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Developmental Biology

Metodi per studiare i contributi uterini all'instaurazione della gravidanza in un modello murino ovariectomizzato

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64763
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1, *1, *1
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

L'instaurazione della gravidanza è un processo dinamico che coinvolge l'embrione complesso e la diafonia uterina. I contributi precisi dell'ambiente uterino materno a questi processi rimangono un'area attiva di indagine. Qui, vengono forniti protocolli dettagliati per aiutare a progettare modelli animali in vivo per affrontare queste domande di ricerca.

Abstract

Affinché la gravidanza sia stabilita, una blastocisti vitale deve interagire con successo con un rivestimento uterino ricettivo (endometrio) per facilitare l'impianto e la formazione della placenta e consentire la gravidanza in corso. I limiti al successo della gravidanza causati da difetti embrionali sono ben noti e sono stati ampiamente superati negli ultimi decenni con l'aumento della fecondazione in vitro (IVF) e delle tecnologie di riproduzione assistita. Finora, tuttavia, il campo non ha superato i limiti causati da un endometrio inadeguatamente ricettivo, con conseguente stagnazione dei tassi di successo della fecondazione in vitro. Le funzioni ovariche ed endometriali sono strettamente intrecciate, poiché gli ormoni prodotti dall'ovaio sono responsabili della ciclicità mestruale dell'endometrio. Pertanto, quando si utilizzano modelli di roditori di gravidanza, può essere difficile accertare se un risultato osservato è dovuto a un deficit ovarico o uterino. Per ovviare a questo, è stato sviluppato un modello murino ovariectomizzato con trasferimento embrionale o decidualizzazione artificiale per consentire lo studio dei contributi specifici dell'utero alla gravidanza. Questo articolo fornirà istruzioni su come eseguire l'ovariectomia e offrirà approfondimenti su varie tecniche per la fornitura di ormoni esogeni per supportare la decidualizzazione artificiale di successo o la gravidanza dopo il trasferimento di embrioni da donatori sani. Queste tecniche includono iniezione sottocutanea, pellet a lento rilascio e mini pompe osmotiche. Saranno discussi i principali vantaggi e svantaggi di ciascun metodo, consentendo ai ricercatori di scegliere il miglior disegno di studio per la loro specifica domanda di ricerca.

Introduction

Con il crescente uso delle tecnologie di riproduzione assistita negli ultimi decenni, molte barriere al concepimento sono state superate, consentendo a molte coppie di creare una famiglia nonostante i problemi di fertilità1. I deficit di ovociti o spermatozoi possono spesso essere bypassati utilizzando la fecondazione in vitro o l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi; Tuttavia, le questioni relative all'utero e alla ricettività endometriale rimangono una sfuggente "scatola nera" del potenziale riproduttivo2.

La gravidanza è stabilita quando un embrione di alta qualità interagisce con successo con un endometrio ricettivo (rivestimento uterino). Le probabilità di successo di una gravidanza in un dato ciclo mestruale sono basse, intorno al 30%3,4. Di quelle che hanno successo, solo il 50% -60% avanza oltre le 20 settimane di gestazione, con il fallimento dell'impianto responsabile del 75% delle gravidanze che non raggiungono le 20 settimane3. Nonostante queste cifre risalgano alla fine del 1990, il campo deve ancora superare i limiti causati da un endometrio inadeguatamente ricettivo. Ciò ha comportato tassi di successo della fecondazione in vitro stagnanti - e talvolta in calo - negli ultimi anni 5,6.

Le donne con infertilità inspiegabile hanno spesso una finestra spostata di ricettività o non sono in grado di raggiungere la ricettività per ragioni sconosciute. Recentemente è stato sviluppato l'array di ricettività endometriale, che valuta l'espressione di centinaia di geni con lo scopo di adattare i tempi del trasferimento embrionale alla finestra di ricettività di un individuo 7,8,9. Tuttavia, il campo manca ancora di una comprensione della patogenesi delle complicanze della gravidanza che si manifestano dopo che il processo di impianto è completo.

Il sistema riproduttivo femminile è altamente dinamico e sotto stretto controllo ormonale. L'asse ipotalamo-ipofisi-gonadia (HPG) controlla il rilascio dell'ormone luteinizzante e dell'ormone follicolo-stimolante, che regolano aspetti del ciclo ovarico, tra cui la maturazione del follicolo e l'attività degli estrogeni e del progesterone. A sua volta, il ciclo mestruale uterino è regolato da estrogeni e progesterone10,11. Pertanto, lo studio dei meccanismi biologici uterini è complicato dall'influenza ovarica. Ad esempio, quando si studia come le terapie antitumorali possono avere un impatto sull'utero, può essere difficile distinguere se qualsiasi fenotipo uterino osservato (come la perdita di gravidanza o l'aciclicità mestruale) è il risultato di un insulto diretto all'utero o di un effetto consequenziale da danni alle ovaie.

Per comprendere in modo completo la fertilità, i contributi uterini alla gravidanza devono essere caratterizzati. È importante sottolineare che questa comprensione deve estendersi oltre la funzione uterina sotto controllo ovarico. Questo non può essere studiato negli esseri umani; Pertanto, vengono spesso impiegati modelli animali. Come tale, l'ovariectomia (OVX) è comunemente usata per consentire ai ricercatori di regolare i cicli estrali dei roditori (analoghi al ciclo mestruale) fornendo ormoni esogeni. Inoltre, OVX consente di studiare le risposte uterine indipendentemente dall'influenza ovarica12. Tuttavia, se gli ormoni non vengono immediatamente forniti dopo l'OVX, si verificherà un fenotipo della menopausa, che deve essere attentamente considerato dai ricercatori.

OVX è frequentemente utilizzato nei modelli di roditori 13,14,15,16,17 ed è relativamente facile da eseguire dopo un adeguato allenamento. I metodi variano a seconda che l'ovaio da solo o l'ovaio e l'ovidotto vengano rimossi, nonché a seconda dell'età dell'animale (gli animali adulti in bicicletta hanno ovaie più grandi con un corpo luteo visibile sulla loro superficie, il che significa che le loro ovaie sono più facili da visualizzare). Allo stesso modo, esistono molti metodi di integrazione ormonale, tra cui iniezioni sottocutanee14, pellet a lento rilascio 15, mini pompe osmotiche18 e innesto ovarico.

In questo articolo, vengono fornite istruzioni dettagliate su come eseguire l'ovariectomia e preparare tre tipi di integrazione ormonale, tra cui iniezioni sottocutanee, pellet a lento rilascio e mini pompe osmotiche. Vengono forniti due protocolli dettagliati per endpoint sperimentali che beneficiano di OVX seguiti da supplementazione ormonale esogena (trasferimento embrionale e decidualizzazione artificiale). Questo articolo discute i punti di forza e di debolezza di ciascun approccio con l'obiettivo di guidare i ricercatori su come eseguire studi per isolare gli impatti sull'utero, in particolare nei campi di ricerca sulla gravidanza e sulla fertilità.

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Protocol

Tutti gli animali sono stati alloggiati in strutture a temperatura controllata e ad alta barriera (Monash University Animal Research Laboratory) con accesso gratuito a cibo e acqua e un ciclo luce-buio di 12 ore. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con l'approvazione del comitato etico della piattaforma di ricerca sugli animali Monash (# 21908, 17971) ed eseguite in conformità con il Codice di condotta del Consiglio nazionale per la salute e la ricerca medica per la cura e l'uso degli animali.

1. Preparazione chirurgica

  1. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici, garze e asciugamani di carta necessari per le procedure su un ciclo duro/secco a 121 °C con un tempo di attesa di 30 min e un tempo di asciugatura di 30 min.
  2. Stendere un cuscinetto sterile per lo spazio di lavoro chirurgico e preparare analgesici.
    1. Diluire il carprofene in soluzione salina sterile a 1 mg/ml e diluire la bupivacaina in soluzione salina sterile in una soluzione allo 0,5% (p/v).
    2. Aggiungere 3,5 ml di meloxicam a una bottiglia d'acqua in gabbia da 400 ml.
  3. Preriscaldare i termofori per le gabbie di recupero e installare lampade termiche per far brillare luce indiretta sugli animali in fase di recupero.
  4. Assicurarsi che tutti i DPI appropriati siano indossati, tra cui una rete per capelli, una maschera per il viso, un camice e guanti.
  5. Praticare una buona tecnica sterile, compresa la spruzzatura regolare dei guanti con etanolo e permettendo loro di evaporare prima di maneggiare l'animale o gli strumenti chirurgici per evitare la contaminazione da etanolo.

2. Esecuzione dell'ovariectomia

  1. Utilizzando una macchina per anestesia a gas con isoflurano, preriempire la scatola di induzione per 3-5 minuti al 5% di isoflurano con la portata impostata a 4 L / min.
  2. Posizionare il mouse all'interno della scatola di induzione e, una volta incosciente, spostarlo sul cono del naso e ridurre la portata a 0,4 L/min, con il vaporizzatore isoflurano impostato a ~2,5%.
    NOTA: La percentuale di isoflurano utilizzata per il resto della procedura varia in base al ceppo del topo, all'età e all'esposizione ai trattamenti (ad es. chemioterapia) e deve essere aggiustata sulla base di un'attenta valutazione dei modelli respiratori di ogni singolo animale. I modelli di respirazione dovrebbero rimanere come respiri addominali regolari. Respiri toracici rapidi possono indicare che un piano chirurgico profondo non è stato raggiunto o mantenuto; In questo caso, regolare la percentuale del vaporizzatore isoflurano secondo necessità.
  3. Applicare generosamente il lubrificante per gli occhi stringendo il tubo e tamponando delicatamente l'occhio.
  4. Radere una piccola area (2 cm x 2 cm) in corrispondenza e sotto la gobba della colonna vertebrale.
  5. Somministrare 5 mg/kg di carprofen da una soluzione diluita di 1 mg/ml per via sottocutanea alla collottola.
  6. Testare la profondità dell'anestesia con il riflesso del pizzicamento della punta pizzicando la punta posteriore del mouse. Se non c'è una reazione di pizzicamento del piede, l'animale è nel piano chirurgico profondo e la procedura può continuare.
  7. Applicare il betadine all'area chirurgica e coprire con un drappo chirurgico (una garza con una finestra di 2 cm x 2 cm ritagliata).
  8. Usando una pinza a denti di ratto, tirare la pelle all'altezza della schiena verso l'alto e fare un'incisione longitudinale di ~ 5 mm.
    NOTA: Un'incisione cutanea a questa altezza sulla schiena dell'animale è la migliore per il posizionamento della clip chirurgica per ridurre la possibilità che l'animale rimuova le clip e richieda riparazioni delle clip.
  9. Usando una pinza smussata, procedere a sezionare la pelle lontano dallo strato muscolare sottostante, spostandosi verso il basso e su un lato verso il rene.
  10. Identificare visivamente il rene, l'ovaio e il grasso ovarico attraverso la parete muscolare.
    NOTA: Il rene apparirà di un colore rosso scuro, il cuscinetto adiposo apparirà bianco brillante e, se visibile, l'ovaia apparirà come un piccolo punto rosa all'interno del cuscinetto adiposo.
  11. Usando una pinza, afferrare e sollevare lo strato muscolare. Fai un'incisione ~ 0,5-1 cm con forbici chirurgiche affilate. Continuare a tenere la parete muscolare con una pinza e passare dalle forbici alle pinze smussate per tirare il cuscinetto di grasso ovarico attraverso l'incisione.
  12. Utilizzando un portaago curvo, morsetto sotto l'ovaio e l'ovidotto all'estremità distale del corno uterino.
    NOTA: In alternativa, l'ovaio da solo può essere rimosso, lasciando intatto l'ovidotto. Tuttavia, è necessario un microscopio da dissezione per visualizzare con precisione la distinzione tra ovaio e ovidotto.
  13. Rimuovere l'ovaia con le forbici o un bisturi. Continuare a bloccare per 30 secondi per evitare un eccessivo sanguinamento.
  14. Rimuovere il morsetto e tamponarlo con una garza sterile se necessario.
  15. Per chiudere l'incisione della parete muscolare, utilizzare una pinza per sollevare la parte superiore dell'incisione in modo che l'incisione si unisca naturalmente.
  16. Utilizzare suture di seta (taglia 3-0) per chiudere l'incisione della parete muscolare con un nodo del chirurgo.
  17. Applicare due o tre gocce di bupivacaina per via topica utilizzando una siringa da 1 mL senza ago collegato e ripetere i passaggi 2,9-2,17 sull'altro lato.
  18. Per chiudere l'incisione cutanea, utilizzare una garza per tamponare l'area asciutta di bupivacaina in eccesso e premere i due lati della pelle insieme.
  19. Applicare una o due clip chirurgiche da 7 mm, lasciando spazio per il gonfiore come parte del processo di guarigione.
  20. Spostare il mouse in una gabbia di recupero e monitorare attentamente per 15 minuti.
    NOTA: Gli animali dovrebbero svegliarsi rapidamente; Assicurati di monitorare attentamente la respirazione per i normali schemi di respirazione toracica.

3. Preparazione ormonale: iniezione sottocutanea

  1. Preparare una soluzione madre da 1 mg/mL di estradiolo.
    1. Pesare 0,001 g (1 mg) di polvere di estradiolo in un tubo sterile da 1,5 ml.
    2. Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% al tubo e vortice per alcuni secondi.
      NOTA: L'etanolo rimarrà limpido con macchie visibili di polvere di estradiolo.
    3. Avvolgere il tubo con pellicola per evitare l'evaporazione dell'etanolo.
    4. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio e posizionarlo su un bilanciere durante la notte per sciogliere completamente la polvere di estradiolo.
    5. Diluire questo brodo di 1 mg/mL in olio di sesamo alla concentrazione finale desiderata.
      NOTA: Sono necessarie dosi di 100 ng per 3 giorni per l'adescamento prima della decidualizzazione artificiale e ulteriori basse dosi di 25 ng sono necessarie quando viene somministrato il progesterone. Questo per combattere il ciclo di feedback che controlla l'espressione del recettore del progesterone. Per il trasferimento di embrioni, sono necessarie due dosi di 100 ng il giorno 1 e il giorno 3 prima del trasferimento dell'embrione il giorno 4. Al momento del trasferimento dell'embrione, è necessaria anche una dose bassa di 25 ng.
    6. Aspirare la quantità necessaria di estradiolo nell'olio in una siringa da 1 ml, quindi collegare una punta dell'ago da 26 G.
    7. Iniettare la dose appropriata per via sottocutanea (sulla collottola o sul fianco; 100 ng/100 μL o 25 ng/100 μL per l'adescamento prima del trasferimento embrionale o della decidualizzazione artificiale o al momento del trasferimento embrionale) alla frequenza richiesta.
      NOTA: L'olio è molto viscoso, quindi assicurarsi di iniettare lentamente e mettere in pausa per alcuni secondi prima di rimuovere l'ago. Ciò ridurrà al minimo la quantità di olio che fuoriesce dal sito di iniezione.
  2. Preparare una soluzione madre di progesterone da 200 mg / ml.
    1. Pesare 0,4 g (400 mg) di polvere di progesterone in un tubo sterile da 5 ml.
    2. Aggiungere 2 ml di etanolo al 100% al tubo e vortice per alcuni secondi.
      NOTA: L'etanolo diventerà di colore bianco.
    3. Ripetere i passaggi 3.1.3-3.1.4.
    4. Diluire il brodo di 200 mg/ml in olio di sesamo alla concentrazione finale desiderata.
      NOTA: Sono necessarie dosi di 2 mg al giorno per sostenere il trasferimento embrionale.
    5. Iniettare la dose appropriata (ad es. 2 mg/100 μL al giorno per sostenere la gravidanza) per via sottocutanea come nei punti 3.1.6-3.1.7.

4. Preparazione ormonale: pellet a lento rilascio

  1. Posare una pellicola sulla superficie di un flusso laminare o di una cappa di biosicurezza di classe II.
  2. Posizionare tutta l'attrezzatura (guanti, piastre di Petri, siringhe da 1 ml, pinze sottili) nel cappuccio e accendere l'UV per 20 minuti.
    NOTA: Non accendere l'UV con il sigillante all'interno della cappa come si imposterà.
  3. Lavare il tubo silastic in etanolo al 100% e lasciarlo asciugare all'aria nel cappuccio. Una volta asciutto, segnare ~ 1 cm di lunghezza lungo il tubo e tagliare con un bisturi.
  4. Rimuovere lo stantuffo da una siringa e spremere ~ 200 μL di sigillante. Riposizionare lo stantuffo e estrarre una piccola quantità di sigillante dalla siringa.
  5. Applicare una piccola quantità di sigillante su un'estremità del tubo e lisciarlo con un dito guantato.
  6. Lasciare asciugare per una notte o per 20-30 minuti alla luce UV all'interno della cappa.
  7. Versare una quantità appropriata di progesterone in una capsula di Petri sterilizzata. Utilizzando una pinza, raccogliere pellet nella polvere di progesterone per riempire il pellet.
    1. Picchiettare l'estremità sigillata del pellet sulla superficie della cappa per condensare il progesterone verso il basso. In alternativa, utilizzare la fine del forcipe sterilizzato per riempire il progesterone. Lasciare abbastanza spazio per più sigillante.
  8. Sigillare l'estremità aperta con sigillante, come descritto nei passaggi 3.4-3.5.
  9. Avvolgere la capsula di Petri contenente i pellet di progesterone in un foglio per proteggerla dalla luce.
  10. Attivare i pellet per un minimo di 72 ore prima dell'inserimento sottocutaneo incubando in FCS stripped di carbone all'1% (cs-FCS: PBS) a 37 °C.
    NOTA: I pellet possono essere prodotti alla rinfusa con una singola estremità sigillata in anticipo. Tuttavia, il progesterone fresco dovrebbe essere usato per riempirli ogni volta. Assicurarsi che i pellet prefabbricati siano sterilizzati con raggi UV prima del riempimento con progesterone. I pellet secerneranno ~ 500 μg / die per 6-10 giorni, che è un supporto sufficiente per la decidualizzazione artificiale e le procedure di trasferimento degli embrioni, anche se potrebbe essere necessaria un'ulteriore iniezione di estrogeni a basso dosaggio per mantenere l'attività del recettore del progesterone oltre 4-5 giorni. Oltre 10 giorni, potrebbe essere necessario un pellet di progesterone sostitutivo.

5. Preparazione ormonale: mini pompe osmotiche

  1. Preparare il progesterone alla concentrazione desiderata in una soluzione acquosa e selezionare il modello di mini pompa osmotica appropriato (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: Per il paragrafo 7 (procedura sperimentale: trasferimento embrionale), è richiesta la somministrazione di 2 mg/die per 12 giorni. Pertanto, sciogliere 28 mg di progesterone in ~ 100 μL di acqua sterile per animale (seguire le istruzioni del produttore per il volume specifico). Possono essere necessarie diluizioni seriali. Per la sezione 8 (procedura sperimentale: decidualizzazione artificiale), è richiesta la consegna di 500 μg al giorno per 3 giorni. Pertanto, sciogliere 1.500 μg di progesterone in ~ 100 μL di acqua sterile per animale. Preparare una soluzione aggiuntiva per tenere conto del volume perso durante la procedura di riempimento.
  2. Installare l'attrezzatura (guanti, salviette a basso contenuto di lanugine, piastre di Petri, soluzione salina sterile, siringhe da 1 ml, barchette di piccole dimensioni, pellicole e bilance con precisione di 0,01 g) all'interno di una cappa di biosicurezza di classe II, quindi accendere l'UV per 20 minuti.
  3. Aspirare la soluzione ormonale in una siringa da 1 ml, quindi collegare un tubo di riempimento sterile, assicurandosi attentamente che non ci siano bolle d'aria.
  4. Pesare la pompa e il suo moderatore di flusso all'interno di una barca di pesatura sterile.
  5. Inserire il tubo di riempimento attraverso l'apertura nella parte superiore della pompa fino a quando non può andare oltre.
  6. Tenendo la pompa in posizione verticale, spingere lentamente lo stantuffo della siringa per riempire il tubo.
    NOTA: il riempimento rapido deve essere evitato in quanto ciò può introdurre bolle d'aria nella pompa.
  7. Quando la soluzione trabocca dalla parte superiore della pompa, rimuovere delicatamente il tubo di riempimento e rimuovere la soluzione in eccesso con una salvietta sterile a basso contenuto di lanugine.
  8. Inserire il moderatore di flusso attraverso l'apertura nella parte superiore della pompa fino a quando non può andare oltre. Una volta completamente inseriti, premere con decisione la pompa e il moderatore di flusso insieme.
  9. Pesare la pompa riempita con il moderatore di flusso in posizione.
    NOTA: La differenza di peso ottenuta dai punti 5.3 e 5.8 darà il peso netto della soluzione caricata (cioè un aumento di 0,1 g = 100 μL di soluzione aggiunta).
  10. Posizionare la pompa riempita in una capsula di Petri sterile piena di soluzione salina sterile.
  11. Una volta riempite tutte le pompe, avvolgere la capsula di Petri in un foglio di alluminio e posizionarla all'interno di un incubatore a 37 °C per innescare per almeno 4-6 ore (o fino al momento dell'uso).

6. Procedura chirurgica: inserimento di pellet di ormone sottocutaneo e mini pompe

  1. Preparare l'area come da paragrafo 1 (preparazione chirurgica).
  2. Anestetizzare gli animali secondo i punti 2.1-2.3.
  3. Rasare una piccola area alla collottola, ovvero (~1 cm x 1 cm).
  4. Somministrare 5 mg/kg di carprofen da una soluzione diluita di 1 mg/ml per via sottocutanea nel fianco della gamba.
  5. Test per il riflesso del pizzicamento della punta. Se non c'è riflesso, l'animale è nel piano chirurgico profondo e la procedura può iniziare.
  6. Applicare il betadine sull'area chirurgica e coprirlo con un drappo chirurgico (una garza con una finestra di 2 cm x 2 cm ritagliata).
  7. Usando una pinza dai denti di ratto, tirare la pelle alla collottola del collo (a metà strada tra la vera collottola e l'intuizione della schiena) verso l'alto e fare un'incisione longitudinale di ~ 5 mm.
  8. Usando una pinza smussata, sezionare la pelle lontano dallo strato muscolare sottostante in una direzione verso il basso.
    NOTA: Per l'inserimento della mini pompa osmotica, creare una tasca lungo un lato dell'animale in modo che la pompa non limiti il movimento dell'animale o prema contro il sito di incisione.
  9. Una volta che è stato fatto spazio sufficiente per il pellet ormonale o la mini pompa, utilizzare una pinza sterile per raccogliere il pellet o la mini pompa e inserirlo nella tasca sottocutanea realizzata con dissezione smussata.
  10. Per chiudere l'incisione cutanea, assicurarsi che il pellet o la mini pompa siano abbastanza lontani nella tasca in modo che le clip chirurgiche non la danneggino.
  11. Applicare localmente bupivacaina come da punto 2.17.
  12. Chiudere la ferita con una clip chirurgica. Spostare il mouse in una gabbia di recupero e monitorare attentamente per 15 minuti. Poiché si tratta di una procedura breve, gli animali dovrebbero essere deambulanti in pochi minuti.

7. Procedura sperimentale: trasferimento di embrioni

  1. Per gli animali ovariectomizzati, ormone-prime 3 giorni prima del trasferimento embrionale mediante iniezione sottocutanea di 100 ng/100 μL di estradiolo (fase 3.1).
  2. Un giorno prima del trasferimento dell'embrione, gli animali vengono sottoposti a iniezione sottocutanea di 2 mg/100 μL di medrossiprogesterone acetato (fase 3.2).
  3. Preparare l'area come da paragrafo 1 (preparazione chirurgica).
  4. Anestetizzare gli animali secondo i punti 2.1-2.3.
  5. Iniziare la procedura come da passaggi 2.4-2.10.
  6. Sotto un microscopio da dissezione, creare un punto di iniezione intrauterina con una punta dell'ago da 26 G.
  7. Pipettare cinque blastocisti in una goccia di supporto M2, quindi trasferirli nel corno uterino.
  8. Per chiudere l'incisione della parete muscolare, sollevare la parte superiore dell'incisione usando una pinza in modo che l'incisione si unisca naturalmente.
  9. Usando punti di sutura di seta, chiudi il sito della parete muscolare con un nodo del chirurgo. Applicare gocce di bupivacaina per via topica.
  10. Ripetere i passaggi 7.5-7.8 sull'altro lato.
  11. Per chiudere l'incisione cutanea, utilizzare una garza per tamponare l'area asciutta di bupivacaina in eccesso e premere i due lati della pelle insieme.
  12. Applicare una o due clip chirurgiche, lasciando spazio per il gonfiore come parte del processo di guarigione.
    NOTA: Se gli animali sono ovariectomizzati, sono necessari ormoni esogeni al momento del trasferimento dell'embrione. Iniettare progesterone per via sottocutanea (2 mg) o inserire un pellet di progesterone sottocutaneo o una mini pompa osmotica. Per combattere l'eccesso di progesterone, al momento del trasferimento dell'embrione è necessaria un'iniezione sottocutanea di estrogeni a basso dosaggio (25 ng / 100 μL).
  13. Portare con attenzione il mouse in una gabbia di recupero e monitorare attentamente per 15 minuti.
    NOTA: Gli animali dovrebbero svegliarsi rapidamente; Assicurati di monitorare attentamente la respirazione per i normali schemi di respirazione toracica.

8. Procedura sperimentale: decidualizzazione artificiale

  1. Innesca gli animali con 100 ng/100 μL di estradiolo il giorno 1, il giorno 2 e il giorno 3, come da sezione 3 (preparazione ormonale: iniezione sottocutanea) 8 giorni prima della decidualizzazione artificiale.
  2. Ormone-innesca gli animali con 5 ng/100 μL di estradiolo il giorno 7, giorno 8 e giorno 9, come da sezione 3 (preparazione ormonale: iniezione sottocutanea) 2 giorni prima della decidualizzazione artificiale.
    NOTA: L'iniezione finale deve avvenire un minimo di 3 ore (e un massimo di 4 ore) prima della procedura di decidualizzazione artificiale.
  3. Animali ormono-prime con un pellet di progesterone sottocutaneo o una mini pompa osmotica (500 μg/die), come da sezione 4, sezione 5 e sezione 8, 2 giorni prima della decidualizzazione artificiale.
  4. Preparare l'area come da paragrafo 1 (preparazione chirurgica).
  5. Anestetizzare gli animali secondo i punti 2.1-2.2.
  6. Testare la profondità dell'anestesia con il riflesso del pizzico della punta. Se non c'è una reazione di pizzicamento del piede, l'animale è nel piano chirurgico profondo e la procedura può continuare.
  7. Posizionare il mouse in posizione prona, sollevare la coda e inserire lentamente uno speculum di 6 mm di diametro nella vagina.
  8. Mantenendo il naso dell'animale nel cono del naso anestetico, posizionare la parte inferiore del corpo dell'animale tra il primo e il secondo dito della mano non dominante. Usa il pollice per spingere delicatamente la coda verso l'alto per mantenere l'apertura vaginale in vista.
  9. Trasferire 20 μL di olio di sesamo in un corno uterino utilizzando una punta di trasferimento embrionale non chirurgica (attaccata a una pipetta da 20 μL).
    1. Mantenendo il livello della pipetta con l'apertura vaginale, inserire la punta nella vagina e attraverso la cervice nel corno uterino. Una volta che la punta è nel corno uterino, premere delicatamente la punta contro la superficie endometriale (se si utilizza la tecnica di manipolazione sopra, questo movimento sarà sentito contro il secondo dito) ed espellere lentamente l'olio.
      NOTA: tenere premuto lo stantuffo della pipetta, attendere 10 secondi per assicurarsi che tutto l'olio si sia disperso e rimuovere lentamente la punta di trasferimento mantenendo premuto lo stantuffo.
  10. Rimuovere lo speculum dalla vagina.
  11. Portare con attenzione il mouse alla gabbia di recupero e monitorare attentamente per 15 minuti.
    NOTA: Gli animali dovrebbero svegliarsi rapidamente. Monitorare attentamente la loro respirazione per i normali schemi di respirazione toracica.
  12. Limitare la manipolazione degli animali e tenerli in un ambiente tranquillo per 96 ore dopo la procedura.
    NOTA: rumori forti o bruschi cambiamenti nel loro ciclo di luce e buio avranno un impatto sul successo della procedura. Al momento della dissezione tissutale, l'entità del successo della decidualizzazione può essere misurata come rapporto tra peso uterino e peso corporeo. La procedura di decidualizzazione artificiale ha un tasso di successo dell'80%. Pertanto, escludere gli animali che non riescono a decidualizzare e tenerne conto quando si selezionano le dimensioni del campione per gli esperimenti.

9. Procedura chirurgica: recupero post-chirurgico, monitoraggio e riparazione delle clip

  1. Consentire agli animali di recuperare i cuscinetti termici metà su e metà fuori durante la notte prima di riportarli nella loro gabbia di casa.
  2. Monitorare gli animali ogni giorno per 5 giorni dopo l'intervento chirurgico, prestando molta attenzione al sito della ferita per i segni di infezione.
  3. Se necessario, eseguire la riparazione della clip.
    1. Preparare l'area come da paragrafo 1 (preparazione chirurgica).
    2. Anestetizzare gli animali secondo i punti 2.1-2.3.
    3. Rimuovete la clip esistente utilizzando un dispositivo di rimozione clip se la clip è ancora presente.
    4. Applicare una nuova clip chirurgica, come da passaggi 2.19-2.21.
  4. Rimuovere le clip chirurgiche 7 giorni dopo l'intervento chirurgico secondo i passaggi 9.3.1-9.3.3 o quando l'animale è prossimo sotto anestesia (ad esempio per un trasferimento di embrioni, la procedura di decidualizzazione artificiale o un'iniezione sottocutanea dopo l'intervento chirurgico).

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Representative Results

Un modello ben caratterizzato di decidualizzazione artificiale è descritto in questo documento di protocollo (Figura 1A). Qui, topi femmina giovani adulti (8 settimane di età) sono stati sottoposti a ovariectomia chirurgica come descritto nei paragrafi 1 e 2. I topi sono stati quindi fatti riposare per 2 settimane per assicurarsi che gli ormoni ovarici endogeni si dissipassero prima di essere supportati con ormoni esogeni come descritto nelle sezioni 3-7 e 9. La decidualizzazione artificiale è stata indotta da un'iniezione intravaginale di olio di sesamo, e quindi gli animali sono stati riposati fino alla raccolta del tessuto, come descritto nel paragrafo 9. In questo studio, la decidualizzazione artificiale è stata eseguita nei topi C57BL6 / J, un ceppo di topo comunemente usato. Al momento della raccolta dei tessuti, è stato registrato il peso corporeo e l'utero è stato sezionato e ben tagliato prima di essere pesato (Figura 1B). L'entità della risposta deciduale è stata registrata esprimendo il peso uterino come rapporto del peso corporeo. In questo studio, l'80% dei topi C57BL6 / J ha decidualizzato (0,01012 ± 0,001515, n = 15), mentre il 20% degli uteri animali non ha decidualizzato (0,002108 ± 0,0001764, n = 3) (Figura 1C).

Figure 1
Figura 1: Risultati schematici e rappresentativi . (A) Cronologia schematica per indurre sperimentalmente la decidualizzazione artificiale in un modello murino. Abbreviazioni: OVX = ovariectomia; E2 = estradiolo (100 ng giorni 1-3, 5 ng giorni 7-9); P4 = progesterone. Nota: Un pellet P4 è stato utilizzato per generare i risultati presentati qui. I metodi alternativi per la somministrazione di progesterone includono iniezioni sottocutanee giornaliere e mini-pompe osmotiche. (B) Immagini rappresentative di uteri non decidualizzati (ND) e decidualizzati (D) di topi giovani adulti C57BL6/J. Barre della scala = 5 mm.(C) Confronto tra il peso uterino e il peso corporeo (UW:BW) in animali non decidualizzati e decidualizzati. I dati sono medi ± SEM; Test di Mann-Whitney, **p = 0,003; ND: n = 3, D: n = 15. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Metodo di consegna ormonale Punti di forza Debolezze
Iniezioni sottocutanee Nessun intervento chirurgico richiesto Manipolazione giornaliera ripetuta
Tecnica accessibile che non richiede formazione chirurgica (rispetto all'impianto di pellet) Gli ormoni nell'olio possono fuoriuscire dal sito di iniezione, quindi la quantità assorbita da ciascun animale può variare
Pellet a lento rilascio Nessuna necessità di manipolazione quotidiana Procedura chirurgica richiesta
Può essere fatto in casa Non disponibile in commercio
Alternativa economica alle mini pompe osmotiche
Piccolo e molto ben tollerato dagli animali
Mini pompe osmotiche Nessuna necessità di manipolazione quotidiana Procedura chirurgica richiesta
Disponibile in commercio Caro
Il metodo di consegna più accurato Molto più grande dei pellet a lento rilascio

Tabella 1: Punti di forza e di debolezza dei metodi di somministrazione ormonale.

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Discussion

Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate su come eseguire OVX e fornire ormoni esogeni per studi incentrati sulla comprensione dei contributi uterini alla gravidanza e alla fertilità. Vengono forniti due protocolli dettagliati su due applicazioni sperimentali di questi metodi, tra cui l'esecuzione del trasferimento di embrioni e l'induzione della decidualizzazione artificialmente.

Mentre l'esecuzione di OVX può essere inizialmente impegnativa - specialmente per i ricercatori nuovi ai modelli di roditori - è una procedura relativamente semplice una volta adeguatamente addestrata e praticata. I passaggi chiave delle procedure includono un attento monitoraggio degli animali mentre sono sotto anestesia e la garanzia che non vi sia alcun tessuto ovarico lasciato indietro. In alcuni modelli, l'ovidotto può essere lasciato intatto. Tuttavia, va notato che l'ovidotto è un tessuto ormono-sensibile con abbondanti recettori per estrogeni e progesterone19. Il protocollo chirurgico per la rimozione dell'ovaio e dell'ovidotto è molto più semplice rispetto alla rimozione della sola ovaia, poiché il primo può essere completato ad occhio nudo. Per rimuovere solo l'ovaio e lasciare l'ovidotto in posizione in quest'ultimo caso, è necessario un microscopio da dissezione, poiché si tratta di una procedura molto più complessa. Di conseguenza, il tempo di funzionamento può essere prolungato, poiché l'animale deve essere spostato tra lo stadio del microscopio da dissezione e il campo operatorio per diverse parti della procedura, come la sutura della parete interna del corpo.

I protocolli analgesici qui descritti sono standard e approvati dal comitato etico animale della Monash University, quindi possono variare a seconda dei requisiti o delle preferenze del comitato etico della singola istituzione. Va notato che non è stata fornita alcuna analgesia per la procedura di decidualizzazione artificiale, poiché i tipici antinfiammatori non steroidei interferiscono con il processo di decidualizzazione. Se i ricercatori desiderano fornire analgesici al momento della decidualizzazione artificiale, questo dovrebbe essere preso in considerazione.

Questo lavoro presenta tre metodi di somministrazione ormonale per integrare gli ormoni ovarici dopo OVX e ogni metodo ha i suoi punti di forza e di debolezza (Tabella 1). Le iniezioni sottocutanee di ormoni nell'olio sono comuni nella letteratura14,16,17. Questa tecnica ha molti punti di forza, incluso il fatto che non è richiesta alcuna procedura chirurgica e, quindi, non è richiesta alcuna formazione formale in chirurgia dei roditori o anestesia gassosa. Ciò rende l'iniezione sottocutanea un'opzione accessibile per quasi tutti i gruppi di ricerca. Le iniezioni sono anche convenienti e facili da eseguire. Praticamente, tuttavia, hanno alcune limitazioni, in particolare nei modelli di gravidanza. Per mantenere la gravidanza in un animale OVX, l'integrazione ormonale con progesterone deve essere somministrata quotidianamente per sostenere la gravidanza. Potrebbe essere possibile interrompere le iniezioni giornaliere una volta che la placenta è sufficientemente sviluppata da assumere la principale fonte di progesterone, anche se questo non è stato sperimentato nei protocolli presentati qui. Aneddoticamente, è possibile che gli ormoni nell'olio fuoriescano dal sito di iniezione dopo l'iniezione sottocutanea. In parte, ciò può essere dovuto alla dimensione dell'ago richiesta (26 G) per erogare facilmente qualcosa di viscoso come l'olio di sesamo. Pertanto, questa perdita deve essere monitorata e registrata quando si eseguono iniezioni in olio al fine di correlare questo con i risultati sperimentali.

I pellet a lento rilascio sono preferibili alle iniezioni sottocutanee, in quanto sono economici e semplici da realizzare internamente. Tuttavia, richiedono più passaggi durante la notte, che dovrebbero essere considerati quando si pianificano le tempistiche sperimentali. Questi pellet secernono circa 500 μg al giorno (come valutato durante un corso di incubazione nel tempo in terreno di coltura cellulare e successivo progesterone ELISA). Va notato che questa è una concentrazione inferiore rispetto alle iniezioni sottocutanee giornaliere sopra descritte, e ciò è dovuto alla coerenza nella consegna del progesterone dal pellet. Come accennato in precedenza, le iniezioni di olio possono fuoriuscire dal sito di iniezione, riducendo così la concentrazione complessiva erogata. In studi precedenti, questi pellet sono stati attivi in vivo solo per un massimo di 10 giorni dopo essere stati inseriti chirurgicamente. Pertanto, negli studi di gravidanza, non è chiaro se potrebbe essere necessario inserire un secondo pellet a metà gestazione o se la placenta potrebbe fornire sufficientemente supporto endocrino per la gravidanza in quella fase. Questi pellet sono, quindi, ottimali per i modelli di gravidanza a breve termine, incluso il protocollo di decidualizzazione artificiale qui presentato, nonché studi di gravidanza fino a 10 giorni dopo il trasferimento embrionale. Mentre i pellet a lento rilascio negano la necessità di manipolazione quotidiana degli animali e iniezioni, alcune iniezioni di estrogeni a basso dosaggio sono ancora necessarie per bilanciare il ciclo di feedback del recettore del progesterone. Questa strategia è stata utilizzata in precedenza20,21.

Infine, le mini pompe osmotiche sono il metodo di somministrazione ormonale più accurato e sono disponibili in commercio, ma sono l'opzione più costosa. Le mini pompe osmotiche possono fornire una concentrazione fissa di ormone al giorno per un massimo di 28 giorni, a seconda del modello selezionato. Analogamente ai pellet a lento rilascio, mentre le mini pompe osmotiche evitano la necessità di una manipolazione quotidiana degli animali, sono ancora necessarie alcune iniezioni di estrogeni a basso dosaggio.

Il protocollo di decidualizzazione artificiale qui descritto consente lo studio di una pietra miliare precoce della gravidanza indipendente dall'influenza ovarica ed embrionale. Mentre gli esseri umani subiscono decidualizzazione con ogni ciclo mestruale, i roditori decidualizzano solo durante l'instaurazione della gravidanza. Pertanto, questo modello ha un valore immenso per studiare le pietre miliari della gravidanza simile a quella umana in un modello di roditore manipolabile. La procedura qui descritta è relativamente non invasiva, in quanto utilizza un dispositivo di trasferimento embrionale non chirurgico (NSET) per fornire olio di sesamo direttamente al corno uterino attraverso la vagina e la cervice. Sebbene questa procedura sia meno invasiva di altre metodologie, può diventare piuttosto costosa quando si utilizzano NSET commerciali. In confronto, altri modelli pubblicati di decidualizzazione artificiale richiedono una procedura chirurgica per eseguire iniezioni intrauterine di olio17. Ciò richiede una configurazione chirurgica simile a quella descritta nel paragrafo 1 e nei passaggi 2.1-2.11. Tuttavia, negli animali che sono stati ovariectomizzati in precedenza, può essere più difficile identificare ed esporre il corno uterino. Ci possono anche essere aderenze formate dalla precedente procedura chirurgica per l'ovariectomia. Pertanto, mentre può essere più conveniente eseguire iniezioni intrauterine chirurgiche per indurre la decidualizzazione, il tempo chirurgico e di anestesia è sostanzialmente più lungo rispetto all'alternativa di utilizzare NSET. Esistono protocolli stabiliti per alternative fabbricate internamente22 agli NSET disponibili in commercio, che sono molto più convenienti.

Mentre la procedura di trasferimento embrionale è descritta qui, abbiamo precedentemente pubblicato questo modello e le sue percentuali di successo in diversi ceppi di topi14. Inoltre, mentre il metodo di trasferimento embrionale qui descritto utilizza un approccio chirurgico, anche i NSET potrebbero essere integrati in questa procedura.

Le direzioni future in questo settore dovrebbero includere studi incentrati sui contributi uterini specifici all'instaurazione e al mantenimento della gravidanza. Questa conoscenza è fondamentale per approfondire la nostra comprensione dell'infertilità idiopatica, del fallimento dell'impianto e delle complicanze della gravidanza. Ampliare le nostre conoscenze in queste aree è anche fondamentale per migliorare i risultati clinici per i pazienti IVF / ICSI, così come la nostra comprensione della gravidanza come processo biologico.

In conclusione, OVX è una procedura semplice che può essere integrata in modelli animali per studiare i contributi uterini alla gravidanza e alla fertilità. I modelli in futuro trarranno beneficio dall'integrazione di OVX e della somministrazione di ormoni esogeni in modo da poter effettuare confronti tra contributi specifici per ovaio e uterino specifici alla fertilità e alla gravidanza.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi finanziari o di altro tipo concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato reso possibile grazie al Victorian State Government Operational Infrastructure Support e all'Australian Government National Health and Medical Research Council (NHMRC) IRIISS. Questo lavoro è stato supportato dalla Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant to A.L.W. (Winship-PAG18-0343) per accedere alla Monash Reproductive Services Platform. A.L.W. è supportato dal finanziamento DECRA DE21010037 dell'Australian Research Council (ARC). J.N.H. e L.R.A. sono supportati da una borsa di studio del programma di formazione per la ricerca del governo australiano. L.R.A. è supportato da una borsa di studio Monash Graduate Excellence. K.J.H. è supportato da una ARC Future Fellowship FT190100265.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps BioScientific 1002 Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps BioScientific 1003D Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips BioScientific 0009971 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator BioScientific 0009974 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover BioScientific 0009976 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection Pfizer NA Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol Sigma E8875
Meloxicam Ilium NA Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips Daniels NS-000242
Multi purpose sealant Dow Corning 732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device ParaTechs 60010 Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone Sigma P0130 Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone Sigma P7556 Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment Allergan NA 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen Zoetis NA Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing Dow Corning 508-008 Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil Sigma S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0 Covidien GS-832

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References

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