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Developmental Biology

एक अंडाशय माउस मॉडल में गर्भावस्था स्थापना में गर्भाशय के योगदान का अध्ययन करने के तरीके

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64763
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1, *1, *1
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

गर्भावस्था की स्थापना एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें जटिल भ्रूण और गर्भाशय क्रॉसस्टॉक शामिल हैं। इन प्रक्रियाओं के लिए मातृ गर्भाशय पर्यावरण का सटीक योगदान जांच का एक सक्रिय क्षेत्र बना हुआ है। यहां, इन शोध प्रश्नों को संबोधित करने के लिए विवो पशु मॉडल में डिजाइन करने में सहायता के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं।

Abstract

गर्भावस्था की स्थापना के लिए, एक व्यवहार्य ब्लास्टोसिस्ट को प्रत्यारोपण और प्लेसेंटा गठन की सुविधा के लिए ग्रहणशील गर्भाशय अस्तर (एंडोमेट्रियम) के साथ सफलतापूर्वक बातचीत करनी चाहिए और चल रही गर्भावस्था को सक्षम करना चाहिए। भ्रूण दोषों के कारण गर्भावस्था की सफलता की सीमाएं अच्छी तरह से ज्ञात हैं और हाल के दशकों में इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) और सहायक प्रजनन प्रौद्योगिकियों के उदय के साथ काफी हद तक दूर हो गई हैं। अभी तक, हालांकि, क्षेत्र ने अपर्याप्त रूप से ग्रहणशील एंडोमेट्रियम के कारण होने वाली सीमाओं को दूर नहीं किया है, जिसके परिणामस्वरूप आईवीएफ सफलता दर स्थिर हो गई है। डिम्बग्रंथि और एंडोमेट्रियल कार्य निकटता से जुड़े हुए हैं, क्योंकि अंडाशय द्वारा उत्पादित हार्मोन एंडोमेट्रियम की मासिक धर्म चक्रीयता के लिए जिम्मेदार हैं। जैसे, गर्भावस्था के कृंतक मॉडल का उपयोग करते समय, यह पता लगाना मुश्किल हो सकता है कि क्या देखा गया परिणाम डिम्बग्रंथि या गर्भाशय की कमी के कारण है। इसे दूर करने के लिए, गर्भावस्था में गर्भाशय-विशिष्ट योगदान के अध्ययन की अनुमति देने के लिए भ्रूण हस्तांतरण या कृत्रिम निर्णय के साथ एक अंडाशय युक्त माउस मॉडल विकसित किया गया था। यह लेख अंडाशय करने के तरीके के बारे में निर्देश प्रदान करेगा और स्वस्थ दाताओं से भ्रूण हस्तांतरण के बाद सफल कृत्रिम निर्णय या गर्भावस्था का समर्थन करने के लिए बहिर्जात हार्मोन की आपूर्ति के लिए विभिन्न तकनीकों में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। इन तकनीकों में चमड़े के नीचे इंजेक्शन, धीमी गति से रिलीज छर्रों और आसमाटिक मिनी पंप शामिल हैं। प्रत्येक विधि के प्रमुख फायदे और नुकसान पर चर्चा की जाएगी, जिससे शोधकर्ताओं को अपने विशिष्ट शोध प्रश्न के लिए सबसे अच्छा अध्ययन डिजाइन चुनने में सक्षम बनाया जा सके।

Introduction

हाल के दशकों में सहायक प्रजनन प्रौद्योगिकियों के बढ़ते उपयोग के साथ, गर्भाधान के लिए कई बाधाओं को दूर किया गया है, जिससे कई जोड़ों कोप्रजनन समस्याओं के बावजूद परिवार शुरू करने की अनुमति मिलती है। अंडाणु या शुक्राणु की कमी को अक्सर इन विट्रो फर्टिलाइजेशन या इंट्रासाइटोप्लाज्मिक शुक्राणु इंजेक्शन का उपयोग करके बाईपास किया जा सकता है; हालांकि, गर्भाशय और एंडोमेट्रियल ग्रहणशीलता से संबंधित मुद्दे प्रजनन क्षमता2 का एक मायावी "ब्लैक बॉक्स" बने हुए हैं।

गर्भावस्था तब स्थापित होती है जब एक उच्च गुणवत्ता वाला भ्रूण सफलतापूर्वक एक ग्रहणशील एंडोमेट्रियम (गर्भाशय अस्तर) के साथ बातचीत करता है। किसी भी मासिक धर्म चक्र में सफल गर्भावस्था की संभावना कम होती है, लगभग 30% 3,4 पर। सफल होने वालों में से, केवल 50% -60% गर्भावस्था के 20 सप्ताह के बाद आगे बढ़ते हैं, आरोपण विफलता 75% गर्भधारण के लिए जिम्मेदार होती है जो 20 सप्ताह तक नहीं पहुंचतीहै। 1990 के दशक के उत्तरार्ध के इन आंकड़ों के बावजूद, क्षेत्र को अपर्याप्त रूप से ग्रहणशील एंडोमेट्रियम के कारण होने वाली सीमाओं को दूर करना बाकी है। इसके परिणामस्वरूप हाल के वर्षों में आईवीएफ की सफलता दर में ठहराव - और कभी-कभी गिरावट आई है - 5,6।

अस्पष्टीकृत बांझपन वाली महिलाओं में अक्सर ग्रहणशीलता की विस्थापित खिड़की होती है या अज्ञात कारणों से ग्रहणशीलता प्राप्त करने में असमर्थ होती हैं। हाल ही में, एंडोमेट्रियल ग्रहणशीलता सरणी विकसित की गई थी, जो भ्रूण हस्तांतरण के समय को एक व्यक्ति की ग्रहणशीलता 7,8,9 की खिड़की में अनुकूलित करने के उद्देश्य से सैकड़ों जीनों की अभिव्यक्ति का आकलन करती है। हालांकि, क्षेत्र में अभी भी गर्भावस्था की जटिलताओं के रोगजनन की समझ का अभाव है जो आरोपण प्रक्रिया पूरी होने के बाद प्रकट होता है।

महिला प्रजनन प्रणाली अत्यधिक गतिशील है और तंग हार्मोनल नियंत्रण में है। हाइपोथैलेमिक-पिट्यूटरी-गोनाडल (एचपीजी) अक्ष ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन और कूप-उत्तेजक हार्मोन की रिहाई को नियंत्रित करता है, जो डिम्बग्रंथि चक्र के पहलुओं को नियंत्रित करता है, जिसमें कूप परिपक्वता और एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन गतिविधि शामिल है। बदले में, गर्भाशय मासिक धर्म चक्र एस्ट्रोजेन और प्रोजेस्टेरोन10,11 द्वारा नियंत्रित होता है। इस प्रकार, गर्भाशय जैविक तंत्र का अध्ययन डिम्बग्रंथि के प्रभाव से जटिल है। उदाहरण के लिए, जब अध्ययन किया जाता है कि कैंसर उपचार गर्भाशय को कैसे प्रभावित कर सकते हैं, तो यह अंतर करना मुश्किल हो सकता है कि क्या देखा गया कोई भी गर्भाशय फेनोटाइप (जैसे गर्भावस्था का नुकसान या मासिक धर्म चक्रीयता) गर्भाशय के प्रत्यक्ष अपमान का परिणाम है या अंडाशय को नुकसान से परिणामी प्रभाव है।

प्रजनन क्षमता को व्यापक रूप से समझने के लिए, गर्भावस्था में गर्भाशय के योगदान की विशेषता होनी चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, इस समझ को डिम्बग्रंथि नियंत्रण के तहत गर्भाशय समारोह से परे विस्तारित करना चाहिए। यह मनुष्यों में अध्ययन नहीं किया जा सकता है; इसलिए, पशु मॉडल अक्सर नियोजित होते हैं। जैसे, ओवरीक्टॉमी (ओवीएक्स) का उपयोग आमतौर पर शोधकर्ताओं को बहिर्जात रूप से हार्मोन की आपूर्ति करके कृंतक एस्ट्रस चक्र (मासिक धर्म चक्र के अनुरूप) को विनियमित करने में सक्षम बनाने के लिए किया जाता है। इसके अतिरिक्त, ओवीएक्स गर्भाशय प्रतिक्रियाओं को डिम्बग्रंथि के प्रभाव12 से स्वतंत्र रूप से अध्ययन करने की अनुमति देता है। हालांकि, अगर हार्मोन को ओवीएक्स के तुरंत बाद आपूर्ति नहीं की जाती है, तो एक रजोनिवृत्ति फेनोटाइप होगा, जिसे शोधकर्ताओं द्वारा सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता है।

ओवीएक्स का उपयोग अक्सर कृंतक मॉडल 13,14,15,16,17 में किया जाता है और पर्याप्त प्रशिक्षण के बाद प्रदर्शन करना अपेक्षाकृत आसान होता है। विधियां इस बात पर निर्भर करती हैं कि क्या अकेले अंडाशय या अंडाशय और डिंबवाहिनी को हटा दिया जाता है, साथ ही साथ जानवर की उम्र के आधार पर (वयस्क, साइकिल चलाने वाले जानवरों में उनकी सतह पर एक दिखाई देने वाले कॉर्पस ल्यूटियम के साथ बड़े अंडाशय होते हैं, जिसका अर्थ है कि उनके अंडाशय की कल्पना करना आसान है)। इसी तरह, हार्मोन पूरकता के कई तरीके मौजूद हैं, जिनमें चमड़े के नीचे इंजेक्शन14, धीमी गति से रिलीज छर्रों 15, आसमाटिक मिनी पंप18 और डिम्बग्रंथि ग्राफ्टिंग शामिल हैं।

इस लेख में, अंडाशय करने और तीन प्रकार के हार्मोन पूरक तैयार करने के बारे में विस्तृत निर्देश प्रदान किए गए हैं, जिसमें चमड़े के नीचे के इंजेक्शन, धीमी गति से रिलीज छर्रों और आसमाटिक मिनी पंप शामिल हैं। प्रयोगात्मक समापन बिंदुओं के लिए दो विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं जो ओवीएक्स से लाभान्वित होते हैं, इसके बाद बहिर्जात हार्मोन पूरकता (भ्रूण स्थानांतरण और कृत्रिम निर्णय) होती है। यह लेख शोधकर्ताओं को मार्गदर्शन करने के लक्ष्य के साथ प्रत्येक दृष्टिकोण की ताकत और कमजोरियों पर चर्चा करता है कि गर्भाशय पर प्रभावों को अलग करने के लिए अध्ययन कैसे किया जाए, विशेष रूप से गर्भावस्था और अनुसंधान के प्रजनन क्षेत्रों में।

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Protocol

सभी जानवरों को तापमान-नियंत्रित, उच्च-बाधा सुविधाओं (मोनाश विश्वविद्यालय पशु अनुसंधान प्रयोगशाला) में मुफ्त भोजन और पानी की पहुंच और 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र के साथ रखा गया था। सभी प्रक्रियाओं को मोनाश पशु अनुसंधान मंच आचार समिति (# 21908, 17971) से अनुमोदन के अनुसार किया गया था और जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद कोड ऑफ प्रैक्टिस के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

1. सर्जिकल तैयारी

  1. 30 मिनट के होल्ड टाइम और 30 मिनट के सुखाने के समय के साथ 121 डिग्री सेल्सियस पर हार्ड / सूखे माल चक्र पर प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक सभी सर्जिकल उपकरणों, धुंध और पेपर तौलिए को ऑटोक्लेव करें।
  2. सर्जिकल कार्यक्षेत्र के लिए एक बाँझ बेंच पैड बिछाएं और एनाल्जेसिक तैयार करें।
    1. बाँझ लवण में कार्प्रोफेन को 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर तक पतला करें, और बाँझ लवण में बूपिवैकेन को 0.5% (डब्ल्यू / वी) घोल में पतला करें।
    2. 400 एमएल पिंजरे की पानी की बोतल में 3.5 एमएल मेलॉक्सिकैम जोड़ें।
  3. रिकवरी पिंजरों के लिए हीट पैड (ओं) को पूर्व-गर्म करें, और ठीक होने वाले जानवरों पर अप्रत्यक्ष प्रकाश चमकाने के लिए हीट लैंप स्थापित करें।
  4. सुनिश्चित करें कि सभी उपयुक्त पीपीई पहने गए हैं, जिसमें हेयर नेट, फेस मास्क, गाउन और दस्ताने शामिल हैं।
  5. अच्छी बाँझ तकनीक का अभ्यास करें, जिसमें नियमित रूप से इथेनॉल के साथ दस्ताने का छिड़काव करना और इथेनॉल संदूषण से बचने के लिए पशु या शल्य चिकित्सा उपकरणों को संभालने से पहले उन्हें वाष्पित करने की अनुमति देना शामिल है।

2. अंडाशय का प्रदर्शन

  1. आइसोफ्लुरेन के साथ गैस एनेस्थीसिया मशीन का उपयोग करके, 4 एल / मिनट पर निर्धारित प्रवाह दर के साथ 5% आइसोफ्लुरेन पर 3-5 मिनट के लिए प्रेरण बॉक्स को प्रीफिल करें।
  2. माउस को प्रेरण बॉक्स के अंदर रखें और, एक बार बेहोश होने के बाद, इसे नाक शंकु में ले जाएं और प्रवाह दर को 0.4 एल / मिनट तक कम करें, जिसमें आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र ~ 2.5% पर सेट हो।
    नोट: प्रक्रिया के शेष भाग के लिए उपयोग किए जाने वाले आइसोफ्लुरेन का प्रतिशत माउस तनाव, आयु और उपचार (जैसे, कीमोथेरेपी) के संपर्क के आधार पर भिन्न होता है और प्रत्येक व्यक्तिगत जानवर के श्वास पैटर्न के करीबी मूल्यांकन के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए। श्वास पैटर्न नियमित पेट की सांस के रूप में रहना चाहिए। तेजी से, वक्ष सांस संकेत दे सकती है कि एक गहरी सर्जिकल विमान तक नहीं पहुंचा गया है या बनाए रखा गया है; इस मामले में, आवश्यकतानुसार आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र प्रतिशत को समायोजित करें।
  3. ट्यूब को निचोड़कर और आंख को धीरे से दबाकर आंखों के स्नेहक को उदारता से लागू करें।
  4. रीढ़ की हड्डी के कूबड़ के ऊपर और नीचे एक छोटा (2 सेमी x 2 सेमी) क्षेत्र शेव करें।
  5. गर्दन के निचले हिस्से में 1 मिलीग्राम/एमएल के पतला घोल से 5 मिलीग्राम/किलोग्राम कार्प्रोफेन का सेवन करें।
  6. माउस के पिछले पैर की अंगुली को चुटकी मारकर पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स के साथ संज्ञाहरण की गहराई का परीक्षण करें। यदि कोई पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया नहीं है, तो जानवर गहरे सर्जिकल प्लेन में है, और प्रक्रिया जारी रह सकती है।
  7. सर्जिकल क्षेत्र में बीटाडीन लागू करें, और सर्जिकल ड्रेप (2 सेमी x 2 सेमी विंडो के साथ एक धुंध) के साथ कवर करें।
  8. चूहे-टूथेड बल का उपयोग करके, पीठ के कूबड़ पर त्वचा को ऊपर की ओर खींचें, और ~ 5 मिमी अनुदैर्ध्य चीरा लगाएं।
    नोट: जानवर की पीठ पर इस ऊंचाई पर एक त्वचा चीरा सर्जिकल क्लिप प्लेसमेंट के लिए सबसे अच्छा है ताकि जानवर द्वारा क्लिप को हटाने और क्लिप मरम्मत की आवश्यकता की संभावना को कम किया जा सके।
  9. कुंद बल का उपयोग करके, अंतर्निहित मांसपेशी परत से दूर त्वचा को कुंद करने के लिए आगे बढ़ें, नीचे और गुर्दे की ओर एक तरफ जाएं।
  10. मांसपेशियों की दीवार के माध्यम से नेत्रहीन गुर्दे, अंडाशय और डिम्बग्रंथि वसा पैड की पहचान करें।
    नोट: गुर्दे एक गहरा लाल रंग दिखाई देगा, वसा पैड चमकदार सफेद दिखाई देगा, और यदि दिखाई देता है, तो अंडाशय वसा पैड के भीतर एक छोटे गुलाबी बिंदु की तरह दिखेगा।
  11. बल का उपयोग करके, मांसपेशियों की परत को पकड़ें और उठाएं। तेज सर्जिकल कैंची के साथ ~ 0.5-1 सेमी चीरा लगाएं। मांसपेशियों की दीवार को बल के साथ पकड़ना जारी रखें, और चीरे के माध्यम से डिम्बग्रंथि वसा पैड को खींचने के लिए कैंची से कुंद बल में बदलें।
  12. एक घुमावदार सुई धारक का उपयोग करके, गर्भाशय के सींग के बाहर के छोर पर अंडाशय और डिंबवाहिनी के नीचे क्लैंप करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, अंडाशय को अकेले हटाया जा सकता है, जिससे डिंबवाहिनी बरकरार रहती है। हालांकि, अंडाशय और डिंबवाहिनी के बीच अंतर को सटीक रूप से देखने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है।
  13. कैंची या स्केलपेल के साथ अंडाशय को हटा दें। अत्यधिक रक्तस्राव से बचने के लिए 30 सेकंड के लिए क्लैंप करना जारी रखें।
  14. क्लैंप को हटा दें, और यदि आवश्यक हो तो इसे बाँझ धुंध के साथ दबाएं।
  15. मांसपेशियों की दीवार चीरा को बंद करने के लिए, चीरे के शीर्ष को उठाने के लिए बल का उपयोग करें ताकि चीरा स्वाभाविक रूप से एक साथ खींचे।
  16. एक सर्जन की गाँठ के साथ मांसपेशियों की दीवार चीरा को बंद करने के लिए रेशम सीवन (आकार 3-0) का उपयोग करें।
  17. सुई के बिना 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके बुपिवैकेन की दो से तीन बूंदों को शीर्ष पर लागू करें, और दूसरी तरफ चरण 2.9-2.17 दोहराएं।
  18. त्वचा के चीरे को बंद करने के लिए, अतिरिक्त बूपिवैकेन के सूखने वाले क्षेत्र को दबाने के लिए धुंध का उपयोग करें, और त्वचा के दोनों किनारों को एक साथ दबाएं।
  19. एक से दो 7 मिमी सर्जिकल क्लिप लागू करें, जिससे उपचार प्रक्रिया के हिस्से के रूप में सूजन के लिए जगह मिल सके।
  20. माउस को एक पुनर्प्राप्ति पिंजरे में ले जाएं, और 15 मिनट के लिए बारीकी से निगरानी करें।
    नोट: जानवरों को जल्दी जागना चाहिए; सामान्य वक्ष श्वास पैटर्न के लिए सांस लेने की बारीकी से निगरानी करना सुनिश्चित करें।

3. हार्मोन की तैयारी: चमड़े के नीचे इंजेक्शन

  1. एस्ट्राडियोल का 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान बनाएं।
    1. एस्ट्राडियोल पाउडर के 0.001 ग्राम (1 मिलीग्राम) को 1.5 एमएल बाँझ ट्यूब में वजन करें।
    2. ट्यूब में 100% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें, और कुछ सेकंड के लिए भंवर।
      नोट: इथेनॉल एस्ट्राडियोल पाउडर के दृश्यमान फ्लेक्स के साथ स्पष्ट रहेगा।
    3. किसी भी इथेनॉल वाष्पीकरण को रोकने के लिए ट्यूब को फिल्म के साथ लपेटें।
    4. ट्यूब को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें, और एस्ट्राडियोल पाउडर को पूरी तरह से भंग करने के लिए इसे रात भर एक रॉकर पर रखें।
    5. तिल के तेल में इस 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक को वांछित अंतिम एकाग्रता तक पतला करें।
      नोट: कृत्रिम निर्णय लेने से पहले प्राइमिंग के लिए 3 दिनों के लिए 100 एनजी की खुराक की आवश्यकता होती है, और प्रोजेस्टेरोन दिए जाने पर 25 एनजी की अतिरिक्त कम खुराक की आवश्यकता होती है। यह प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले फीडबैक लूप का मुकाबला करना है। भ्रूण स्थानांतरण के लिए, दिन 4 पर भ्रूण स्थानांतरण से पहले दिन 1 और दिन 3 पर 100 एनजी की दो खुराक की आवश्यकता होती है। भ्रूण स्थानांतरण के समय, 25 एनजी की कम खुराक की भी आवश्यकता होती है।
    6. तेल में एस्ट्राडियोल की आवश्यक मात्रा को 1 एमएल सिरिंज में खींचें, और फिर 26 ग्राम सुई टिप संलग्न करें।
    7. उपयुक्त खुराक को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें (या तो स्क्रुफ या फ्लैंक पर; 100 एनजी / 100 μL या 25 ng / 100 μL भ्रूण हस्तांतरण या कृत्रिम निर्णय लेने से पहले या भ्रूण हस्तांतरण के समय) आवश्यक आवृत्ति पर।
      नोट: तेल बहुत चिपचिपा है, इसलिए सुई को हटाने से पहले धीरे-धीरे इंजेक्शन लगाना और कुछ सेकंड के लिए रोकना सुनिश्चित करें। यह इंजेक्शन साइट से बाहर निकलने वाले तेल की मात्रा को कम करेगा।
  2. प्रोजेस्टेरोन का 200 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान बनाएं।
    1. प्रोजेस्टेरोन पाउडर के 0.4 ग्राम (400 मिलीग्राम) को 5 एमएल बाँझ ट्यूब में वजन करें।
    2. ट्यूब में 100% इथेनॉल के 2 एमएल जोड़ें, और कुछ सेकंड के लिए भंवर।
      नोट: इथेनॉल सफेद रंग का हो जाएगा।
    3. चरण 3.1.3-3.1.4 दोहराएँ।
    4. तिल के तेल में 200 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक को वांछित अंतिम एकाग्रता तक पतला करें।
      नोट: भ्रूण हस्तांतरण का समर्थन करने के लिए दैनिक 2 मिलीग्राम की खुराक की आवश्यकता होती है।
    5. चरण 3.1.6-3.1.7 के रूप में चमड़े के नीचे उपयुक्त खुराक (जैसे, गर्भावस्था का समर्थन करने के लिए 2 मिलीग्राम / 100 μL दैनिक) इंजेक्ट करें।

4. हार्मोन की तैयारी: धीमी गति से रिलीज छर्रों

  1. एक लामिनर प्रवाह या द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा हुड की सतह पर एक पन्नी बिछाएं।
  2. सभी उपकरणों (दस्ताने, पेट्री व्यंजन, 1 एमएल सिरिंज, ठीक बल) को हुड में रखें, और 20 मिनट के लिए यूवी पर स्विच करें।
    नोट: हुड के अंदर सीलेंट के साथ यूवी को चालू न करें क्योंकि यह सेट हो जाएगा।
  3. 100% इथेनॉल में सिलास्टिक टयूबिंग को धो लें, और इसे हुड में हवा से सूखने दें। एक बार सूखने के बाद, टयूबिंग के साथ ~ 1 सेमी लंबाई चिह्नित करें, और स्केलपेल के साथ काटें।
  4. एक सिरिंज से प्लंजर निकालें, और ~ 200 μL सीलेंट में निचोड़ें। प्लंजर को बदलें, और सिरिंज से थोड़ी मात्रा में सीलेंट को दबाएं।
  5. ट्यूबिंग के एक छोर पर थोड़ी मात्रा में सीलेंट लागू करें, और इसे एक घिसी हुई उंगली से चिकना करें।
  6. हुड के अंदर यूवी प्रकाश में रात भर या 20-30 मिनट के लिए सूखने दें।
  7. एक निष्फल पेट्री डिश में प्रोजेस्टेरोन की उचित मात्रा डालें। पेलेट को भरने के लिए प्रोजेस्टेरोन पाउडर में फोर्सप्स का उपयोग करके, स्कूप छर्रों को डालें।
    1. प्रोजेस्टेरोन को नीचे संघनित करने के लिए हुड की सतह पर गोली के सील किए गए छोर को टैप करें। वैकल्पिक रूप से, प्रोजेस्टेरोन को नीचे भरने के लिए निष्फल बल के अंत का उपयोग करें। अधिक सीलेंट के लिए पर्याप्त जगह दें।
  8. चरण 3.4-3.5 में वर्णित के रूप में सीलेंट के साथ खुले छोर को सील करें।
  9. प्रोजेस्टेरोन छर्रों वाले पेट्री डिश को प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी में लपेटें।
  10. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1% चारकोल-स्ट्रिप्ड एफसीएस (सीएस-एफसीएस: पीबीएस) में इंजेक्ट करके चमड़े के नीचे सम्मिलन से पहले कम से कम 72 घंटे के लिए छर्रों को सक्रिय करें।
    नोट: छर्रों को पहले से एक सील छोर के साथ थोक में बनाया जा सकता है। हालांकि, हर बार उन्हें भरने के लिए ताजा प्रोजेस्टेरोन का उपयोग किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि प्रोजेस्टेरोन से भरने से पहले पूर्व-निर्मित छर्रों को यूवी-स्टरलाइज़ किया गया है। छर्रों से 6-10 दिनों के लिए ~ 500 μg / दिन का स्राव होगा, जो कृत्रिम निर्णय और भ्रूण हस्तांतरण प्रक्रियाओं के लिए पर्याप्त समर्थन है, हालांकि 4-5 दिनों से परे प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर गतिविधि को बनाए रखने के लिए एक अतिरिक्त कम खुराक एस्ट्रोजन इंजेक्शन की आवश्यकता हो सकती है। 10 दिनों से परे, एक प्रतिस्थापन प्रोजेस्टेरोन गोली की आवश्यकता हो सकती है।

5. हार्मोन तैयारी: आसमाटिक मिनी पंप

  1. एक जलीय घोल में वांछित एकाग्रता पर प्रोजेस्टेरोन तैयार करें, और उपयुक्त मिनी आसमाटिक पंप मॉडल का चयन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: धारा 7 (प्रयोगात्मक प्रक्रिया: भ्रूण स्थानांतरण) के लिए, 12 दिनों के लिए 2 मिलीग्राम / दिन की डिलीवरी आवश्यक है। इसलिए, प्रति जानवर बाँझ पानी के ~ 100 μL में 28 मिलीग्राम प्रोजेस्टेरोन घोलें (विशिष्ट मात्रा के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें)। सीरियल कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है। धारा 8 (प्रयोगात्मक प्रक्रिया: कृत्रिम निर्णायककरण) के लिए, 3 दिनों के लिए प्रति दिन 500 μg की डिलीवरी की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रति जानवर बाँझ पानी के ~ 100 μL में प्रोजेस्टेरोन के 1,500 μg को घोलें। भरने की प्रक्रिया के दौरान खोए गए वॉल्यूम के लिए अतिरिक्त समाधान तैयार करें।
  2. उपकरण (दस्ताने, कम-लिंट वाइप्स, पेट्री व्यंजन, बाँझ खारा, 1 एमएल सिरिंज, छोटे वजन वाली नौकाएं, पन्नी, और तराजू, 0.01 ग्राम तक सटीक) को द्वितीय श्रेणी के जैव सुरक्षा हुड के भीतर सेट करें, और फिर 20 मिनट के लिए यूवी पर स्विच करें।
  3. हार्मोन समाधान को 1 एमएल सिरिंज में खींचें, और फिर एक बाँझ भरने वाली ट्यूब संलग्न करें, ध्यान से सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
  4. एक बाँझ वजन नाव के भीतर पंप और उसके प्रवाह मॉडरेटर का वजन करें।
  5. पंप के शीर्ष पर उद्घाटन के माध्यम से भरने वाली ट्यूब डालें जब तक कि यह आगे नहीं जा सके।
  6. पंप को सीधा पकड़कर, ट्यूब को भरने के लिए धीरे-धीरे सिरिंज के प्लंजर को धक्का दें।
    नोट: तेजी से भरने से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह पंप में हवा के बुलबुले पेश कर सकता है।
  7. जब पंप के शीर्ष से घोल ओवरफ्लो हो जाता है, तो धीरे से भरने वाली ट्यूब को हटा दें, और बाँझ कम-लिंट वाइप के साथ अतिरिक्त घोल को मिटा दें।
  8. पंप के शीर्ष पर उद्घाटन के माध्यम से फ्लो मॉडरेटर डालें जब तक कि यह आगे नहीं जा सके। एक बार पूरी तरह से अंदर आने के बाद, पंप और फ्लो मॉडरेटर को एक साथ दृढ़ता से दबाएं।
  9. भरे हुए पंप को प्रवाह मॉडरेटर के साथ तौलें।
    नोट: चरण 5.3 और चरण 5.8 से प्राप्त वजन में अंतर लोड किए गए समाधान का शुद्ध वजन देगा (यानी, 0.1 ग्राम की वृद्धि = 100 μL घोल जोड़ा गया)।
  10. भरे हुए पंप को बाँझ खारा से भरे बाँझ पेट्री डिश में रखें।
  11. एक बार सभी पंप भर जाने के बाद, पेट्री डिश को पन्नी में लपेटें, और इसे कम से कम 4-6 घंटे (या उपयोग के लिए तैयार होने तक) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर रखें।

6. सर्जिकल प्रक्रिया: चमड़े के नीचे हार्मोन छर्रों और मिनी पंप का सम्मिलन

  1. अनुभाग 1 (सर्जिकल तैयारी) के अनुसार क्षेत्र तैयार करें।
  2. चरण 2.1-2.3 के अनुसार जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
  3. गर्दन के निचले हिस्से में एक छोटा सा क्षेत्र शेव करें (~ 1 सेमी x 1 सेमी)।
  4. पैर के फ्लैंक में चमड़े के नीचे 1 मिलीग्राम / एमएल के पतला घोल से 5 मिलीग्राम / किग्रा कार्प्रोफेन का उपयोग करें।
  5. पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स के लिए परीक्षण करें। यदि कोई रिफ्लेक्स नहीं है, तो जानवर गहरे सर्जिकल प्लेन में है, और प्रक्रिया शुरू हो सकती है।
  6. सर्जिकल क्षेत्र में बीटाडीन लागू करें, और इसे सर्जिकल ड्रेप (2 सेमी x 2 सेमी विंडो के साथ एक धुंध) के साथ कवर करें।
  7. चूहे के दांत वाले बल का उपयोग करके, त्वचा को गर्दन के निचले हिस्से में खींचें (पीठ के आधे हिस्से और पीठ के कूबड़ के बीच) और ~ 5 मिमी अनुदैर्ध्य चीरा लगाएं।
  8. कुंद बल का उपयोग करके, त्वचा को नीचे की दिशा में अंतर्निहित मांसपेशी परत से दूर विच्छेदित करें।
    नोट: आसमाटिक मिनी पंप सम्मिलन के लिए, जानवर के एक तरफ एक जेब बनाएं ताकि पंप जानवर के आंदोलन को प्रतिबंधित न करे या चीरा स्थल के खिलाफ दबाए न रखे।
  9. एक बार हार्मोन गोली या मिनी पंप के लिए पर्याप्त जगह बन जाने के बाद, गोली या मिनी पंप को लेने के लिए बाँझ बल का उपयोग करें, और इसे कुंद विच्छेदन के साथ बने चमड़े के नीचे की जेब में डालें।
  10. त्वचा के चीरे को बंद करने के लिए, सुनिश्चित करें कि गोली या मिनी पंप जेब में पर्याप्त है कि सर्जिकल क्लिप इसे नुकसान नहीं पहुंचाएंगे।
  11. चरण 2.17 के अनुसार शीर्ष रूप से बूपिवैकेन लागू करें।
  12. एक सर्जिकल क्लिप के साथ घाव को बंद करें। माउस को एक पुनर्प्राप्ति पिंजरे में ले जाएं, और 15 मिनट के लिए बारीकी से निगरानी करें। चूंकि यह एक छोटी प्रक्रिया है, जानवरों को मिनटों के भीतर एम्बुलेटरी होना चाहिए।

7. प्रायोगिक प्रक्रिया: भ्रूण स्थानांतरण

  1. अंडाशय वाले जानवरों के लिए, 100 एनजी / 100 μL एस्ट्राडियोल (चरण 3.1) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा भ्रूण हस्तांतरण से 3 दिन पहले हार्मोन-प्राइम।
  2. भ्रूण स्थानांतरण से एक दिन पहले, हार्मोन-प्राइम जानवरों को 2 मिलीग्राम / 100 μL मेड्रोक्सीप्रोजेस्टेरोन एसीटेट (चरण 3.2) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ प्राइम करें।
  3. अनुभाग 1 (सर्जिकल तैयारी) के अनुसार क्षेत्र तैयार करें।
  4. चरण 2.1-2.3 के अनुसार जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
  5. चरण 2.4-2.10 के अनुसार प्रक्रिया शुरू करें।
  6. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, 26 ग्राम सुई टिप के साथ एक अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन बिंदु बनाएं।
  7. पिपेट पांच ब्लास्टोसिस्ट को एम 2 मीडिया ड्रॉप में डालते हैं, और फिर इन्हें गर्भाशय के सींग में स्थानांतरित करते हैं।
  8. मांसपेशियों की दीवार चीरा को बंद करने के लिए, चीरे के शीर्ष को बल का उपयोग करके उठाएं ताकि चीरा स्वाभाविक रूप से एक साथ खींच सके।
  9. रेशम सीवन का उपयोग करके, एक सर्जन की गाँठ के साथ मांसपेशियों की दीवार साइट को बंद करें। शीर्ष पर बुपिवैकेन की बूंदें लागू करें।
  10. दूसरी तरफ चरण 7.5-7.8 दोहराएं।
  11. त्वचा के चीरे को बंद करने के लिए, अतिरिक्त बूपिवैकेन के सूखने वाले क्षेत्र को दबाने के लिए धुंध का उपयोग करें, और त्वचा के दोनों किनारों को एक साथ दबाएं।
  12. एक से दो सर्जिकल क्लिप लागू करें, जिससे उपचार प्रक्रिया के हिस्से के रूप में सूजन के लिए जगह मिल सके।
    नोट: यदि जानवरों को अंडाशय ति किया जाता है, तो भ्रूण हस्तांतरण के समय बहिर्जात हार्मोन की आवश्यकता होती है। या तो चमड़े के नीचे प्रोजेस्टेरोन (2 मिलीग्राम) इंजेक्ट करें या चमड़े के नीचे प्रोजेस्टेरोन गोली या आसमाटिक मिनी पंप डालें। अतिरिक्त प्रोजेस्टेरोन का मुकाबला करने के लिए, भ्रूण स्थानांतरण के समय कम खुराक (25 एनजी / 100 μL) एस्ट्रोजन के चमड़े के नीचे इंजेक्शन की आवश्यकता होती है।
  13. माउस को सावधानी से एक रिकवरी पिंजरे में ले जाएं, और 15 मिनट के लिए बारीकी से निगरानी करें।
    नोट: जानवरों को जल्दी जागना चाहिए; सामान्य वक्ष श्वास पैटर्न के लिए सांस लेने की बारीकी से निगरानी करना सुनिश्चित करें।

8. प्रायोगिक प्रक्रिया: कृत्रिम निर्णय

  1. कृत्रिम निर्णय लेने से 8 दिन पहले धारा 3 (हार्मोन तैयारी: चमड़े के नीचे इंजेक्शन) के अनुसार, दिन 1, 2 और दिन 3 पर 100 एनजी / 100 μL एस्ट्राडियोल के साथ जानवरों को हार्मोन-प्राइम करें।
  2. कृत्रिम निर्णय लेने से 2 दिन पहले धारा 3 (हार्मोन तैयारी: चमड़े के नीचे इंजेक्शन) के अनुसार, दिन 7, दिन 8 और दिन 9 पर 5 एनजी / 100 μL एस्ट्राडियोल के साथ जानवरों को हार्मोन-प्राइम।
    नोट: अंतिम इंजेक्शन कृत्रिम निर्णय प्रक्रिया से पहले न्यूनतम 3 घंटे (और अधिकतम 4 घंटे) होना चाहिए।
  3. कृत्रिम निर्णय लेने से 2 दिन पहले धारा 4, धारा 5 और धारा 8 के अनुसार, चमड़े के नीचे प्रोजेस्टेरोन गोली या मिनी आसमाटिक पंप (500 μg / दिन) के साथ हार्मोन-प्राइम जानवर।
  4. अनुभाग 1 (सर्जिकल तैयारी) के अनुसार क्षेत्र तैयार करें।
  5. चरण 2.1-2.2 के अनुसार जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
  6. पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स के साथ संज्ञाहरण की गहराई का परीक्षण करें। यदि कोई पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया नहीं है, तो जानवर गहरे सर्जिकल प्लेन में है, और प्रक्रिया जारी रह सकती है।
  7. माउस को एक प्रवण स्थिति में रखें, पूंछ उठाएं, और धीरे-धीरे योनि में 6 मिमी व्यास का स्पेकुलम डालें।
  8. एनेस्थेटिक नाक शंकु में जानवर की नाक रखते समय, जानवर के निचले शरीर को गैर-प्रमुख हाथ की पहली और दूसरी उंगलियों के बीच रखें। योनि को देखने के लिए पूंछ को धीरे से ऊपर की ओर धकेलने के लिए अंगूठे का उपयोग करें।
  9. एक गैर-सर्जिकल भ्रूण स्थानांतरण टिप (20 μL पिपेट से जुड़े) का उपयोग करके एक गर्भाशय के सींग में तिल के तेल के 20 μL स्थानांतरित करें।
    1. योनि के उद्घाटन के साथ पिपेट स्तर को रखते हुए, योनि में और गर्भाशय ग्रीवा के माध्यम से गर्भाशय के सींग में नोक डालें। एक बार जब टिप गर्भाशय के सींग में होती है, तो धीरे से एंडोमेट्रियल सतह के खिलाफ नोक दबाएं (यदि ऊपर हैंडलिंग तकनीक का उपयोग करके, यह आंदोलन दूसरी उंगली के खिलाफ महसूस किया जाएगा), और धीरे-धीरे तेल को निष्कासित करें।
      नोट: पिपेट प्लंजर को उदास रखें, यह सुनिश्चित करने के लिए 10 सेकंड तक प्रतीक्षा करें कि सभी तेल फैल गए हैं, और प्लंजर को उदास रखते हुए धीरे-धीरे स्थानांतरण टिप को हटा दें।
  10. योनि से स्पेकुलम को हटा दें।
  11. सावधानी से माउस को रिकवरी पिंजरे में ले जाएं, और 15 मिनट के लिए बारीकी से निगरानी करें।
    नोट: जानवरों को जल्दी जागना चाहिए। सामान्य वक्ष श्वास पैटर्न के लिए उनकी सांस लेने की बारीकी से निगरानी करें।
  12. जानवरों की हैंडलिंग को सीमित करें, और प्रक्रिया के बाद उन्हें 96 घंटे के लिए शांत वातावरण में रखें।
    नोट: जोर से शोर या उनके प्रकाश और अंधेरे चक्र में अचानक परिवर्तन प्रक्रिया की सफलता को प्रभावित करेगा। ऊतक विच्छेदन के समय, निर्णय लेने की सफलता की सीमा को शरीर के वजन के लिए गर्भाशय के वजन के अनुपात के रूप में मापा जा सकता है। कृत्रिम निर्णय प्रक्रिया में 80% सफलता दर है। इसलिए, उन जानवरों को बाहर रखें जो निर्णय लेने में विफल रहते हैं, और प्रयोगों के लिए नमूना आकार का चयन करते समय इसे ध्यान में रखते हैं।

9. सर्जिकल प्रक्रिया: पोस्ट-सर्जिकल रिकवरी, निगरानी और क्लिप मरम्मत

  1. जानवरों को अपने घर के पिंजरे में वापस करने से पहले रात भर आधे-आधे, आधे हीट पैड को पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दें।
  2. सर्जरी के बाद 5 दिनों के लिए रोजाना जानवरों की निगरानी करें, संक्रमण के संकेतों के लिए घाव स्थल पर पूरा ध्यान दें।
  3. यदि आवश्यक हो तो क्लिप सुधार करें.
    1. अनुभाग 1 (सर्जिकल तैयारी) के अनुसार क्षेत्र तैयार करें।
    2. चरण 2.1-2.3 के अनुसार जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
    3. यदि क्लिप अभी भी मौजूद है, तो क्लिप रिमूवर का उपयोग करके मौजूदा क्लिप को हटा दें.
    4. चरण 2.19-2.21 के अनुसार, एक नई सर्जिकल क्लिप लागू करें।
  4. शल्य चिकित्सा के 7 दिन बाद चरण 9.3.1-9.3.3 के अनुसार सर्जिकल क्लिप को हटा दें या जब जानवर संज्ञाहरण के तहत अगला हो (जैसे भ्रूण हस्तांतरण, कृत्रिम निर्णय प्रक्रिया, या सर्जरी के बाद चमड़े के नीचे का इंजेक्शन)।

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Representative Results

कृत्रिम निर्णय का एक अच्छी तरह से विशेषता मॉडल इस प्रोटोकॉल पेपर (चित्रा 1 ए) में वर्णित है। यहां, युवा वयस्क मादा चूहों (8 सप्ताह की उम्र) ने धारा 1 और खंड 2 में वर्णित सर्जिकल अंडाशय से गुजरना पड़ा। चूहों को तब 2 सप्ताह के लिए आराम दिया गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अंतर्जात डिम्बग्रंथि हार्मोन बहिर्जात हार्मोन के साथ समर्थित होने से पहले समाप्त हो जाएं जैसा कि खंड 3-7 और खंड 9 में वर्णित है। कृत्रिम निर्णय को तिल के तेल के इंट्रावेजिनल इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था, और फिर जानवरों को ऊतक संग्रह तक आराम दिया गया था, जैसा कि खंड 9 में वर्णित है। इस अध्ययन में, सी 57बीएल 6 / जे चूहों में कृत्रिम निर्णय किया गया था, जो आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला माउस तनाव है। ऊतक संग्रह के समय, शरीर का वजन दर्ज किया गया था, और वजन करने से पहले गर्भाशय को विच्छेदित और अच्छी तरह से छंटनी की गई थी (चित्रा 1 बी)। शरीर के वजन के अनुपात के रूप में गर्भाशय के वजन को व्यक्त करके निर्णायक प्रतिक्रिया की सीमा दर्ज की गई थी। इस अध्ययन में, C57BL6/J चूहों के 80% ने निर्णय लिया (0.01012 ± 0.001515, n = 15), जबकि 20% पशु यूटेरी ने निर्णय नहीं लिया (0.002108 ± 0.0001764, n = 3) (चित्रा 1C)।

Figure 1
चित्र 1: योजनाबद्ध और प्रतिनिधि परिणाम । (ए) माउस मॉडल में प्रयोगात्मक रूप से कृत्रिम निर्णय लेने के लिए योजनाबद्ध समयरेखा। संक्षेप: ओवीएक्स = अंडाशय; ई 2 = एस्ट्राडियोल (100 एनजी दिन 1-3, 5 एनजी दिन 7-9); पी 4 = प्रोजेस्टेरोन। नोट: यहां प्रस्तुत परिणामों को उत्पन्न करने के लिए एक पी 4 गोली का उपयोग किया गया था। प्रोजेस्टेरोन वितरण के लिए वैकल्पिक तरीकों में दैनिक चमड़े के नीचे इंजेक्शन और मिनी-आसमाटिक पंप शामिल हैं। (बी) युवा वयस्क सी 57बीएल 6 / जे चूहों से गैर-निर्णायक (एनडी) और निर्णायक (डी) यूटेरी की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 5 मिमी (सी) गैर-निर्णायक और निर्णायक जानवरों में गर्भाशय के वजन की तुलना शरीर के वजन (यूडब्ल्यू: बीडब्ल्यू) अनुपात से की जाती है। डेटा एसईएम ± मतलब हैं; मान-व्हिटनी परीक्षण, ** पी = 0.003; ND: n = 3, D: n = 15 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हार्मोन वितरण विधि ताकत कमजोरियों
चमड़े के नीचे के इंजेक्शन कोई शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप की आवश्यकता नहीं है बार-बार दैनिक हैंडलिंग
सुलभ तकनीक जिसमें शल्य चिकित्सा प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है (पेलेट प्रत्यारोपण की तुलना में) तेल में हार्मोन इंजेक्शन साइट से बाहर लीक हो सकते हैं, इसलिए प्रत्येक जानवर द्वारा अवशोषित मात्रा भिन्न हो सकती है।
धीमी गति से रिलीज होने वाले छर्रों दैनिक हैंडलिंग की कोई आवश्यकता नहीं है शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता
घर में बनाया जा सकता है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं
आसमाटिक मिनी पंप के लिए किफायती विकल्प
जानवरों द्वारा छोटे और बहुत अच्छी तरह से सहन किया जाता है
आसमाटिक मिनी पंप दैनिक हैंडलिंग की कोई आवश्यकता नहीं है शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध महंगा
सबसे सटीक वितरण विधि धीमी गति से रिलीज छर्रों की तुलना में बहुत बड़ा

तालिका 1: हार्मोन वितरण विधियों की ताकत और कमजोरियां।

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Discussion

यह लेख ओवीएक्स करने और गर्भावस्था और प्रजनन क्षमता में गर्भाशय के योगदान को समझने पर केंद्रित अध्ययनों के लिए बहिर्जात हार्मोन प्रदान करने के बारे में चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है। इन विधियों के दो प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों पर दो विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं, जिसमें भ्रूण स्थानांतरण करना और कृत्रिम रूप से निर्णय लेना शामिल है।

जबकि ओवीएक्स प्रदर्शन शुरू में चुनौतीपूर्ण हो सकता है - विशेष रूप से कृंतक मॉडल के लिए नए शोधकर्ताओं के लिए - यह एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है जो एक बार उचित रूप से प्रशिक्षित और अभ्यास किया जाता है। प्रक्रियाओं में प्रमुख चरणों में जानवरों की बारीकी से निगरानी करना शामिल है, जबकि वे संज्ञाहरण के तहत हैं और यह सुनिश्चित करते हैं कि कोई डिम्बग्रंथि ऊतक पीछे नहीं बचा है। कुछ मॉडलों में, ओविडक्ट को बरकरार रखा जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ओविडक्ट प्रचुर मात्रा में एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर्स19 के साथ एक हार्मोन-उत्तरदायी ऊतक है। अंडाशय और डिंबवाहिनी को हटाने के लिए सर्जिकल प्रोटोकॉल सिर्फ अंडाशय को हटाने की तुलना में बहुत सरल है, क्योंकि पूर्व को नग्न आंखों से पूरा किया जा सकता है। केवल अंडाशय को हटाने और बाद के मामले में डिंबवाहिनी को छोड़ने के लिए, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है, क्योंकि यह एक बहुत अधिक जटिल प्रक्रिया है। नतीजतन, ऑपरेटिंग समय बढ़ाया जा सकता है, क्योंकि जानवर को प्रक्रिया के विभिन्न हिस्सों के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप चरण और ऑपरेटिंग क्षेत्र के बीच स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है, जैसे कि आंतरिक शरीर की दीवार को ट्यूरिंग करना।

यहां विस्तृत एनाल्जेसिक प्रोटोकॉल मानक हैं और मोनाश विश्वविद्यालय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित हैं, इसलिए वे व्यक्तिगत संस्थान की नैतिकता समिति की आवश्यकताओं या वरीयताओं के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कृत्रिम निर्णय प्रक्रिया के लिए कोई एनाल्जेसिया प्रदान नहीं किया गया था, क्योंकि विशिष्ट गैर-स्टेरायडल एंटी-इंफ्लेमेटरी निर्णय लेने की प्रक्रिया में हस्तक्षेप करते हैं। यदि शोधकर्ता कृत्रिम निर्णय के समय एनाल्जेसिक प्रदान करना चाहते हैं, तो इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए।

यह काम ओवीएक्स के बाद डिम्बग्रंथि हार्मोन के पूरक के लिए हार्मोन वितरण के तीन तरीकों को प्रस्तुत करता है, और प्रत्येक विधि की अपनी ताकत और कमजोरियां हैं (तालिका 1)। तेल में हार्मोन के चमड़े के नीचे इंजेक्शनसाहित्य 14,16,17 में आम हैं। इस तकनीक में कई ताकतें हैं, जिसमें यह तथ्य भी शामिल है कि किसी भी शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं है, और इस प्रकार, कृंतक सर्जरी या गैस संज्ञाहरण में कोई औपचारिक प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है। यह चमड़े के नीचे इंजेक्शन को लगभग सभी शोध समूहों के लिए एक सुलभ विकल्प बनाता है। इंजेक्शन भी सस्ती और करने में आसान हैं। व्यावहारिक रूप से, हालांकि, उनकी कुछ सीमाएं हैं, खासकर गर्भावस्था के मॉडल में। एक ओवीएक्स जानवर में गर्भावस्था को बनाए रखने के लिए, गर्भावस्था का समर्थन करने के लिए प्रोजेस्टेरोन के साथ हार्मोन पूरक ता दैनिक दी जानी चाहिए। प्रोजेस्टेरोन के मुख्य स्रोत के रूप में लेने के लिए प्लेसेंटा को पर्याप्त रूप से विकसित करने के बाद दैनिक इंजेक्शन को रोकना संभव हो सकता है, हालांकि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में इसका परीक्षण नहीं किया गया है। उपाख्यानात्मक रूप से, चमड़े के नीचे इंजेक्शन के बाद इंजेक्शन साइट से तेल में हार्मोन का रिसाव संभव है। आंशिक रूप से, यह तिल के तेल के रूप में चिपचिपा कुछ आसानी से वितरित करने के लिए आवश्यक सुई के आकार (26 ग्राम) के कारण हो सकता है। इसलिए, प्रयोगात्मक परिणामों के साथ इसे सहसंबंधित करने के लिए तेल में इंजेक्शन करते समय इस रिसाव की निगरानी और रिकॉर्ड करने की आवश्यकता होती है।

धीमी गति से रिलीज होने वाले छर्रों को चमड़े के नीचे के इंजेक्शन से बेहतर माना जाता है, क्योंकि वे लागत प्रभावी और इन-हाउस बनाने के लिए सरल होते हैं। हालांकि, उन्हें कई रातोंरात चरणों की आवश्यकता होती है, जिन्हें प्रयोगात्मक समयसीमा की योजना बनाते समय विचार किया जाना चाहिए। ये छर्रों से प्रतिदिन लगभग 500 μg का स्राव होता है (जैसा कि सेल कल्चर माध्यम और बाद में प्रोजेस्टेरोन एलिसा में इनक्यूबेशन समय पाठ्यक्रम के दौरान मूल्यांकन किया जाता है)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह ऊपर वर्णित दैनिक चमड़े के नीचे इंजेक्शन की तुलना में कम एकाग्रता है, और यह गोली से प्रोजेस्टेरोन के वितरण में स्थिरता के कारण है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, तेल इंजेक्शन इंजेक्शन साइट से बाहर लीक हो सकते हैं, इस प्रकार वितरित समग्र एकाग्रता को कम कर सकते हैं। पिछले अध्ययनों में, ये छर्रों को शल्य चिकित्सा द्वारा डाले जाने के बाद केवल 10 दिनों तक विवो में सक्रिय किया गया है। इसलिए, गर्भावस्था के अध्ययन में, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या मध्य-गर्भावस्था में दूसरी गोली डालना आवश्यक हो सकता है या क्या प्लेसेंटा उस चरण तक गर्भावस्था के लिए पर्याप्त रूप से अंतःस्रावी सहायता प्रदान कर सकता है। इसलिए, ये छर्रों गर्भावस्था के अल्पकालिक मॉडल के लिए इष्टतम हैं, जिसमें यहां प्रस्तुत कृत्रिम निर्णय प्रोटोकॉल शामिल हैं, साथ ही भ्रूण हस्तांतरण के 10 दिनों तक गर्भावस्था के अध्ययन भी शामिल हैं। जबकि धीमी गति से रिलीज होने वाले छर्रों ने दैनिक पशु हैंडलिंग और इंजेक्शन की आवश्यकता को नकार दिया है, प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर फीडबैक लूप को संतुलित करने के लिए कुछ कम खुराक एस्ट्रोजन इंजेक्शन की अभी भी आवश्यकता होती है। इस रणनीति का उपयोग पहले20,21 किया गया है।

अंत में, आसमाटिक मिनी पंप सबसे सटीक हार्मोन वितरण विधि हैं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन वे सबसे महंगे विकल्प हैं। आसमाटिक मिनी पंप चयनित मॉडल के आधार पर 28 दिनों तक रोजाना हार्मोन की एक निर्धारित एकाग्रता प्रदान कर सकते हैं। धीमी गति से रिलीज छर्रों के समान, जबकि आसमाटिक मिनी पंप दैनिक पशु हैंडलिंग की आवश्यकता से बचते हैं, कुछ कम खुराक एस्ट्रोजन इंजेक्शन अभी भी आवश्यक हैं।

यहां वर्णित कृत्रिम निर्णय प्रोटोकॉल डिम्बग्रंथि और भ्रूण के प्रभाव से स्वतंत्र प्रारंभिक गर्भावस्था के मील के पत्थर के अध्ययन की अनुमति देता है। जबकि मनुष्य हर मासिक धर्म चक्र के साथ निर्णय लेने से गुजरते हैं, कृंतक केवल गर्भावस्था की स्थापना के दौरान निर्णय लेते हैं। इस प्रकार, इस मॉडल में एक मैनिपुलेबल कृंतक मॉडल में मानव जैसी गर्भावस्था के मील के पत्थर का अध्ययन करने के लिए बहुत मूल्य है। यहां विस्तृत प्रक्रिया अपेक्षाकृत गैर-आक्रामक है, क्योंकि यह योनि और गर्भाशय ग्रीवा के माध्यम से गर्भाशय के सींग तक सीधे तिल का तेल पहुंचाने के लिए एक गैर-सर्जिकल भ्रूण स्थानांतरण उपकरण (एनएसईटी) का उपयोग करता है। हालांकि यह प्रक्रिया अन्य पद्धतियों की तुलना में कम आक्रामक है, लेकिन वाणिज्यिक एनएसईटी का उपयोग करते समय यह काफी महंगा हो सकता है। इसकी तुलना में, कृत्रिम निर्णय लेने के अन्य प्रकाशित मॉडल ों को तेल17 के अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन करने के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। इसके लिए अनुभाग 1 और चरण 2.1-2.11 में वर्णित के समान एक सर्जिकल सेटअप की आवश्यकता होती है। हालांकि, उन जानवरों में जिन्हें पहले अंडाशय किया गया है, गर्भाशय के सींग को पहचानना और उजागर करना अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है। अंडाशय के लिए पिछली शल्य चिकित्सा प्रक्रिया से बने आसंजन भी हो सकते हैं। इस प्रकार, जबकि निर्णय लेने के लिए सर्जिकल अंतर्गर्भाशयी इंजेक्शन करना अधिक लागत प्रभावी हो सकता है, सर्जिकल और संज्ञाहरण का समय एनएसईटी का उपयोग करने के विकल्प की तुलना में काफी लंबा है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एनएसईटी के लिए इन-हाउस फैब्रिकेटेडविकल्पों के लिए स्थापित प्रोटोकॉल हैं, जो बहुत अधिक लागत प्रभावी हैं।

जबकि भ्रूण स्थानांतरण प्रक्रिया यहां वर्णित है, हमने पहले इस मॉडल और चूहों के विभिन्न उपभेदों में इसकी सफलता दरप्रकाशित की है। इसके अलावा, जबकि यहां वर्णित भ्रूण स्थानांतरण विधि एक सर्जिकल दृष्टिकोण का उपयोग करती है, एनएसईटी को भी इस प्रक्रिया में एकीकृत किया जा सकता है।

इस क्षेत्र में भविष्य की दिशाओं में गर्भावस्था की स्थापना और रखरखाव के लिए विशिष्ट गर्भाशय योगदान पर केंद्रित अध्ययन शामिल होना चाहिए। यह ज्ञान इडियोपैथिक बांझपन, आरोपण विफलता और गर्भावस्था की जटिलताओं की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। इन क्षेत्रों में हमारे ज्ञान का विस्तार आईवीएफ / आईसीएसआई रोगियों के लिए नैदानिक परिणामों में सुधार के साथ-साथ जैविक प्रक्रिया के रूप में गर्भावस्था की हमारी समझ के लिए भी मौलिक है।

अंत में, ओवीएक्स एक सरल प्रक्रिया है जिसे गर्भावस्था और प्रजनन क्षमता में गर्भाशय के योगदान का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल में एकीकृत किया जा सकता है। भविष्य में मॉडल ओवीएक्स और बहिर्जात हार्मोन वितरण को एकीकृत करने से लाभान्वित होंगे ताकि प्रजनन क्षमता और गर्भावस्था में डिम्बग्रंथि-विशिष्ट और गर्भाशय-विशिष्ट योगदान के बीच तुलना की जा सके।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय या अन्य हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

यह काम विक्टोरियन स्टेट गवर्नमेंट ऑपरेशनल इंफ्रास्ट्रक्चर सपोर्ट और ऑस्ट्रेलियाई सरकार के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) आईआरआईएसएस के माध्यम से संभव हुआ। इस काम को मोनाश यूनिवर्सिटी फैकल्टी ऑफ मेडिसिन, नर्सिंग एंड हेल्थ साइंस प्लेटफॉर्म एक्सेस ग्रांट द्वारा ए.एल.डब्ल्यू. (विनशिप-पीएजी 18-0343) को मोनाश प्रजनन सेवा प्लेटफॉर्म तक पहुंचने के लिए समर्थित किया गया था। ए.एल.डब्ल्यू. ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (एआरसी) से डीईसीआरए फंडिंग डीई 21010037 द्वारा समर्थित है। J.N.H. और L.R.A. एक ऑस्ट्रेलियाई सरकार अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित हैं। एल.आर.ए. एक मोनाश स्नातक उत्कृष्टता छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है। केजेएच एक एआरसी फ्यूचर फैलोशिप एफटी 190100265 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps BioScientific 1002 Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps BioScientific 1003D Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips BioScientific 0009971 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator BioScientific 0009974 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover BioScientific 0009976 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection Pfizer NA Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol Sigma E8875
Meloxicam Ilium NA Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips Daniels NS-000242
Multi purpose sealant Dow Corning 732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device ParaTechs 60010 Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone Sigma P0130 Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone Sigma P7556 Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment Allergan NA 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen Zoetis NA Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing Dow Corning 508-008 Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil Sigma S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0 Covidien GS-832

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Griffiths, M. J., Higgins, J. N., Cousins, F. L., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model. J. Vis. Exp. (194), e64763, doi:10.3791/64763 (2023).

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