Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Metoder til undersøgelse af livmoderbidrag til graviditetsetablering i en ovariektomiseret musemodel

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64763
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 1, *1, *1
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University
* These authors contributed equally

Summary

Graviditetsetablering er en dynamisk proces, der involverer kompleks embryo- og livmoderkrydstale. De præcise bidrag fra moderens livmodermiljø til disse processer forbliver et aktivt undersøgelsesområde. Her leveres detaljerede protokoller for at hjælpe med at designe in vivo dyremodeller til at løse disse forskningsspørgsmål.

Abstract

For at graviditet kan etableres, skal en levedygtig blastocyst med succes interagere med en modtagelig livmoderforing (endometrium) for at lette implantation og placenta dannelse og muliggøre igangværende graviditet. Begrænsningerne for graviditetssucces forårsaget af embryonale defekter er velkendte og er stort set blevet overvundet i de seneste årtier med stigningen i in vitro-befrugtning (IVF) og assisteret reproduktionsteknologi. Indtil videre har feltet imidlertid ikke overvundet begrænsningerne forårsaget af et utilstrækkeligt modtageligt endometrium, hvilket resulterer i stagnerende IVF-succesrater. Ovarie- og endometriefunktioner er tæt sammenflettet, da hormoner produceret af æggestokken er ansvarlige for endometriums menstruationscyklus. Som sådan, når du bruger gnavermodeller af graviditet, kan det være svært at fastslå, om et observeret resultat skyldes en ovarie eller livmoderunderskud. For at overvinde dette blev der udviklet en ovariectomized musemodel med embryooverførsel eller kunstig decidualisering for at muliggøre undersøgelse af livmoderspecifikke bidrag til graviditet. Denne artikel vil give instruktioner om, hvordan man udfører ovariektomi og give indsigt i forskellige teknikker til levering af eksogene hormoner til støtte for vellykket kunstig decidualisering eller graviditet efter embryooverførsel fra raske donorer. Disse teknikker omfatter subkutan injektion, pellets med langsom frigivelse og osmotiske minipumper. De vigtigste fordele og ulemper ved hver metode vil blive diskuteret, så forskere kan vælge det bedste undersøgelsesdesign til deres specifikke forskningsspørgsmål.

Introduction

Med den stigende brug af assisteret reproduktionsteknologi i de seneste årtier er mange barrierer for undfangelse blevet overvundet, hvilket gør det muligt for mange par at starte familier på trods af fertilitetsproblemer1. Oocyt- eller sædunderskud kan ofte omgås ved hjælp af in vitro-befrugtning eller intracytoplasmatisk sædinjektion; Imidlertid forbliver problemer relateret til livmoderen og endometriemodtagelighed en undvigende "sort boks" af reproduktionspotentiale2.

Graviditet etableres, når et embryo af høj kvalitet med succes interagerer med et modtageligt endometrium (livmoderforing). Chancerne for vellykket graviditet i en given menstruationscyklus er lave, omkring 30%3,4. Af dem, der er vellykkede, går kun 50% -60% forbi 20 ugers svangerskab, hvor implantationssvigt er ansvarlig for 75% af graviditeter, der ikke når 20 uger3. På trods af disse tal, der går tilbage til slutningen af 1990'erne, er feltet endnu ikke overvundet begrænsningerne forårsaget af et utilstrækkeligt modtageligt endometrium. Dette har resulteret i stagnerende - og undertiden faldende - IVF-succesrater i de senere år 5,6.

Kvinder med uforklarlig infertilitet har ofte et forskudt vindue af modtagelighed eller er ude af stand til at opnå modtagelighed af ukendte årsager. For nylig blev endometriemodtagelighedsarrayet udviklet, som vurderer ekspressionen af hundredvis af gener med det formål at skræddersy tidspunktet for embryooverførsel til en persons vindue af modtagelighed 7,8,9. Imidlertid mangler feltet stadig en forståelse af patogenesen af graviditetskomplikationer, der manifesterer sig efter implantationsprocessen er afsluttet.

Det kvindelige reproduktive system er meget dynamisk og under stram hormonel kontrol. Hypothalamus-hypofyse-gonadal (HPG) akse styrer frigivelsen af luteiniserende hormon og follikelstimulerende hormon, som regulerer aspekter af æggestokkens cyklus, herunder follikelmodning og østrogen- og progesteronaktivitet. Til gengæld reguleres livmoderens menstruationscyklus af østrogener og progesteron10,11. Således er undersøgelse af livmoderbiologiske mekanismer kompliceret af ovarieindflydelse. For eksempel, når man studerer, hvordan kræftbehandlinger kan påvirke livmoderen, kan det være svært at skelne, om nogen observeret livmoderfænotype (såsom graviditetstab eller menstruationsacyklicitet) er resultatet af en direkte fornærmelse mod livmoderen eller en følgevirkning fra skade på æggestokkene.

For omfattende forståelse af fertiliteten skal livmoderbidragene til graviditet karakteriseres. Det er vigtigt, at denne forståelse skal strække sig ud over livmoderfunktionen under ovariekontrol. Dette kan ikke undersøges hos mennesker; Derfor anvendes dyremodeller ofte. Som sådan er ovariektomi (OVX) almindeligt anvendt til at gøre det muligt for forskere at regulere gnaveres østruscyklusser (analogt med menstruationscyklussen) ved at levere hormoner eksogent. Derudover tillader OVX, at livmoderresponser undersøges uafhængigt af ovariepåvirkning12. Men hvis hormoner ikke straks leveres efter OVX, vil der opstå en overgangsalderfænotype, som skal overvejes nøje af forskerne.

OVX bruges ofte i gnavermodeller 13,14,15,16,17 og er relativt let at udføre efter tilstrækkelig træning. Metoderne varierer afhængigt af, om æggestokken alene eller æggestokken og ovidukten fjernes, samt afhængigt af dyrets alder (voksne, cyklende dyr har større æggestokke med et synligt corpus luteum på deres overflade, hvilket betyder, at deres æggestokke er lettere at visualisere). Tilsvarende, mange metoder til hormontilskud eksisterer, herunder subkutane injektioner14, langsom frigivelse pellets15, osmotiske mini pumper18, og ovarie podning.

I denne artikel gives detaljerede instruktioner om, hvordan man udfører ovariektomi og forbereder tre typer hormontilskud, herunder subkutane injektioner, pellets med langsom frigivelse og osmotiske minipumper. Der findes to detaljerede protokoller for eksperimentelle endepunkter, der drager fordel af OVX efterfulgt af eksogent hormontilskud (embryooverførsel og kunstig decidualisering). Denne artikel diskuterer styrker og svagheder ved hver tilgang med det formål at vejlede forskere om, hvordan man udfører undersøgelser for at isolere virkningerne på livmoderen, specifikt inden for graviditets- og fertilitetsforskningsområderne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr blev anbragt i temperaturstyrede faciliteter med høje barrierer (Monash University Animal Research Laboratory) med gratis adgang til mad og vand og en 12 timers lys-mørk cyklus. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med godkendelse fra Monash Animal Research Platform Ethics Committee (#21908, 17971) og udført i overensstemmelse med National Health and Medical Research Council Code of Practice for pleje og brug af dyr.

1. Kirurgisk forberedelse

  1. Autoklave alle kirurgiske instrumenter, gaze og papirhåndklæder, der kræves til procedurerne på en hård / tør varecyklus ved 121 ° C med en holdetid på 30 minutter og en tørretid på 30 minutter.
  2. Læg en steril bænkpude til det kirurgiske arbejdsområde og forbered smertestillende midler.
    1. Carprofen fortyndes i sterilt saltvand til 1 mg/ml, og bupivacain fortyndes i sterilt saltvand til en 0,5% (w/v) opløsning.
    2. Tilsæt 3,5 ml meloxicam til en 400 ml burvandflaske.
  3. Forvarm varmepuden (-puderne) til genopretningsburene, og opsæt varmelamper for at skinne indirekte lys på de dyr, der kommer sig.
  4. Sørg for, at alle passende personlige værnemidler bæres, herunder et hårnet, ansigtsmaske, kjole og handsker.
  5. Øv god steril teknik, herunder regelmæssigt at sprøjte handskerne med ethanol og lade dem fordampe, før du håndterer dyret eller kirurgiske værktøjer for at undgå ethanolforurening.

2. Udførelse af ovariektomi

  1. Brug en gasanæstesimaskine med isofluran til at forfylde induktionsboksen i 3-5 minutter ved 5% isofluran med strømningshastigheden indstillet til 4 l / min.
  2. Placer musen inde i induktionsboksen, og flyt den til næsekeglen, når den er bevidstløs, og reducer strømningshastigheden til 0,4 l / min med isofluranfordamperen indstillet til ~ 2,5%.
    BEMÆRK: Procentdelen af isofluran, der anvendes til resten af proceduren, varierer afhængigt af musestamme, alder og eksponering for behandlinger (f.eks. kemoterapi) og bør justeres baseret på en nøje vurdering af hvert enkelt dyrs vejrtrækningsmønstre. Åndedrætsmønstre bør forblive som regelmæssige abdominale vejrtrækninger. Hurtige, thorax vejrtrækninger kan indikere, at et dybt kirurgisk plan ikke er nået eller vedligeholdt; I dette tilfælde justeres isofluranfordamperprocenten efter behov.
  3. Påfør øjensmøremiddel generøst ved at klemme røret og forsigtigt duppe øjet.
  4. Barber et lille område (2 cm x 2 cm) ved og under rygsøjlen.
  5. 5 mg/kg carprofen administreres fra en fortyndet opløsning på 1 mg/ml subkutant ved halsen.
  6. Test dybden af anæstesi med tåklemmerefleksen ved at klemme musens bagtå. Hvis der ikke er nogen tåklemmereaktion, er dyret i det dybe kirurgiske plan, og proceduren kan fortsætte.
  7. Påfør betadin på det kirurgiske område, og dæk med et kirurgisk drapering (en gasbind med et 2 cm x 2 cm vindue skåret ud).
  8. Brug rottetandede tang til at trække huden ved ryggen opad og lav et ~ 5 mm langsgående snit.
    BEMÆRK: Et hudsnit i denne højde på dyrets ryg er bedst til kirurgisk klipplacering for at reducere risikoen for, at dyret fjerner klemmerne og kræver klipreparationer.
  9. Brug stump tang, fortsæt med at stump dissekere huden væk fra det underliggende muskellag, bevæge sig ned og til den ene side mod nyrerne.
  10. Identificer nyre-, æggestok- og ovariefedtpuden visuelt gennem muskelvæggen.
    BEMÆRK: Nyren vil fremstå som en mørkerød farve, fedtpuden vil fremstå lys hvid, og hvis den er synlig, vil æggestokken ligne en lille lyserød prik i fedtpuden.
  11. Brug tang, tag fat og løft muskellaget. Lav et ~ 0,5-1 cm snit med skarp kirurgisk saks. Fortsæt med at holde muskelvæggen med tang, og skift fra saks til stump tang for at trække æggestokkens fedtpude gennem snittet.
  12. Brug en buet nåleholder til at klemme under æggestokken og ovidukten i den distale ende af livmoderhornet.
    BEMÆRK: Alternativt kan æggestokken alene fjernes, hvilket efterlader ovidukten intakt. Imidlertid kræves et dissekeringsmikroskop for nøjagtigt at visualisere sondringen mellem æggestokken og ovidukten.
  13. Fjern æggestokken med en saks eller en skalpel. Fortsæt med at klemme i 30 s for at undgå overdreven blødning.
  14. Fjern klemmen, og dup den om nødvendigt med sterilt gasbind.
  15. For at lukke muskelvægssnittet skal du bruge tang til at løfte toppen af snittet, så snittet naturligt trækker sammen.
  16. Brug silkesuturer (størrelse 3-0) til at lukke muskelvægssnittet med en kirurgs knude.
  17. Påfør to til tre dråber bupivacain topisk med en 1 ml sprøjte uden nål påsat, og gentag trin 2.9-2.17 på den anden side.
  18. For at lukke hudsnittet skal du bruge gaze til at duppe området tørt for overskydende bupivacain og trykke de to sider af huden sammen.
  19. Påfør en til to 7 mm kirurgiske klip, hvilket giver plads til hævelse som en del af helingsprocessen.
  20. Flyt musen til et restitutionsbur, og overvåg nøje i 15 minutter.
    BEMÆRK: Dyrene skal vågne hurtigt; Sørg for at overvåge vejrtrækningen nøje for normale thorax vejrtrækningsmønstre.

3. Hormonpræparat: Subkutan injektion

  1. Lav en 1 mg/ml stamopløsning af østradiol.
    1. 0,001 g (1 mg) østradiolpulver afvejes i et 1,5 ml sterilt rør.
    2. Tilsæt 1 ml 100% ethanol til røret og hvirvel i et par sekunder.
      BEMÆRK: Ethanolen forbliver klar med synlige pletter af østradiolpulver.
    3. Pak røret ind med film for at forhindre ethanolfordampning.
    4. Pak røret ind i aluminiumsfolie, og læg det på en vipper natten over for helt at opløse østradiolpulveret.
    5. Denne 1 mg/ml bestand fortyndes i sesamolie til den ønskede slutkoncentration.
      BEMÆRK: Doser på 100 ng i 3 dage er nødvendige til priming før kunstig decidualisering, og yderligere lave doser på 25 ng er påkrævet, når progesteron gives. Dette er for at bekæmpe feedback-sløjfen, der styrer progesteronreceptorekspression. Til ægoplægning kræves to doser på 100 NG på dag 1 og dag 3 før ægoplægning på dag 4. På tidspunktet for embryooverførsel kræves også en lav dosis på 25 ng.
    6. Træk den nødvendige mængde østradiol i olie op i en 1 ml sprøjte, og sæt derefter en 26 G nålespids på.
    7. Den passende dosis injiceres subkutant (enten ved skrubben eller flanken; 100 ng/100 μl eller 25 ng/100 μl til priming før embryooplægning eller kunstig decidualisering eller på tidspunktet for embryooplægningen) med den krævede hyppighed.
      BEMÆRK: Olie er meget tyktflydende, så sørg for at injicere langsomt og pause i et par sekunder, før nålen fjernes. Dette minimerer mængden af olie, der lækker ud af injektionsstedet.
  2. Lav en 200 mg / ml stamopløsning af progesteron.
    1. 0,4 g (400 mg) progesteronpulver afvejes i et 5 ml sterilt rør.
    2. Tilsæt 2 ml 100% ethanol til røret og hvirvel i et par sekunder.
      BEMÆRK: Ethanolen bliver hvid i farven.
    3. Gentag trin 3.1.3-3.1.4.
    4. 200 mg/ml stammen fortyndes i sesamolie til den ønskede slutkoncentration.
      BEMÆRK: Doser på 2 mg dagligt er nødvendige for at understøtte embryooplægningen.
    5. Injicer den passende dosis (f.eks. 2 mg/100 μl dagligt til støtte for graviditet) subkutant som i trin 3.1.6-3.1.7.

4. Hormonpræparation: Pellets med langsom frigivelse

  1. Læg en folie over overfladen af en laminær strømning eller klasse II biosikkerhedshætte.
  2. Placer alt udstyr (handsker, petriskåle, 1 ml sprøjter, fine pincet) i emhætten, og tænd UV i 20 min.
    BEMÆRK: Tænd ikke UV med tætningsmidlet inde i emhætten, da det vil sætte sig.
  3. Vask den silastiske slange i 100% ethanol, og lad den lufttørre i emhætten. Når den er tør, skal du markere ~ 1 cm længder langs slangen og skære med en skalpel.
  4. Fjern stemplet fra en sprøjte, og klem ~200 μL fugemasse i. Sæt stemplet på igen, og tryk en lille mængde fugemasse ud af sprøjten.
  5. Påfør en lille mængde fugemasse i den ene ende af slangen, og glat den over med en behandsket finger.
  6. Lad det tørre natten over eller i 20-30 minutter i UV-lys inde i emhætten.
  7. Hæld en passende mængde progesteron i en steriliseret petriskål. Brug tang, øse pellets i progesteronpulveret for at fylde pelleten.
    1. Bank den forseglede ende af pelleten på emhættens overflade for at kondensere progesteron ned. Alternativt kan du bruge enden af steriliserede tang til at fylde progesteron ned. Giv plads nok til mere fugemasse.
  8. Den åbne ende forsegles med fugemasse som beskrevet i trin 3.4-3.5.
  9. Pak petriskålen, der indeholder progesteronpillerne, ind i folie for at beskytte den mod lys.
  10. Pellets aktiveres i mindst 72 timer før subkutan indsættelse ved inkubation i 1% trækulstrippet FCS (cs-FCS: PBS) ved 37 °C.
    BEMÆRK: Pellets kan fremstilles i bulk med en enkelt forseglet ende på forhånd. Imidlertid bør frisk progesteron bruges til at fylde dem hver gang. Sørg for, at de færdiglavede pellets UV-steriliseres inden påfyldning med progesteron. Pellets vil udskille ~ 500 μg / dag i 6-10 dage, hvilket er tilstrækkelig støtte til kunstig decidualisering og embryooverførselsprocedurer, selvom en yderligere lavdosis østrogeninjektion kan være nødvendig for at opretholde progesteronreceptoraktivitet ud over 4-5 dage. Ud over 10 dage kan en udskiftning progesteron pellet være påkrævet.

5. Hormonpræparation: Osmotiske minipumper

  1. Forbered progesteron ved den ønskede koncentration i en vandig opløsning, og vælg den passende mini osmotiske pumpemodel (se materialetabel).
    BEMÆRK: For afsnit 7 (forsøgsprocedure: embryooplægning) kræves levering af 2 mg/dag i 12 dage. Opløs derfor 28 mg progesteron i ~100 μL sterilt vand pr. dyr (følg producentens anvisninger for det specifikke volumen). Serielle fortyndinger kan være påkrævet. For afsnit 8 (eksperimentel procedure: kunstig decidualisering) kræves levering af 500 μg pr. Dag i 3 dage. Opløs derfor 1.500 μg progesteron i ~ 100 μL sterilt vand pr. Dyr. Forbered ekstra opløsning for at tage højde for det volumen, der går tabt under påfyldningsproceduren.
  2. Opsæt udstyret (handsker, fnugfattige servietter, petriskåle, sterilt saltvand, 1 ml sprøjter, små vejebåde, folie og vægte med en nøjagtighed på 0,01 g) i en klasse II biosikkerhedshætte, og tænd derefter UV'en i 20 minutter.
  3. Træk hormonopløsningen op i en 1 ml sprøjte, og fastgør derefter et sterilt påfyldningsrør, og sørg omhyggeligt for, at der ikke er luftbobler.
  4. Vej pumpen og dens flowmoderator i en steril vejebåd.
  5. Indsæt påfyldningsrøret gennem åbningen øverst på pumpen, indtil det ikke kan gå længere.
  6. Hold pumpen lodret, skub langsomt sprøjtens stempel for at fylde røret.
    BEMÆRK: Hurtig påfyldning bør undgås, da dette kan indføre luftbobler i pumpen.
  7. Når opløsningen løber over fra toppen af pumpen, skal du forsigtigt fjerne påfyldningsrøret og tørre den overskydende opløsning af med en steril lavfnugserviet.
  8. Indsæt flowmoderatoren gennem åbningen øverst på pumpen, indtil den ikke kan køre længere. Når pumpen og flowmoderatoren er kommet helt ind, skal du trykke den godt sammen.
  9. Vej den fyldte pumpe med flowmoderatoren på plads.
    BEMÆRK: Vægtforskellen opnået fra trin 5.3 og trin 5.8 giver nettovægten af den fyldte opløsning (dvs. en stigning på 0,1 g = 100 μL tilsat opløsning).
  10. Anbring den fyldte pumpe i en steril petriskål fyldt med sterilt saltvand.
  11. Når alle pumperne er fyldt, pakkes petriskålen ind i folie og anbringes i en 37 °C inkubator for at prime i mindst 4-6 timer (eller indtil den er klar til brug).

6. Kirurgisk procedure: Indsættelse af subkutane hormonpiller og minipumper

  1. Forbered området i henhold til afsnit 1 (kirurgisk forberedelse).
  2. Bedøv dyrene i henhold til trin 2.1-2.3.
  3. Barber et lille område ved halsen (~ 1 cm x 1 cm).
  4. Der indgives 5 mg/kg carprofen fra en fortyndet opløsning på 1 mg/ml subkutant i benflanken.
  5. Test for tåklemmerefleksen. Hvis der ikke er nogen refleks, er dyret i det dybe kirurgiske plan, og proceduren kan begynde.
  6. Påfør betadin på det kirurgiske område, og dæk det med et kirurgisk drapering (en gasbind med et 2 cm x 2 cm vindue skåret ud).
  7. Brug rottetandede tang til at trække huden ved halsen (halvvejs mellem den sande skrubbe og ryggen) opad og lav et ~ 5 mm langsgående snit.
  8. Brug stump tang til at dissekere huden væk fra det underliggende muskellag i nedadgående retning.
    BEMÆRK: Ved indsættelse af osmotisk minipumpe skal du oprette en lomme langs den ene side af dyret, så pumpen ikke begrænser dyrets bevægelse eller presser op mod snitstedet.
  9. Når der er gjort tilstrækkelig plads til hormonpillen eller minipumpen, skal du bruge sterile tang til at samle pillen eller minipumpen op og indsætte den i den subkutane lomme lavet med stump dissektion.
  10. For at lukke hudsnittet skal du sikre dig, at pillen eller minipumpen er langt nok i lommen til, at kirurgiske klip ikke beskadiger den.
  11. Påfør bupivacain topisk i henhold til trin 2.17.
  12. Luk såret med et kirurgisk klip. Flyt musen til et restitutionsbur, og overvåg nøje i 15 minutter. Da dette er en kort procedure, skal dyrene ambulante inden for få minutter.

7. Forsøgsprocedure: Embryooplægning

  1. For ovariektomiserede dyr, hormon-prime 3 dage før embryooplægning ved subkutan injektion af 100 ng/100 μl østradiol (trin 3.1).
  2. En dag før ægoplægningen hormonprimeres dyrene med en subkutan injektion på 2 mg/100 μL medroxyprogesteronacetat (trin 3.2).
  3. Forbered området i henhold til afsnit 1 (kirurgisk forberedelse).
  4. Bedøv dyrene i henhold til trin 2.1-2.3.
  5. Start proceduren i henhold til trin 2.4-2.10.
  6. Under et dissekerende mikroskop oprettes et intrauterin injektionspunkt med en 26 G nålespids.
  7. Pipette fem blastocyster i et M2 mediefald, og overfør dem derefter til livmoderhornet.
  8. For at lukke muskelvægssnittet skal du løfte toppen af snittet ved hjælp af tang, så snittet naturligt trækker sammen.
  9. Brug silkesuturer til at lukke muskelvægsstedet med en kirurgs knude. Påfør dråber bupivacain topisk.
  10. Gentag trin 7.5-7.8 på den anden side.
  11. For at lukke hudsnittet skal du bruge gaze til at duppe området tørt for overskydende bupivacain og trykke de to sider af huden sammen.
  12. Påfør et til to kirurgiske klip, hvilket giver plads til hævelse som en del af helingsprocessen.
    BEMÆRK: Hvis dyrene er ovariektomiseret, kræves eksogene hormoner på tidspunktet for embryooverførsel. Du kan enten injicere progesteron subkutant (2 mg) eller indsætte en subkutan progesteronpille eller osmotisk minipumpe. For at bekæmpe overskydende progesteron kræves en subkutan injektion af lavdosis (25 ng/100 μL) østrogen på tidspunktet for embryooplægningen.
  13. Bær forsigtigt musen til et restitutionsbur, og overvåg nøje i 15 minutter.
    BEMÆRK: Dyrene skal vågne hurtigt; Sørg for at overvåge vejrtrækningen nøje for normale thorax vejrtrækningsmønstre.

8. Eksperimentel procedure: Kunstig decidualisering

  1. Hormonprime dyrene med 100 ng/100 μL østradiol på dag 1, dag 2 og dag 3 i henhold til punkt 3 (hormonpræparat: subkutan injektion) 8 dage før kunstig decidualisering.
  2. Hormonprime dyrene med 5 ng/100 μL østradiol på dag 7, dag 8 og dag 9 i henhold til punkt 3 (hormonpræparat: subkutan injektion) 2 dage før kunstig decidualisering.
    BEMÆRK: Den endelige injektion skal ske mindst 3 timer (og højst 4 timer) før den kunstige decidualiseringsprocedure.
  3. Hormon-prime dyr med en subkutan progesteronpille eller mini osmotisk pumpe (500 μg / dag), jf. afsnit 4, afsnit 5 og afsnit 8, 2 dage før kunstig decidualisering.
  4. Forbered området i henhold til afsnit 1 (kirurgisk forberedelse).
  5. Bedøv dyrene i henhold til trin 2.1-2.2.
  6. Test dybden af anæstesi med tåklemmerefleksen. Hvis der ikke er nogen tåklemmereaktion, er dyret i det dybe kirurgiske plan, og proceduren kan fortsætte.
  7. Placer musen i en udsat position, løft halen og indsæt langsomt et spekulum med en diameter på 6 mm i vagina.
  8. Mens du holder dyrets næse i bedøvelseskeglen, skal du placere dyrets underkrop mellem den første og anden finger på den ikke-dominerende hånd. Brug tommelfingeren til forsigtigt at skubbe halen opad for at holde skedeåbningen synlig.
  9. Overfør 20 μL sesamolie til et livmoderhorn ved hjælp af en ikke-kirurgisk embryooverførselsspids (fastgjort til en 20 μL pipette).
    1. Hold pipetten i niveau med vaginalåbningen, indsæt spidsen i vagina og gennem livmoderhalsen ind i livmoderhornet. Når spidsen er i livmoderhornet, skal du forsigtigt trykke spidsen mod endometrieoverfladen (hvis du bruger håndteringsteknikken ovenfor, mærkes denne bevægelse mod den anden finger) og langsomt udvise olien.
      BEMÆRK: Hold pipettestemplet nede, vent i 10 sekunder for at sikre, at al olien er spredt, og fjern langsomt overførselsspidsen, mens du holder stemplet nede.
  10. Fjern spekulumet fra vagina.
  11. Bær forsigtigt musen til restitutionsburet, og overvåg nøje i 15 minutter.
    BEMÆRK: Dyrene skal vågne hurtigt. Overvåg deres vejrtrækning nøje for normale thorax vejrtrækningsmønstre.
  12. Begræns håndteringen af dyrene, og opbevar dem i rolige omgivelser i 96 timer efter proceduren.
    BEMÆRK: Høje lyde eller pludselige ændringer i deres lyse og mørke cyklus vil påvirke procedurens succes. På tidspunktet for vævsdissektion kan omfanget af decidualiseringssucces måles som et forhold mellem livmodervægt og kropsvægt. Den kunstige decidualiseringsprocedure har en succesrate på 80%. Ekskluder derfor dyr, der ikke decidualiserer, og tag højde for dette, når du vælger prøvestørrelser til forsøgene.

9. Kirurgisk procedure: Postkirurgisk genopretning, overvågning og klipreparationer

  1. Lad dyrene komme sig halvt på, halvt af varmepuder natten over, før de returneres til deres hjemmebur.
  2. Overvåg dyrene dagligt i 5 dage efter operationen, og vær meget opmærksom på sårstedet for tegn på infektion.
  3. Udfør klipreparation, hvis det er nødvendigt.
    1. Forbered området i henhold til afsnit 1 (kirurgisk forberedelse).
    2. Bedøv dyrene i henhold til trin 2.1-2.3.
    3. Fjern det eksisterende klip ved hjælp af en klipfjerner, hvis klippet stadig er til stede.
    4. Anvend et nyt kirurgisk klip i henhold til trin 2.19-2.21.
  4. Fjern de kirurgiske klip 7 dage efter operationen i henhold til trin 9.3.1-9.3.3, eller når dyret er under bedøvelse (såsom til embryooverførsel, kunstig decidualiseringsprocedure eller en subkutan injektion efter operationen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En velkarakteriseret model for kunstig decidualisering er beskrevet i dette protokolpapir (figur 1A). Her gennemgik unge voksne hunmus (8 uger gamle) kirurgisk ovariektomi som beskrevet i afsnit 1 og 2. Musene blev derefter hvilet i 2 uger for at sikre, at de endogene ovariehormoner forsvandt, før de blev understøttet med eksogene hormoner som beskrevet i afsnit 3-7 og afsnit 9. Kunstig decidualisering blev induceret ved en intravaginal injektion af sesamolie, og derefter blev dyrene hvilet indtil vævsopsamling, som beskrevet i afsnit 9. I denne undersøgelse blev kunstig decidualisering udført i C57BL6 / J-mus, en almindeligt anvendt musestamme. På tidspunktet for vævsindsamling blev kropsvægten registreret, og livmoderen blev dissekeret og godt trimmet, før den blev vejet (figur 1B). Omfanget af det deciduale respons blev registreret ved at udtrykke livmodervægten som et forhold mellem kropsvægten. I denne undersøgelse decidualiserede 80% af C57BL6 / J-musene (0,01012 ± 0,001515, n = 15), mens 20% af dyreuteri ikke decidualiserede (0,002108 ± 0,0001764, n = 3) (figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Skematiske og repræsentative resultater . (A) Skematisk tidslinje for eksperimentelt at fremkalde kunstig decidualisering i en musemodel. Forkortelser: OVX = ovariektomi; E2 = østradiol (100 ng dage 1-3, 5 ng dage 7-9); P4 = progesteron. Bemærk: En P4-pellet blev brugt til at generere de resultater, der præsenteres her. Alternative metoder til levering af progesteron omfatter daglige subkutane injektioner og mini-osmotiske pumper. (B) Repræsentative billeder af ikke-decidualiserede (ND) og decidualiserede (D) uteri fra unge voksne C57BL6/J-mus. Vægtstænger = 5 mm.(C) Sammenligning af livmodervægt med kropsvægt (UW:BW) i ikke-decidualiserede og decidualiserede dyr. Data er gennemsnitlige ± SEM; Mann-Whitney-testen, **p = 0,003; ND: n = 3, D: n = 15. Klik her for at se en større version af denne figur.

Hormon levering metode Styrker Svagheder
Subkutane injektioner Ingen kirurgisk indgreb kræves Gentagen daglig håndtering
Tilgængelig teknik, der ikke kræver kirurgisk træning (sammenlignet med pelletimplantation) Hormoner i olie kan lække ud af injektionsstedet, derfor kan mængden absorberet af hvert dyr variere
Pellets med langsom frigivelse Intet behov for daglig håndtering Kirurgisk procedure kræves
Kan laves i huset Ikke kommercielt tilgængelig
Prisbilligt alternativ til osmotiske minipumper
Lille og meget godt tolereret af dyr
Osmotiske minipumper Intet behov for daglig håndtering Kirurgisk procedure kræves
Kommercielt tilgængelig Dyr
Mest nøjagtige leveringsmetode Meget større end pellets med langsom frigivelse

Tabel 1: Styrker og svagheder ved hormonafgivelsesmetoderne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel indeholder trinvise instruktioner om, hvordan man udfører OVX og giver eksogene hormoner til undersøgelser med fokus på at forstå livmoderbidragene til graviditet og fertilitet. Der gives to detaljerede protokoller om to eksperimentelle anvendelser af disse metoder, herunder udførelse af embryooverførsel og kunstig decidualisering.

Mens udførelse af OVX kan være udfordrende i starten - især for forskere, der er nye til gnavermodeller - er det en relativt enkel procedure, når den er passende uddannet og praktiseret. De vigtigste trin i procedurerne omfatter nøje overvågning af dyrene, mens de er under anæstesi og sikre, at der ikke er noget ovarievæv tilbage. I nogle modeller kan ovidukten efterlades intakt. Det skal dog bemærkes, at ovidukten er et hormonresponsivt væv med rigelige østrogen- og progesteronreceptorer19. Den kirurgiske protokol til fjernelse af æggestokken og ovidukten er meget enklere sammenlignet med at fjerne bare æggestokken, da førstnævnte kan udfyldes med det blotte øje. For kun at fjerne æggestokken og lade ovidukten være på plads i sidstnævnte tilfælde kræves et dissekerende mikroskop, da dette er en meget mere indviklet procedure. Derfor kan driftstiden forlænges, da dyret skal flyttes mellem dissekeringsmikroskopstadiet og operationsfeltet for forskellige dele af proceduren, såsom suturering af den indre kropsvæg.

De smertestillende protokoller, der er beskrevet her, er standard og godkendt af Monash University Animal Ethics Committee, så de kan variere afhængigt af den enkelte institutions etiske komités krav eller præferencer. Det skal bemærkes, at der ikke blev tilvejebragt analgesi til den kunstige decidualiseringsprocedure, da typiske ikke-steroide antiinflammatoriske midler interfererer med decidualiseringsprocessen. Hvis forskere ønsker at give smertestillende midler på tidspunktet for kunstig decidualisering, bør dette tages i betragtning.

Dette arbejde præsenterer tre metoder til hormonafgivelse til supplering af ovariehormoner efter OVX, og hver metode har sine egne styrker og svagheder (tabel 1). Subkutane injektioner af hormoner i olie er almindelige i litteraturen14,16,17. Denne teknik har mange styrker, herunder det faktum, at der ikke kræves kirurgisk procedure, og der kræves derfor ingen formel træning i gnaverkirurgi eller gasbedøvelse. Dette gør subkutan injektion til en tilgængelig mulighed for næsten alle forskningsgrupper. Injektioner er også overkommelige og nemme at udføre. Praktisk set har de dog nogle begrænsninger, især i graviditetsmodeller. For at opretholde graviditet hos et OVX-dyr skal hormontilskud med progesteron gives dagligt for at understøtte graviditeten. Det kan være muligt at stoppe de daglige injektioner, når moderkagen er tilstrækkeligt udviklet til at overtage som den vigtigste kilde til progesteron, selvom dette ikke er blevet afprøvet i de protokoller, der præsenteres her. Anekdotisk er det muligt for hormoner i olie at lække fra injektionsstedet efter subkutan injektion. Dette kan til dels skyldes den nålestørrelse, der kræves (26 G) for let at dispensere noget så tyktflydende som sesamolie. Derfor skal denne lækage overvåges og registreres, når der udføres injektioner i olie for at korrelere dette med de eksperimentelle resultater.

Pellets med langsom frigivelse foretrækkes frem for subkutane injektioner, da de er omkostningseffektive og enkle at fremstille internt. De kræver dog flere trin natten over, hvilket bør overvejes, når du planlægger eksperimentelle tidslinjer. Disse pellets udskiller ca. 500 μg dagligt (vurderet under en tidsforløbsinkubation i cellekulturmedium og efterfølgende progesteron-ELISA). Det skal bemærkes, at dette er en lavere koncentration sammenlignet med de daglige subkutane injektioner beskrevet ovenfor, og dette skyldes konsistensen i leveringen af progesteron fra pelleten. Som nævnt ovenfor kan olieinjektioner lække ud af injektionsstedet og dermed reducere den samlede leverede koncentration. I tidligere undersøgelser har disse pellets kun været aktive in vivo i op til 10 dage efter, at de er kirurgisk indsat. I graviditetsundersøgelser er det derfor fortsat uklart, om det kan være nødvendigt at indsætte en anden pille midt i drægtigheden, eller om moderkagen i tilstrækkelig grad kan yde hormonstøtte til graviditeten på dette stadium. Disse pellets er derfor optimale til kortvarige graviditetsmodeller, herunder den kunstige decidualiseringsprotokol, der præsenteres her, samt graviditetsundersøgelser op til 10 dage efter embryooverførsel. Mens pellets med langsom frigivelse negerer behovet for daglig dyrehåndtering og injektioner, er nogle lavdosis østrogeninjektioner stadig nødvendige for at afbalancere progesteronreceptorens feedbacksløjfe. Denne strategi er tidligere blevet brugt20,21.

Endelig er osmotiske minipumper den mest nøjagtige hormonafgivelsesmetode og er kommercielt tilgængelige, men de er den dyreste løsning. Osmotiske minipumper kan levere en bestemt koncentration af hormon dagligt i op til 28 dage, afhængigt af den valgte model. I lighed med pellets med langsom frigivelse, mens osmotiske minipumper undgår behovet for daglig dyrehåndtering, er der stadig behov for nogle lavdosis østrogeninjektioner.

Den kunstige decidualiseringsprotokol, der er beskrevet her, tillader undersøgelse af en tidlig graviditetsmilepæl uafhængig af ovarie- og embryonal indflydelse. Mens mennesker gennemgår decidualisering med hver menstruationscyklus, decidualiserer gnavere kun under graviditetsetablering. Således har denne model enorm værdi for at studere menneskelignende graviditetsmilepæle i en manipulerbar gnavermodel. Proceduren beskrevet heri er relativt ikke-invasiv, da den bruger en ikke-kirurgisk embryooverførselsenhed (NSET) til at levere sesamolie direkte til livmoderhornet via vagina og livmoderhalsen. Selvom denne procedure er mindre invasiv end andre metoder, kan den blive ret dyr, når du bruger kommercielle NSET'er. Til sammenligning kræver andre offentliggjorte modeller af kunstig decidualisering en kirurgisk procedure for at udføre intrauterin injektioner af olie17. Dette kræver en kirurgisk opsætning svarende til den, der er beskrevet i afsnit 1 og trin 2.1-2.11. Men hos dyr, der tidligere er blevet ovariektomiseret, kan det være mere udfordrende at identificere og udsætte livmoderhornet. Der kan også være adhæsioner dannet fra den tidligere kirurgiske procedure for ovariektomi. Selvom det kan være mere omkostningseffektivt at udføre kirurgiske intrauterin injektioner for at fremkalde decidualisering, er operations- og anæstesitiden væsentligt længere end alternativet til at bruge NSET'er. Der findes etablerede protokoller for internt fremstillede alternativer22 til kommercielt tilgængelige NSET'er, som er langt mere omkostningseffektive.

Mens embryooplægningsproceduren er beskrevet her, har vi tidligere offentliggjort denne model og dens succesrater på tværs af forskellige stammer af mus14. Selv om den her beskrevne embryooverførselsmetode anvender en kirurgisk tilgang, kan NSET'er også integreres i denne procedure.

Fremtidige retninger på dette område bør omfatte undersøgelser med fokus på de specifikke livmoderbidrag til etablering og vedligeholdelse af graviditet. Denne viden er afgørende for at fremme vores forståelse af idiopatisk infertilitet, implantationssvigt og graviditetskomplikationer. Udvidelse af vores viden på disse områder er også grundlæggende for at forbedre kliniske resultater for IVF / ICSI-patienter samt vores forståelse af graviditet som en biologisk proces.

Afslutningsvis er OVX en simpel procedure, der kan integreres i dyremodeller for at studere livmoderens bidrag til graviditet og fertilitet. Modeller i fremtiden vil drage fordel af at integrere OVX og eksogen hormonafgivelse, så der kan foretages sammenligninger mellem ovariespecifikke og livmoderspecifikke bidrag til fertilitet og graviditet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske eller andre interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev muliggjort gennem Victorian State Government Operational Infrastructure Support og Australian Government National Health and Medical Research Council (NHMRC) IRIISS. Dette arbejde blev støttet af Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant til A.L.W. (Winship-PAG18-0343) for at få adgang til Monash Reproductive Services Platform. A.L.W. støttes af DECRA-finansiering DE21010037 fra Australian Research Council (ARC). JNH og LRA understøttes af et australsk regeringsforskningsuddannelsesprogramstipendium. LRA støttes af et Monash Graduate Excellence Scholarship. K.J.H. er støttet af et ARC Future Fellowship FT190100265.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps BioScientific 1002 Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps BioScientific 1003D Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips BioScientific 0009971 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator BioScientific 0009974 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover BioScientific 0009976 Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection Pfizer NA Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol Sigma E8875
Meloxicam Ilium NA Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips Daniels NS-000242
Multi purpose sealant Dow Corning 732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device ParaTechs 60010 Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone Sigma P0130 Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone Sigma P7556 Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment Allergan NA 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen Zoetis NA Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing Dow Corning 508-008 Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil Sigma S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0 Covidien GS-832

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
  2. Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
  3. Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
  4. Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O'Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
  5. Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
  6. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
  7. Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
  8. Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248 (2022).
  9. Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
  10. Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
  11. Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
  12. Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809 (2021).
  13. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  14. Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
  15. Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378 (2014).
  16. Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
  17. Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
  18. Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
  19. Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
  20. Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
  21. Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
  22. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).

Tags

Retraktion udgave 194 Fertilitet graviditet livmoder ovariektomi modtagelighed decidualisering
Metoder til undersøgelse af livmoderbidrag til graviditetsetablering i en ovariektomiseret musemodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griffiths, M. J., Higgins, J. N.,… More

Griffiths, M. J., Higgins, J. N., Cousins, F. L., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model. J. Vis. Exp. (194), e64763, doi:10.3791/64763 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter