctamente la muestra.
      NOTA El cambio de fase líquida a gaseosa afecta la tensión superficial, causando daños a la estructura de la superficie. El paso de secado del punto crítico permite la preservación de la estructura de la superficie.
    5. Coloque la muestra cuidadosamente en un soporte de muestra provisto de una etiqueta adhesiva de carbono (consulte la Tabla de materiales).
    6. Cubra las muestras con una capa delgada (2-5 nm) de platino. Para ello, monte una fuente de platino en un sistema de vacío entre dos terminales eléctricos de alta corriente y caliente el platino a su temperatura de evaporación. Una fina corriente de platino se deposita en la muestra.
      Nota : un protocolo más detallado para este paso se proporciona en la referencia30. Además del platino, también se puede usar oro u oro/paladio.
  2. Visualice las muestras de CP con SEM (consulte la Tabla de materiales). El procedimiento de visualización del tejido CP a través de SEM es similar al de otros tipos de tejidos y depende del software y los instrumentos utilizados. Un protocolo SEM paso a paso con un video adjunto está disponible en la referencia31 o referencia30.

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Representative Results

El protocolo descrito facilita el aislamiento eficiente de la PC de los ventrículos laterales del cerebro del ratón (Figura 2A-C) y cuarto (Figura 2D-F). Después de aislar todo el cerebro, se utilizan fórceps para hemisectar sagitalmente el cerebro e identificar los CP que flotan en los ventrículos laterales. La PC del cuarto ventrículo se puede aislar del lado cerebeloso del cerebro. La perfusión con azul de bromofenol se puede utilizar para visualizar el PC (Figura 2A, D); sin embargo, cuando no se permite el azul de bromofenol en las etapas de procesamiento adicionales, se puede realizar la perfusión con PBS/heparina (Figura 2C, F) o ninguna perfusión (Figura 2B, E). Después de aislar el PC de los ventrículos cerebrales, se puede realizar todo un repertorio de análisis en el tejido. Estos incluyen el perfil de expresión génica (RT-qPCR)28, el perfil del tipo celular (citometría de flujo32, secuenciación de ARN unicelular 26,27) y la detección de citoquinas y quimiocinas 28mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoblot o inmunoensayos multiplex. Además, el CP microdisecado puede ser puesto en cultivo para realizar explantes de CP para dilucidar aún más la función y, por ejemplo, estudiar su secretoma en respuesta a un estímulo específico23,28,29. En este manuscrito, describimos cómo realizar microscopía electrónica de barrido (SEM) para analizar morfológicamente la superficie de las células epiteliales del plexo coroideo (CPE). La Figura 3 muestra imágenes generales del PC aislado del cuarto ventrículo (Figura 3A) y del PC aislado del ventrículo lateral (Figura 3B), obtenidas mediante SEM. Estas imágenes muestran claramente la forma típica en forma de C de la PC lateral y la estructura de dos brazos de la PC del cuarto ventrículo. 

Figure 3
Figura 3: Descripción general de las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) del tejido disecado del plexo coroideo (PC). (A,B) Imagen SEM representativa del PC aislado de los ventrículos (A) cuarto y (B) lateral del cerebro del ratón. Barra de escala = 100 μm. Ajustes: electrón de alta tensión (EHT) = 5,00 kV; distancia de trabajo (WD) = 4,8 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Al acercar las células CPE, se pueden detectar otras células en el lado apical de las células CPE (Figura 4A). La célula capturada en la imagen es posiblemente una célula epiplexo, una célula similar a un macrófago que reside en la superficie apical del CP. Sin embargo, no es posible identificar la naturaleza específica de esta célula a través de SEM. Además de la imagen SEM, es posible realizar imágenes de dos fotones del epitelio del plexo coroideo en explantes vivos, como lo muestran Shipley et al.29. Mientras que SEM facilita la visualización de las estructuras superficiales del CP, las imágenes de dos fotones pueden permitir la visualización de una amplia gama de células y procesos celulares, siempre que puedan ser monitoreados con fluorescencia. Esto incluye la visualización de las células vasculares e inmunes, así como los eventos secretores en el explante de PC29.

Un mayor aumento de SEM reveló estructuras similares a vesículas en el lado apical de las células CPE (Figura 4B), así como microvellosidades (Figura 4C). Estas microvellosidades sobresalen en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y aumentan el área de superficie celular CPE entre las células y el LCR. Estos resultados muestran que las alteraciones morfológicas de las células CPE en condiciones de enfermedad pueden ser investigadas mediante SEM.

Figure 4
Figura 4: Imágenes detalladas de microscopía electrónica de barrido (SEM ) del tejido del plexo coroideo (PC). (A) Una célula en el lado apical de las células epiteliales del plexo coroideo (CPE). Barra de escala = 2 μm. (B) Estructuras en forma de vesícula en el lado apical de las células CPE. Barra de escala = 10 μm. (C) Visualización de la superficie de una célula CPE con sus microvellosidades. Barra de escala = 1 μm. Ajustes: electrón de alta tensión (EHT) = 5,00 kV; distancia de trabajo (WD) = 4,9 mm; Aumento de 3.000x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, se describe un método para aislar el plexo coroideo (PC) fuera del ventrículo lateral y el cuarto ventrículo de un cerebro de ratón. Todo este método de montaje del PC facilita el análisis posterior utilizando un repertorio de técnicas para obtener una visión completa de la morfología del PC, la composición celular, el transcriptoma, el proteoma y el secretoma. Tales análisis son cruciales para obtener una mejor comprensión de esta notable estructura que sobresale de los ventrículos del cerebro. Este conocimiento es de inmenso interés para la investigación, ya que cada vez está más claro que el PC desempeña un papel crucial en la salud y la enfermedad 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Pasos críticos, modificaciones y solución de problemas del método
Es de suma importancia verificar el reflejo del pie del ratón para asegurarse de que la anestesia terminal esté bien realizada. Además de las razones éticas, esto también asegura que el ratón se mantenga en el lugar correcto mientras realiza el procedimiento experimental. El objetivo es anestesiar al animal para que no experimente dolor durante el procedimiento mientras el corazón late en el momento de la perfusión. Si el procesamiento adicional del tejido requiere la extracción de sangre, se puede realizar la perfusión transcárdica. La solución salina que contiene heparina se usa aquí para evitar la coagulación de la sangre. EDTA también se puede utilizar para este propósito, sin embargo, si es necesario para preservar la viabilidad celular, la heparina es una mejor opción sobre EDTA. La perfusión debe iniciarse inmediatamente cuando el corazón deja de latir debido a la anestesia excesiva. Una bomba de perfusión es preferible a la administración manual del fluido, ya que esto permite el suministro de fluido a una velocidad programada con precisión y asegura que las fuerzas de cizallamiento causadas por la perfusión no sean demasiado fuertes. Las fuerzas de cizallamiento excesivas comprometerán la viabilidad y la estructura de las células dentro del CP.

Se necesita un ojo entrenado para poder ver el PC flotando en los ventrículos cerebrales del ratón. Por esta razón, es de suma importancia practicar mucho. Se recomienda comenzar el entrenamiento en ratones perfundidos con azul de bromofenol, ya que esto teñirá el PC en azul y facilitará la discriminación del pequeño tejido CP del resto del cerebro (Figura 2A, D). En ensayos posteriores, el PC se puede aislar de un ratón no perfundido. Esto es más difícil en comparación con el aislamiento de CP de un ratón perfundido con azul de bromofenol, pero el tejido CP aún se puede identificar por su naturaleza altamente vascularizada (Figura 2B, E). Solo después de un entrenamiento extenso es posible aislar el tejido CP de los ventrículos cerebrales de un ratón no perfundido sin contaminación con parénquima cerebral (Figura 2C, F).

La PC es una estructura muy frágil y delgada, lo que implica que su aislamiento debe realizarse con la prudencia necesaria para preservar la viabilidad, función y estructura de las células dentro de ella. Por lo tanto, los diferentes pasos en el protocolo descrito deben realizarse con la precisión y precaución necesarias para preservar la integridad cerebral. Primero, es importante decapitar al ratón cerca de los hombros. Si el corte es demasiado alto, el cerebelo puede dañarse, complicando el aislamiento de la PC en el cuarto ventrículo. A continuación, el cráneo debe extraerse con cuidado para no dañar el cerebro. Una vez que el cerebro está aislado, es crucial mantenerlo frío para evitar que el cerebro se vuelva blando, ya que esto complicará significativamente el aislamiento de PC. Para hacerlo, es importante colocar el cerebro en una placa de Petri helada y agregar PBS helado sobre el cerebro. Es necesario un cierto nivel de entrenamiento para realizar la técnica de aislamiento descrita, ya que esto acortará significativamente el tiempo de procesamiento entre la decapitación del ratón y el aislamiento final del PC. Un breve proceso de aislamiento mejorará la viabilidad y la preservación de la estructura del tejido aislado. Finalmente, las herramientas utilizadas para el aislamiento, especialmente los fórceps, deben ser nítidas y puntiagudas para facilitar el aislamiento rápido y eficiente de la PC fuera de los ventrículos. Sin embargo, se debe tener cuidado de no dañar la integridad de la estructura durante el aislamiento.

Para preservar la integridad del tejido durante el procesamiento de muestras para SEM, el CP se puede colocar en pequeñas cestas de muestras cuando se transfiere entre tampones, de modo que se pueda evitar el contacto del tejido en sí. Además, se recomienda realizar un secado de punto crítico al mover el tejido fuera de las soluciones de EtOH. Esto asegura la preservación de la estructura superficial del CP, incluidas las microvellosidades. La tensión superficial, causada por la transición de la fase líquida a la gaseosa, podría dañar tales estructuras.

Limitaciones del método
Como se mencionó anteriormente, el PC es una estructura pequeña, y dependiendo de los análisis posteriores (por ejemplo, citometría de flujo), puede ser necesario agrupar el PC de diferentes ratones. Un obstáculo importante en el aislamiento de PC es la identificación de la estructura cuando todavía está flotando en el ventrículo. La naturaleza altamente vascularizada de la PC facilita su correcta identificación (después de algún entrenamiento) dentro de las cavidades ventriculares del cerebro. Sin embargo, si es necesario eliminar los componentes que contienen sangre para un análisis adicional, la perfusión transcárdica es esencial. Dependiendo del análisis posterior, se puede realizar la perfusión con azul de bromofenol, que teñirá el azul CP, facilitando así el aislamiento del tejido. Desafortunadamente, esta técnica de visualización no siempre es posible (por ejemplo, para la tinción inmunohistoquímica). En tales casos, el PC debe aislarse a ciegas, lo que requiere una capacitación adecuada. Jugar con la difracción de luz del microscopio puede ayudar a identificar el CP que flota en los ventrículos. Además, este manuscrito describe el aislamiento del PC flotando en el cuarto ventrículo y lateral, mientras que el aislamiento del tercer ventrículo CP no se discute.

Importancia con respecto a los métodos existentes
En este protocolo, la PC se disecciona primero fuera de los ventrículos cerebrales antes de realizar un análisis adicional. Si se utiliza un procedimiento de tinción como lectura de seguimiento, también es posible teñir secciones del cerebro que contienen la PC. El valor añadido de esta última técnica es que la orientación del tejido CP dentro de los ventrículos y el cerebro todavía es visible, lo que no es el caso si la PC se microdisecciona primero fuera de los ventrículos cerebrales. Por otro lado, teñir una sección cerebral que contiene PC proporciona información solo de esa sección específica, mientras que teñir la PC aislada puede ayudar a recopilar información sobre toda la PC.

La ventaja de la técnica descrita es que preserva la viabilidad, función y estructura de las células dentro del PC. Además, este método facilita el aislamiento completo de la PC que flota en el cuarto ventrículo cerebral y lateral en ratones adultos. Los métodos para el aislamiento de la PC (por ejemplo, de cerebros de rata24 y cerebros de crías de ratón25) se han informado previamente. Sin embargo, es importante considerar que la técnica de aislamiento puede diferir de una especie a otra y entre edades jóvenes y adultas.

Aplicaciones adicionales de la técnica
Además de preservar la viabilidad, función y estructura de las células dentro de la PC, esta técnica de aislamiento facilita la aplicación de técnicas posteriores para obtener una comprensión más profunda de la función de la PC. Por ejemplo, la citometría de flujo o la secuenciación de ARN unicelular pueden realizarse para cuantificar y analizar fenotípicamente las células CP y las células infiltrantes bajo ciertas condiciones de enfermedad26,27. Además, se puede investigar la composición molecular del PC para evaluar la presencia de citoquinas y quimiocinas mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoblot o análisis simultáneos de múltiples citoquinas mediante una llamada matriz de perlas de citoquinas. Además, se pueden realizar análisis de transcriptoma, vascular, histología de células inmunes y secretoma en los explantes de CP microdisecados29.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Belga para la Investigación del Alzheimer (SAO; número de proyecto: 20200032), la Fundación de Investigación de Flandes (FWO Vlaanderen; números de proyecto: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) y el Fondo Baillet Latour. Agradecemos al VIB BioImaging Core por la capacitación, el apoyo y el acceso al parque de instrumentos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G x 1/2 needle Henke Sass Wolf 4710004512
Aluminium specimen mounts EM Sciences 75220
Cacodylate buffer EM Sciences 11652
Carbon steel surgial blades Swann-Morton 0210 size: 0.45 mm x 12 mm
Carbon adhesive tabs -12 mm EM Sciences 77825-12
Critical point dryer  Bal-Tec  CPD030
Crossbeam 540 Zeiss SEM system
Forceps Fine Science Tools GmbH  91197-00
Glutaraldehyde EM Sciences 16220
Heparin Sigma-Aldrich H-3125
Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel Metrohm Belgium N.V CPA-7800160
Osmium Tetroxide  EM Sciences 19170
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffered saline (PBS) Lonza BE17-516F
Platinum  Quorum  Q150T ES PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered
Sodium pentobarbital Kela NV 514
Specimen Basket Stainless Steel EM Sciences 70190-01
Stemi DV4 Stereo microscope Zeiss
Surgical scissors Fine Science Tools GmbH  91460-11

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References

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Neurociencia Número 190 plexo coroideo enfermedades neurodegenerativas microscopía electrónica de barrido (SEM) sistema nervioso central cerebro
Microdisección y microscopía electrónica de barrido de montaje completo Visualización del plexo coroideo del ratón
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Van Wonterghem, E., Van Hoecke, L., Van Imschoot, G., Verhaege, D., Burgelman, M., Vandenbroucke, R. E. Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus. J. Vis. Exp. (190), e64733, doi:10.3791/64733 (2022).

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