Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Mikrodissektion och helmonterad svepelektronmikroskopi Visualisering av musplexus

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64733
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB Center for Inflammation Research, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University
* These authors contributed equally

Summary

Choroid plexus (CP), en understuderad vävnad inom neurovetenskap, spelar en nyckelroll i hälsa och sjukdom i centrala nervsystemet. Detta protokoll beskriver en mikrodissektionsteknik för att isolera CP och användningen av svepelektronmikroskopi för att få en övergripande bild av dess cellulära struktur.

Abstract

Choroid plexus (CP), en mycket vaskulariserad struktur som sticker ut i hjärnans ventriklar, är en av de mest understuderade vävnaderna inom neurovetenskap. Eftersom det blir allt tydligare att denna lilla struktur spelar en avgörande roll för hälsa och sjukdom i centrala nervsystemet (CNS), är det av yttersta vikt att korrekt dissekera CP ur hjärnkamrarna på ett sätt som möjliggör nedströms bearbetning, allt från funktionell till strukturell analys. Här beskrivs isolering av den laterala och fjärde hjärnventrikelmusen CP utan behov av specialverktyg eller utrustning. Denna isoleringsteknik bevarar livskraften, funktionen och strukturen hos celler inom CP. På grund av sin höga vaskularisering kan CP visualiseras flytande inuti hjärnans ventrikulära hålrum med hjälp av ett binokulärt mikroskop. Transkardiell perfusion som krävs för nedströmsanalys kan dock komplicera identifieringen av CP-vävnaden. Beroende på de ytterligare bearbetningsstegen (t.ex. RNA- och proteinanalys) kan detta lösas genom att visualisera CP via transkardiell perfusion med bromfenolblått. Efter isolering kan CP bearbetas med hjälp av flera tekniker, inklusive RNA, protein eller encellsanalys, för att få ytterligare förståelse för funktionen hos denna speciella hjärnstruktur. Här används svepelektronmikroskopi (SEM) på helmonterad CP för att få en helhetsbild av strukturen.

Introduction

Täta barriärer skiljer centrala nervsystemet (CNS) från periferin, inklusive blod-hjärnbarriären (BBB) och blod-cerebrospinalvätskebarriären (CSF). Dessa barriärer skyddar CNS mot yttre förolämpningar och säkerställer en balanserad och kontrollerad mikromiljö 1,2,3. Medan BBB har studerats omfattande över tiden har blod-CSF-barriären vid choroid plexus (CP) bara fått ökat forskningsintresse under det senaste decenniet. Denna senare barriär finns i hjärnans fyra ventriklar (figur 1A, B) och kännetecknas av ett enda lager av choroid plexus epitelceller (CPE) som omger ett centralt stroma, läckande kapillärer, fibroblaster och en lymfoid och myeloisk cellpopulation (figur 1C)4,5,6. CPE-cellerna är fast sammankopplade med snäva korsningar, vilket förhindrar läckage från de underliggande fenestrerade blodkapillärerna till CSF och hjärnan. Dessutom regleras transporten över CPE-cellerna av ett antal inåtgående och utgående transportsystem som hanterar inflödet av fördelaktiga föreningar (t.ex. näringsämnen och hormoner) från blodet till CSF och utflödet av skadliga molekyler (t.ex. metaboliskt avfall, överskott av neurotransmittorer) i andra riktningen 1,6. För att kunna utöva sin aktiva transportfunktion innehåller CPE-cellerna många mitokondrier i sin cytoplasma7. Dessutom är CP den viktigaste källan till CSF och fungerar som hjärnans portvakt genom närvaron av bosatta inflammatoriska celler1. På grund av sitt unika läge mellan blodet och hjärnan är CP också perfekt positionerat för att utföra immunövervakning8.

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över placeringen och sammansättningen av choroid plexus (CP). (A,B) CP-vävnad finns i de två laterala, tredje och fjärde ventriklarna hos (A) mänskliga och (B) mushjärnor. (C) CP-vävnaden består av ett enda lager av tätt anslutna kuboidala CP-epitelceller (CPE) som omger fenestrerade kapillärer, lös bindväv och lymfoida och myeloida celler och bildar blod-cerebrospinalvätskebarriären (anpassad och modifierad från referens23). Figur skapad med Biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Under det senaste decenniet har ökande bevis, inklusive flera rapporter från vår forskargrupp, visat att CP spelar en central roll i hälsa och sjukdom 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Det är till exempel känt att den åldrande blod-CSF-barriären uppvisar morfologiska förändringar i bland annat kärnorna, mikrovillierna och basalmembranet 1,19. Dessutom, i samband med Alzheimers sjukdom, äventyras den övergripande barriärintegriteten och alla dessa åldersrelaterade förändringar verkar vara ännu mer uttalade 1,8,20. Förutom morfologiska förändringar förändras transkriptomet, proteomet och sekretomet i CP under sjukdom 12,21,22,23. Således är avancerad kunskap om CP avgörande för att bättre förstå dess roll i neurologiska sjukdomar och potentiellt utveckla nya terapeutiska strategier.

En effektiv metod för exakt mikrodissektion av CP ur hjärnkamrarna är det första ovärderliga steget för att möjliggöra korrekt undersökning av denna lilla hjärnstruktur. På grund av sin mycket vaskulariserade natur (figur 2B) kan CP som flyter inuti hjärnans ventrikulära hålrum identifieras med hjälp av ett binokulärt mikroskop. Transkardiell perfusion krävs emellertid ofta för nedströmsanalys, vilket komplicerar korrekt identifiering och isolering av CP-vävnaden (figur 2C). Om de ytterligare bearbetningsstegen tillåter (t.ex. vid RNA- och proteinanalys) kan CP visualiseras via transkardiell perfusion med bromfenolblått (figur 2A). Flera publikationer beskriver redan isoleringen av CP från råtta24 och musvalphjärnor25. Här beskrivs en isoleringsteknik för mikrodissektion för att isolera CP från vuxna möss. Det är viktigt att denna isoleringsteknik bevarar livskraften, funktionen och strukturen hos cellerna i CP. Isoleringen av CP som flyter i fjärde och laterala ventriklarna beskrivs här. Kort sagt, mössen är terminalt bedövade och vid behov transcardially perfuserade. Det bör dock noteras att perfusion kan skada cellernas struktur inom CP. Om provet ska analyseras med transmissionselektronmikroskopi (TEM), seriell blockytsvepelektronmikroskopi (SBF-SEM) eller fokuserad jonstråle SEM (FIB-SEM), bör perfusion därför inte utföras. Därefter isoleras hela hjärnan, och pincett används för att sagittalt hemisect hjärnan. Härifrån kan CP som flyter i laterala ventriklarna identifieras och dissekeras, medan CP från den fjärde ventrikeln kan isoleras från hjärnans cerebellära sida.

Figure 2
Figur 2: Visualisering av (A-C) fjärde och (D-F) laterala ventrikeln choroid plexus (CP) efter (A,D) bromfenolblå perfusion, (B,E) ingen perfusion och (C,F) perfusion med PBS/heparin. Bilderna är tagna med ett stereomikroskop (8x-32x förstoring). Klicka här för att se en större version av denna figur.

När CP är korrekt dissekerad ur hjärnkamrarna kan en hel repertoar av tekniker tillämpas för att få ytterligare förståelse för funktionen av denna struktur. Till exempel kan flödescytometri eller encells-RNA-sekvensering utföras för att kvantifiera och fenotypiskt analysera de infiltrerande inflammatoriska cellerna under vissa sjukdomstillstånd26,27. Förutom den cellulära sammansättningen kan CP: s molekylära sammansättning analyseras för att bedöma närvaron av cytokiner och kemokiner via enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA), immunoblot eller genom samtidig analys av flera cytokiner med användning av cytokinpärlmatrisen28. Dessutom kan transkriptom-, kärl-, immuncellshistologi- och sekretomanalyser utföras på de mikrodissekerade CP-explanterna29. Här används svepelektronmikroskopi (SEM) på helmonterad CP för att få en helhetsbild av CP-strukturen. SEM använder en stråle av fokuserade elektroner för att skanna över ytan och skapa en bild av ytans topografi och sammansättning. Eftersom elektronernas våglängd är mycket mindre än ljusets är upplösningen av SEM i nanometerområdet och överlägsen den för ett ljusmikroskop. Följaktligen kan morfologiska studier på subcellulär nivå utföras via SEM. Kortfattat överförs den dissekerade CP omedelbart till ett glutaraldehydinnehållande fixeringsmedel för en fixering över natten, följt av osmication och uranylacetatfärgning. Proverna behandlas sedan med blyaspartatfläck, dehydreras och slutligen inbäddas för avbildning.

Således underlättar detta protokoll effektiv isolering av CP från mushjärnventriklarna, vilket kan analyseras ytterligare med hjälp av en mängd olika nedströmstekniker för att undersöka dess struktur och funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök som beskrivs i denna studie utfördes enligt den nationella (belgisk lag 14/08/1986 och 22/12/2003, belgisk kunglig förordning 06/04/2010) och europeisk lagstiftning (EU-direktiv 2010/63 / EU, 86/609 / EEG). Alla experiment på möss och djurprotokoll godkändes av etikkommittén vid Gents universitet (tillståndsnummer LA1400091 och EG 2017-026).

1. Förberedelse

  1. Narkosmedel: Förbered ett terminalbedövningsmedel. Till exempel kan en natriumpentobarbital (≥100 mg/kg) lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) framställas.
  2. Transkardiell perfusionslösning: Bered 10 ml (per mus) PBS / heparin (innehållande 0,2% heparin) lösning kompletterad med 0,5% bromfenolblått.
    OBS: Om nedströms bearbetningsstegen tillåter (t.ex. vid RNA- och proteinanalys) kan choroid plexus (CP) visualiseras via transkardiell perfusion med bromfenolblått. Om bromfenolblått inte är kompatibelt med de ytterligare bearbetningsstegen (t.ex. för avbildning), använd PBS / heparin för att perfusera.
  3. Förbered de lösningar som krävs för SEM-analys.
    1. Förbered 0,1 M Na-kakodylatbuffert (pH 7,4). Förbered en lösning av 2% paraformaldehyd och 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M Na-cacodylatbuffert. Gör 20 ml av denna lösning per prov.
    2. Bered 2% osmiumtetroxid i 0,1 M Na-kakodylatbuffert (5 ml per prov).
    3. Förbered 50 %, 70 %, 85 % och 100 % EtOH-lösningar. Bered 5 ml av varje EtOH-lösning per prov.

2. Mikrodissektion av choroid plexus ur lateral och fjärde ventrikeln

OBS: Kvinnliga, 9 veckor gamla C57BL / 6-möss användes i denna studie. Den beskrivna isoleringstekniken är emellertid oberoende av den vuxna musens stam, kön och ålder.

  1. Isolera mushjärnan.
    1. Injicera intraperitonealt en dödlig dos av ett kortverkande barbiturat (>100 mg/kg, beredd i steg 1.1) med en 26G nål för att terminalt bedöva musen. Kontrollera musens fotreflex genom att klämma fast bakpoten med pincett.
    2. När det inte finns någon fotreflex, placera det terminalt bedövade djuret i dorsal decubitus-position och fixera musen genom att fästa lemmarna på en tallrik.
      OBS: Om transkardiell perfusion av mössen inte behövs, beroende på nedströmsanalysmetoden (t.ex. för SEM-avbildning), fortsätt till steg 2.1.7. Men om perfusion behövs för att avlägsna blodkroppar eller andra komponenter i blodet kan CP visualiseras som en blå struktur som flyter i hjärnkamrarna via perfusion med bromfenolblått.
    3. Desinficera bröstet genom att spruta 70% etanol. Placera ett sterilt draperi runt operationsområdet. Gör ett snitt på ~ 4 cm strax under membranet med ett kirurgiskt blad av kolstål (se materialtabell).
    4. Öppna huden och exponera bröstet med kirurgisk sax. Skär membranet helt öppet.
    5. Separera bröstkorgen för att exponera lungorna och det slående hjärtat.
    6. Transkardiellt perfuserar mössen med 10 ml av perfusionslösningen med en hastighet av 4,5 ml/min med hjälp av en perfusionspump (se Materialförteckning). Perfusionen tar ~ 2 min. Sätt in en 26G nål i vänster kammare för att pumpa lösningen in i systemkretsen. Dessutom gör du ett snitt med kirurgisk sax i det högra atriumet så att blod kan gå ut ur cirkulationen.
      OBS: En perfusionspump är att föredra framför manuell administrering av vätskan, eftersom den kommer att leverera vätskorna med en exakt programmerad hastighet och säkerställa att skjuvkrafterna som orsakas av perfusionen inte är för starka. Överdriven skjuvkraft kommer att äventyra livskraften och strukturen hos celler inom CP. Dessutom är perfusionsflödeshastigheten som rekommenderas här optimal för att perfusera vuxna möss från 7 veckor och framåt. Om yngre möss används bör en lägre flödeshastighet användas. Det är också viktigt att badda bort blodet som kommer ut ur det högra förmaket för att bevara en ren operationsplats.
    7. Halshugga musen.
      OBS: Var försiktig med att skära av huvudet så lågt som möjligt till axeln för att bevara hjärnstrukturen. Om snittet är för högt kan cerebellum skadas.
    8. Efter halshuggning, skär upp hårbotten genom att göra ett snitt mellan öronen till överlägsen ögonen. Dra huden i sidled för att exponera skallen. Skär sedan upp skallen genom att följa squamosal suturerna, mot näsdelen.
      OBS: Det är viktigt att försiktigt ta bort skallen för att bibehålla hjärnans integritet.
    9. Placera hjärnan i en iskall petriskål och tillsätt 1 ml iskall 1x PBS på hjärnvävnaden.
      OBS: Beläggning av skålen behövs inte.
  2. Isolera CP flytande i den fjärde ventrikeln.
    1. Skär försiktigt av cerebellum från storhjärnan med en skalpell. Storhjärnan är den största delen av hjärnan, medan lillhjärnan är en mycket mindre del på baksidan av hjärnan. Om nödvändigt, ta bort återstående hjärnstamvävnadsdelar från cerebellum.
    2. Rotera hjärnan så att skärlinjen är vänd uppåt. Se till att den fjärde ventrikelhålan nu är synlig i mitten av sektionen, med CP flytande vid dorsalplatsen. Om det behövs, öppna ventrikeln lite genom att dra upp bindväven med skarpa pincett. På detta sätt blir CP mer synlig och lättare att nå.
    3. Riv försiktigt CP ur ventrikelväggen med små vassa pincett.
      OBS: Det är viktigt att endast vidröra och ta ut CP i detta steg för att inte förorena provet med den omgivande vävnaden. Öppning av kamrarna enligt beskrivningen i steg 2.2.2 underlättar steg 2.2.3.
  3. Isolera CP som sticker ut ur sidoventrikeln.
    1. Använd små skarpa pincett för att sagittalt skära hjärnan i två halvklot.
    2. Rotera hjärnan så att skärlinjen är vänd uppåt. För att avslöja laterala ventrikeln, dra försiktigt bort cortex från thalamus.
    3. Dra tillbaka hippocampus till midsagittal skärlinje. Den laterala ventrikeln är nu synlig med CP liggande längst ner i ventrikeln. Om det behövs, öppna ventrikeln lite genom att dra upp bindväven med skarpa pincett. På detta sätt blir CP mer synlig och lättare att nå.
    4. Använd små vassa pincett för att försiktigt riva CP ur ventrikelväggen.
      OBS: Det är viktigt att endast röra och ta ut CP i detta steg för att inte förorena provet med den omgivande vävnaden. Öppnandet av kamrarna enligt beskrivningen i steg 2.3.4 underlättar steg 2.3.5. Var försiktig i detta steg för att bevara CP: s struktur så mycket som möjligt. Det är lättast att börja dra CP i rostral till caudal riktning.

3. Morfologisk analys av CP-vävnad med svepelektronmikroskopi (SEM)

VARNING: Giftiga lösningar används i följande bearbetningssteg. Det rekommenderas att provberedningen utförs i en dragskåp.

  1. Utför provberedning för SEM enligt beskrivningen nedan.
    1. Överför den färska isolerade CP till nygjord fixeringslösning innehållande 2% paraformaldehyd och 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M Na-kakodylatbuffert (pH 7,4). Inkubera över natten vid 4 °C.
      OBS: Eftersom CP-vävnaden är mycket ömtålig och tunn bör vävnaden läggas i små provkorgar (se materialförteckning) för att överföra den mellan buffertar. På detta sätt kommer vävnadens struktur att bevaras bättre. Ett kakodylatbaserat fixativ används över ett PBS-baserat, eftersom den starka cacodylatbufferten kan motverka det låga pH-värdet för glutaraldehyd i EM-fixativet.
    2. Tvätta provet 3x i 5 minuter vardera med 3-5 ml 0,1 M Na-kakodylatbuffert (pH 7,4).
    3. Efterfixera proverna i 3-5 ml 2% osmiumtetroxid i 0,1 M Na-kakodylatbuffert i 30 minuter. Tvätta proverna 3x i 5 minuter vardera med 3-5 ml ultrarent vatten.
    4. Dehydrera proverna i en serie iskalla lösningar med ökande EtOH-koncentrationer (50%, 70%, 85%, 100%) i 15 minuter per EtOH-lösning. Använd en kritisk punkttork för att punkttorka provet ordentligt.
      OBS Byte från vätske- till gasfas påverkar ytspänningen och orsakar skador på ytstrukturen. Det kritiska punkttorkningssteget möjliggör bevarande av ytstrukturen.
    5. Placera provet försiktigt på ett provfäste försett med en koldekal (se Materialförteckning).
    6. Belägg proverna med ett tunt lager (2-5 nm) platina. För att göra det, montera en platinakälla i ett vakuumsystem mellan två elektriska terminaler med hög ström och värm platina till dess avdunstningstemperatur. En fin ström av platina deponeras på provet.
      Ett mer detaljerat protokoll för detta steg finns i referens30. Förutom platina kan guld eller guld / palladium också användas.
  2. Visualisera CP-proverna med SEM (se Materialförteckning). Visualiseringsproceduren för CP-vävnad via SEM liknar den för andra typer av vävnader och beror på vilken programvara och instrument som används. Ett steg för steg SEM-protokoll med tillhörande video finns i referens31 eller referens30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det beskrivna protokollet underlättar effektiv isolering av CP från mushjärnans laterala (figur 2A-C) och fjärde (figur 2D-F) ventriklar. Efter att ha isolerat hela hjärnan används pincett för att sagittalt hemisect hjärnan och identifiera CP: erna som flyter i laterala ventriklarna. CP från den fjärde ventrikeln kan isoleras från hjärnans lillhjärna. Perfusion med bromfenolblått kan användas för att visualisera CP (figur 2A,D); Om bromfenolblått inte är tillåtet i de vidare bearbetningsstegen kan perfusion med PBS/heparin (figur 2C,F) eller ingen perfusion (figur 2B,E) utföras. Efter att ha isolerat CP ur hjärnkamrarna kan en hel repertoar av analyser utföras på vävnaden. Dessa inkluderar genuttrycksprofilering (RT-qPCR)28, celltypsprofilering (flödescytometri32, encells-RNA-sekvensering 26,27) och detektion av cytokiner och kemokiner 28via enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA), immunoblot eller multiplexa immunanalyser. Dessutom kan den mikrodissekerade CP placeras i kultur för att få CP att explanteras för att ytterligare belysa funktionen och till exempel studera dess sekretom som svar på en specifik stimulans23,28,29. I detta manuskript beskriver vi hur man utför svepelektronmikroskopi (SEM) för att morfologiskt analysera ytan av choroid plexus epiteliala (CPE) celler. Figur 3 visar översiktsbilder av CP isolerad från den fjärde ventrikeln (figur 3A) och CP isolerad från sidoventrikeln (figur 3B), erhållen via SEM. Dessa bilder visar tydligt den typiska C-formade formen av lateral CP och tvåarmstrukturen hos den fjärde ventrikeln CP. 

Figure 3
Figur 3: Översikt svepelektronmikroskopi (SEM) bilder av dissekerad choroid plexus (CP) vävnad. (A,B) Representativ SEM-bild av CP isolerad från (A) fjärde och (B) laterala ventriklarna i mushjärnan. Skalstång = 100 μm. Inställningar: elektronhögspänning (EHT) = 5,00 kV; arbetsavstånd (WD) = 4,8 mm Klicka här för att se en större version av denna figur.

Genom att zooma in på CPE-cellerna kan andra celler på den apikala sidan av CPE-cellerna detekteras (figur 4A). Cellen som fångas i bilden är möjligen en epiplexuscell, en makrofagliknande cell som ligger på den apikala ytan av CP. Det är emellertid inte möjligt att identifiera den specifika karaktären hos denna cell via SEM. Förutom SEM-avbildning är det möjligt att utföra tvåfotonavbildning av choroid plexusepitelet i levande explantat, vilket visas av Shipley et al.29. Medan SEM underlättar visualiseringen av ytstrukturer i CP, kan tvåfotonavbildning möjliggöra visualisering av ett brett spektrum av celler och cellulära processer så länge de kan övervakas fluorescerande. Detta inkluderar visualisering av vaskulära celler och immunceller, liksom sekretoriska händelser i CP-explanten29.

En högre SEM-förstoring avslöjade vesikelliknande strukturer på den apikala sidan av CPE-celler (figur 4B) samt mikrovilli (figur 4C). Dessa mikrovilli sticker ut i cerebrospinalvätskan (CSF) och ökar CPE-cellytan mellan cellerna och CSF. Dessa resultat visar att CPE-cellernas morfologiska förändringar vid sjukdomstillstånd kan undersökas med SEM.

Figure 4
Figur 4: Detaljerade svepelektronmikroskopibilder (SEM) av choroid plexus (CP) vävnad. (A) En cell på den apikala sidan av plexusepitelceller (CPE). Skalstapel = 2 μm. (B) Vesikelliknande strukturer på den apikala sidan av CPE-celler. Skalstapel = 10 μm. (C) Visualisering av en CPE-cellyta med dess mikrovilli. Skalstapel = 1 μm. Inställningar: elektronhögspänning (EHT) = 5,00 kV; arbetsavstånd (WD) = 4,9 mm; 3 000x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskrivs en metod för att isolera plexus choroid plexus (CP) ur laterala ventrikeln och den fjärde ventrikeln i en mushjärna. Hela denna monteringsmetod för CP underlättar ytterligare analys med hjälp av en repertoar av tekniker för att få en fullständig bild av CP-morfologin, cellulär sammansättning, transkriptom, proteom och sekretom. Sådana analyser är avgörande för att få en bättre förståelse för denna anmärkningsvärda struktur som sticker ut från hjärnans ventriklar. Denna kunskap är av enormt forskningsintresse, eftersom det blir allt tydligare att CP spelar en avgörande roll för hälsa och sjukdom 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Kritiska steg, modifieringar och felsökning av metoden
Det är av yttersta vikt att kontrollera musens fotreflex för att säkerställa att terminalbedövningen utförs väl. Förutom etiska skäl säkerställer detta också att musen hålls kvar på rätt plats när experimentproceduren utförs. Målet är att bedöva djuret så att det inte upplever smärta under proceduren medan hjärtat slår vid perfusionstillfället. Om ytterligare bearbetning av vävnaden kräver avlägsnande av blod kan transkardiell perfusion utföras. Saltlösning innehållande heparin används här för att undvika blodkoagulering. EDTA kan också användas för detta ändamål, men om det är nödvändigt att bevara cellens livskraft är heparin ett bättre val än EDTA. Perfusion bör startas omedelbart när hjärtat slutar slå på grund av överdriven anestesi. En perfusionspump är att föredra framför manuell administrering av vätskan, eftersom detta möjliggör vätsketillförsel med en exakt programmerad hastighet och säkerställer att skjuvkrafterna som orsakas av perfusionen inte är för starka. Överdriven skjuvkraft kommer att äventyra livskraften och strukturen hos celler inom CP.

Det krävs ett tränat öga för att kunna se CP flyta i musens hjärnkammare. Av denna anledning är det av yttersta vikt att öva mycket. Det rekommenderas att starta träningen på möss perfuserade med bromfenolblått, eftersom detta kommer att fläcka CP i blått och göra det lättare att diskriminera den lilla CP-vävnaden från resten av hjärnan (figur 2A, D). I senare försök kan CP isoleras från en icke-perfuserad mus. Detta är svårare jämfört med CP-isolering från en bromfenolblåperfuserad mus, men CP-vävnaden kan fortfarande identifieras från dess mycket vaskulariserade natur (figur 2B, E). Först efter omfattande träning är det möjligt att isolera CP-vävnaden ur hjärnventriklarna från en icke-perfuserad mus utan kontaminering med hjärnparenkym (Figur 2C, F).

CP är en mycket ömtålig och tunn struktur, vilket innebär att dess isolering bör utföras med nödvändig försiktighet för att bevara livskraften, funktionen och strukturen hos celler i den. Således måste olika steg i det beskrivna protokollet utföras med nödvändig precision och försiktighet för att bevara hjärnans integritet. För det första är det viktigt att halshugga musen nära axlarna. Om snittet är för högt kan cerebellum skadas, vilket komplicerar isoleringen av CP i fjärde ventrikeln. Därefter måste skallen tas bort försiktigt för att inte skada hjärnan. När hjärnan är isolerad är det viktigt att hålla den kall för att förhindra att hjärnan blir grumlig, eftersom detta kommer att komplicera CP-isoleringen avsevärt. För att göra det är det viktigt att placera hjärnan på en iskall petriskål och lägga till iskall PBS över hjärnan. En viss träningsnivå är nödvändig för att utföra den beskrivna isoleringstekniken, eftersom detta avsevärt förkortar bearbetningstiden mellan halshuggningen av musen och den slutliga isoleringen av CP. En kort isoleringsprocess kommer att förbättra livskraften och strukturbevarandet av den isolerade vävnaden. Slutligen måste de verktyg som används för isolering, särskilt pincetten, vara skarpa och spetsiga för att underlätta snabb och effektiv isolering av CP ur ventriklarna. Man bör dock vara försiktig så att den inte skadar strukturens integritet under isolering.

För att bevara vävnadens integritet under provbearbetning för SEM kan CP läggas i små provkorgar vid överföring mellan buffertar, så att beröring av själva vävnaden kan undvikas. Dessutom rekommenderas att utföra kritisk punkttorkning när vävnaden flyttas ut ur EtOH-lösningarna. Detta säkerställer bevarandet av CP: s ytstruktur, inklusive mikrovilli. Ytspänning, orsakad av övergången från vätska till gasfas, kan skada sådana strukturer.

Begränsningar av metoden
Som tidigare nämnts är CP en liten struktur, och beroende på nedströmsanalyserna (t.ex. flödescytometri) kan det vara nödvändigt att slå samman CP från olika möss. Ett betydande hinder i CP-isolering är identifieringen av strukturen när den fortfarande flyter i ventrikeln. CP: s mycket vaskulariserade natur underlättar dess korrekta identifiering (efter viss träning) inuti hjärnans ventrikulära hålrum. Men om blodinnehållande komponenter måste avlägsnas för vidare analys är transkardiell perfusion avgörande. Beroende på nedströmsanalysen kan perfusion med bromfenolblått utföras, vilket kommer att fläcka CP-blått, vilket underlättar isoleringen av vävnaden. Tyvärr är denna visualiseringsteknik inte alltid möjlig (t.ex. för immunhistokemisk färgning). I sådana fall måste CP isoleras blint, vilket kräver adekvat utbildning. Att leka med mikroskopets lätta diffraktion kan hjälpa till att identifiera CP som flyter i ventriklerna. Dessutom beskriver detta manuskript isoleringen av CP som flyter i fjärde och laterala ventriklarna, medan isolering av den tredje ventrikeln CP inte diskuteras.

Betydelse i förhållande till befintliga metoder
I detta protokoll dissekeras CP först ut ur hjärnkamrarna innan ytterligare analys utförs. Om en färgningsprocedur används som uppföljningsavläsning är det också möjligt att färga hjärnsektioner som innehåller CP. Mervärdet av denna senare teknik är att orienteringen av CP-vävnaden i ventriklerna och hjärnan fortfarande är synlig, vilket inte är fallet om CP först mikrodissekeras ut ur hjärnkamrarna. Å andra sidan ger färgning av en hjärnsektion som innehåller CP endast information från den specifika sektionen, medan färgning av den isolerade CP kan hjälpa till att samla information om hela CP.

Fördelen med den beskrivna tekniken är att den bevarar livskraften, funktionen och strukturen hos cellerna inom CP. Dessutom underlättar denna metod fullständig isolering av CP som flyter i fjärde och laterala hjärnkammare hos vuxna möss. Metoder för isolering av CP (t.ex. från råtthjärnor24 och musunghjärnor25) har tidigare rapporterats. Det är dock viktigt att tänka på att isoleringstekniken kan skilja sig från art till art och mellan unga och vuxna åldrar.

Ytterligare tillämpningar av tekniken
Förutom att bevara livskraften, funktionen och strukturen hos celler inom CP, underlättar denna isoleringsteknik tillämpningen av nedströmstekniker för att få en djupare förståelse för CP-funktionen. Till exempel kan flödescytometri eller encells-RNA-sekvensering utföras för att kvantifiera och fenotypiskt analysera CP-celler och infiltrera celler under vissa sjukdomstillstånd26,27. Dessutom kan den molekylära sammansättningen av CP undersökas för att bedöma förekomsten av cytokiner och kemokiner via enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA), immunoblot eller samtidiga analyser av flera cytokiner med en så kallad cytokinpärlarray. Dessutom kan transkriptom-, kärl-, immuncellshistologi- och sekretomanalyser utföras på de mikrodissekerade CP-explanterna29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av den belgiska stiftelsen för Alzheimerforskning (SAO; projektnummer: 20200032), Research Foundation Flanders (FWO Vlaanderen; projektnummer: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) och Baillet Latour Fund. Vi tackar VIB BioImaging Core för utbildning, support och tillgång till instrumentparken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G x 1/2 needle Henke Sass Wolf 4710004512
Aluminium specimen mounts EM Sciences 75220
Cacodylate buffer EM Sciences 11652
Carbon steel surgial blades Swann-Morton 0210 size: 0.45 mm x 12 mm
Carbon adhesive tabs -12 mm EM Sciences 77825-12
Critical point dryer  Bal-Tec  CPD030
Crossbeam 540 Zeiss SEM system
Forceps Fine Science Tools GmbH  91197-00
Glutaraldehyde EM Sciences 16220
Heparin Sigma-Aldrich H-3125
Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel Metrohm Belgium N.V CPA-7800160
Osmium Tetroxide  EM Sciences 19170
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffered saline (PBS) Lonza BE17-516F
Platinum  Quorum  Q150T ES PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered
Sodium pentobarbital Kela NV 514
Specimen Basket Stainless Steel EM Sciences 70190-01
Stemi DV4 Stereo microscope Zeiss
Surgical scissors Fine Science Tools GmbH  91460-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), Springer-Verlag. 497-511 (2009).
  3. Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation. Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
  6. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).
  7. Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
  8. Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).
  9. Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders. Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).
  10. Brkic, M., et al. Amyloid βoligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases. Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).
  11. Vandenbroucke, R. E., et al. Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases. Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).
  12. Marques, F., et al. The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus. BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).
  13. Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
  14. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
  15. Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans. Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).
  16. Lehtinen, M. K., et al. The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy. Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).
  17. Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier. Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).
  18. Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders. Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).
  19. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).
  20. Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).
  21. Marques, F., et al. Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation. Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).
  22. Thouvenot, E., et al. The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells. Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).
  23. Vandendriessche, C., et al. Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).
  24. Bowyer, J. F., et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).
  25. Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).
  26. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
  27. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  28. Van Hoecke, L., et al. Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type. C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).
  29. Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
  30. Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).
  31. JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM). JoVE Science Education Database. , https://www.jove.com/v/5656/scanning-electron-microscopy-sem (2022).
  32. Pauwels, M., et al. Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics). Biomaterials. 290, 121830 (2022).

Tags

Neurovetenskap utgåva 190 plexus choroidus neurodegenerativa sjukdomar svepelektronmikroskopi (SEM) centrala nervsystemet hjärnan
Mikrodissektion och helmonterad svepelektronmikroskopi Visualisering av musplexus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Wonterghem, E., Van Hoecke, L.,… More

Van Wonterghem, E., Van Hoecke, L., Van Imschoot, G., Verhaege, D., Burgelman, M., Vandenbroucke, R. E. Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus. J. Vis. Exp. (190), e64733, doi:10.3791/64733 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter