Summary
Hier beschrijven we een methode voor de real-time detectie van apoplastische reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie in rijstweefsels in pathogeen-geassocieerde moleculaire patroon-getriggerde immuunrespons. Deze methode is eenvoudig, gestandaardiseerd en genereert zeer reproduceerbare resultaten onder gecontroleerde omstandigheden.
Abstract
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een vitale rol in een verscheidenheid aan biologische processen, waaronder het detecteren van abiotische en biotische spanningen. Bij pathogene infectie of uitdaging met pathogeen-geassocieerde chemicaliën (pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen [PAMPs]), wordt een reeks immuunresponsen, waaronder een ROS-burst, snel geïnduceerd in planten, die PAMP-getriggerde immuniteit (PTI) wordt genoemd. Een ROS-burst is een kenmerkende PTI-respons, die wordt gekatalyseerd door een groep plasmamembraan-gelokaliseerde NADPH-oxidasen - de RBOH-familie-eiwitten. De overgrote meerderheid van ROS bestaat uit waterstofperoxide (H 2 O2), dat gemakkelijk en gestaag kan worden gedetecteerd met een op luminol gebaseerde chemiluminescentiemethode. Chemiluminescentie is een fotonenproducerende reactie waarbij luminol, of zijn derivaat (zoals L-012), een redoxreactie met ROS ondergaat onder invloed van een katalysator. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde op L-012 gebaseerde chemiluminescentiemethode om apoplast ROS-productie in realtime te detecteren bij PAMP-elicitatie in rijstweefsels. De methode is eenvoudig, stabiel, gestandaardiseerd en zeer reproduceerbaar onder stevig gecontroleerde omstandigheden.
Introduction
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) omvatten een reeks chemisch actieve zuurstofderivaten, waaronder superoxide-anionradicalen (O2-) en zijn derivaten, hydroxylradicalen (OH-), waterstofperoxide en producten van singletzuurstof of oxidatie-reductiereacties, die voortdurend worden geproduceerd in plastiden en chloroplasten, mitochondriën, peroxisomen en andere subcellulaire locaties1 . ROS spelen een belangrijke rol in veel biologische processen en zijn essentieel voor alle planten 2,3,4. Het brede spectrum van ROS-functies varieert van de regulatie van groei en ontwikkeling tot de perceptie van abiotische en biotische spanningen 5,6,7,8.
In het immuunsysteem van de plant nemen plantencelplasmamembraan-gelokaliseerde receptoren - zogenaamde patroonherkenningsreceptoren (PRR's) - pathogeen-afgeleide chemicaliën-pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) waar. Deze herkenning veroorzaakt een reeks snelle immuunresponsen, waaronder calciuminstroom, ROS-burst en MAPK-cascade; daarom wordt deze laag van immuniteit PAMP-getriggerde immuniteit (PTI) genoemd. ROS-burst is een kenmerkende PTI-respons, waarvan de bepaling op grote schaal wordt toegepast op PTI-gerelateerde studies 9,10. ROS-productie veroorzaakt door PAMP's wordt toegeschreven aan plasmamembraan-residente NADPH-oxidase, of respiratoire burst-oxidasehomologe (RBOH) familie-eiwitten, die elektronen overbrengen van cytosolische NADPH of NADH naar extracellulaire zuurstof om superoxide (O 2-) te produceren dat spontaan wordt omgezet in waterstofperoxide (H 2 O 2) door superoxidedismutase 8 . PAMP-getriggerde ROS-burst is vrij snel, verschijnt slechts een paar minuten na PAMP-behandeling en piekt op ~ 10-12 min. De overgrote meerderheid van de ROS-moleculen bestaat uit waterstofperoxide (H 2 O2), dat gemakkelijk en gestaag kan worden gedetecteerd met een chemiluminescentietest.
Bij chemiluminescentie reageert het chemiluminescentiereagens met actieve zuurstof, onder invloed van een katalysator, om de aangeslagen toestandstussenproducten te produceren. Vervolgens keren de elektronen in het product terug naar de grondtoestand door niet-stralingsovergang en zenden fotonen uit. Veel voorkomende chemiluminescentiereagentia zijn luminol en L-012, waarbij luminol de toepassing domineert11,12,13. Meer onderzoekers kiezen echter voor L-012 om ros-productie te detecteren, omdat L-012 een veel hogere lichtemissie-efficiëntie heeft onder neutrale of bijna neutrale pH-omstandigheden in vergelijking met luminol.
Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde chemiluminescentiemethode, gebaseerd op L-012, voor de real-time detectie van ROS-productie na de elicitatie van PAMPs in rijst (Oryza sativa) weefselbladschijven en schede. De hier aangeboden methode is eenvoudig, stabiel en gestandaardiseerd en is zeer aanpasbaar om aan verschillende experimentele behoeften te voldoen. De gegevens die met deze methode worden verkregen, zijn in hoge mate reproduceerbaar onder stevig gecontroleerde omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het protocol is van toepassing op verschillende plantenweefsels. Rijstschede en bladschijven werden in dit protocol gebruikt voor ROS-detectie bij PAMP-elicitatie. Aangezien verschillen voornamelijk ontstaan als gevolg van de bemonsteringsmethode, worden hieronder alleen de gemeenschappelijke procedures beschreven, waarbij waar nodig specifieke stappen worden vermeld.
1. Plantencultuur
- Steriliseer de ontpelde rijstzaden met 70% ethanol gedurende 1 minuut, vervolgens met 40% natriumhypochloriet (NaClO) gedurende 1 uur. Spoel de zaden vervolgens 5x af met steriel water om achtergebleven chloor te verwijderen.
- Breng de zaden aseptisch op 1/2 MS medium (2,37 g/L Murashige en Skoog (MS) medium, 30 g/L sucrose, 2,1 g/L phytagel, pH 5,7, autoclaaf).
- Bij de rijstmantelmethode kunt u de zaden direct in het steriele glazen vat met MS-medium plaatsen.
- Plaats in de bladschijfmethode de zaden gedurende 5-7 dagen op MS-platen en verplant ze naar de groeimatrix of de grond (figuur 1A).
- Kweek de zaailingen in een groeiruimte met een 12 h licht/12 h donkere fotoperiode.
2. Weefselvoorbereiding en voorbehandeling
- Rijstschede
- Snijd de schede van 10 dagen oude rijstzaailingen in segmenten van 3 mm met een scherp scheermesje of chirurgisch mesje voor voorbehandeling 1 dag voor de ROS-test (figuur 1B).
- Plaats vijf mantelsegmenten in een individuele put van een 96-well microtiterplaat met 100 μL ddH 2 O gedurende10-12 uur, in het donker bij 25 °C, waardoor wondletselgerelateerde ionenlekkage en afweerreacties kunnen afnemen (figuur 2).
OPMERKING: Het verticaal houden van de sneden om een consistent snijoppervlak te garanderen dat wordt blootgesteld aan de elicitatieoplossing is een belangrijke stap om zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Beweeg de segmenten voorzichtig. Maak geen extra snijwonden of wonden op de segmenten, die een bron van gegevensvariatie kunnen zijn. In principe moet elke test ten minste vijf replicaties bevatten, omdat de variatie van de ROS-waarde groot is. Hoe meer replica's worden ingesteld, hoe betrouwbaarder de gegevens zijn.
- Bladschijf
- Snijd de bladschijven (4 mm in diameter) van 4-6 weken oude rijstplanten met behulp van een biopsiepons met een zuiger. Snijd altijd bladschijven uit het middelste derde deel van het tweede blad (genummerd vanaf de bovenkant) van de hoofdhelmstok om de gegevensvariatie te verminderen (figuur 1C).
- Plaats één bladschijf in een individuele put van een 96-well microtiterplaat met 100 μL ddH 2 O gedurende 10-12 uur voor voorbehandeling, waardoor wondgerelateerde reacties kunnen afnemen omdat deze de inductie van ROS door PAMPs kunnen verstoren (figuur 2).
OPMERKING: Bedien de bladschijven voorzichtig. Maak geen extra snijwonden of wonden op de schijven in het experiment, wat kan leiden tot gegevensvariatie. De inductie van ROS vindt meestal plaats vanuit de cellen van de snijkant, omdat de oppervlakken van rijstweefsels (bladeren of omhulsels) bedekt zijn met hydrofobe lagen. Alleen de cellen van de snijranden staan in contact met de elicitatieoplossing (zie de discussiesectie). - Houd alle bladschijven drijvend, met het abaxiale oppervlak naar boven gericht, in de putjes van een microtiterplaat voor watervoorbehandeling om bladzijde-geassocieerde variatie te voorkomen.
Figuur 1: De groeitoestand en stadia van rijstzaailingen voor schedebemonstering en delen van de rijstschede en rijstbladeren die in de test zijn gebruikt. (A) Rijstzaailingen die gedurende 10 dagen onder steriele omstandigheden op 1/2 MS-medium zijn geteeld, kunnen worden bemonsterd voor ros-bepaling. Gesteriliseerde rijstzaden werden gekweekt op 1/2 MS medium en gekweekt in een 12 uur lichte / 12 uur donkere fotoperiode in een heldere glazen injectieflacon, 8,5 cm in diameter en 15 cm in hoogte. B) Schematisch schema van de bemonsteringsdelen van bladmantels. Bladmantels werden gesneden uit 10 dagen oude rijstzaailingen. De posities van bladscheden waren boven de wortels en onder het eerste blad. (C) Schematisch schema van de bemonsteringspositie van bladschijven. De bladschijven kunnen worden gesneden uit het middelste derde deel van het tweede blad (tel vanaf de bovenkant) van de hoofdhelmstok van gezonde rijstplanten in elk groeistadium. Afkortingen: ROS = reactieve zuurstofsoorten; MS = Murashige en Skoog. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch schema van de plaatopstelling voor het meten van ROS-productie met verschillende lijnen van Oryza sativa. Voorbehandeling en test van rijstweefsels met behulp van een 96-well plaat. Lijn 1, Lijn 2 en Lijn 3 (tot acht lijnen op één plaat) kunnen elk interessant materiaal zijn, verschillende cultivars, mutanten of transgene lijnen. De weefsels werden gestimuleerd met elicitatie-oplossingen met PAMP (PAMP, wit) of zonder PAMP (ddH2O, grijs) om de ROS-respons te meten. Opgemerkt moet worden dat hoe meer monsters moeten worden getest, hoe langer het tijdsinterval tussen de metingen. Afkortingen: ROS = reactieve zuurstofsoorten; PAMP = pathogeen-geassocieerd moleculair patroon; ddH2O = dubbel gedestilleerd water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. De elicitatieoplossing voorbereiden
- Los L-012 poeder op in 20 mM (6,23 mg/ml) waterige oplossing met ddH2O om de stamoplossing te maken. Verdun vervolgens de stamoplossing met 50 mM Tris HCl-buffer (pH 7,5) om de werkoplossing te maken bij de uiteindelijke concentratie van 500 μM L-012. Houd de stamoplossing bevroren en verdun tot de werkoplossing voor gebruik.
- Bereid de elicitatieoplossing die PAMP, L-012 en mierikswortelperoxidase (HRP; 10 mg/ml in ddH2O) bevat. Meng voor een elicitatieoplossing van 10 ml 9,4 ml 50 mM Tris HCl (pH 7,5) oplossing, 400 μl L-012-oplossing, 100 μl HRP en 100 μl flg22 (PAMP; 10 mM in ddH2O). Voeg voor de negatieve controle 100 μL ddH2O toe in plaats van PAMP.
OPMERKING: Bewaar de bereide elicitatie-oplossingen bij kamertemperatuur om koude stress voor rijstweefsels te voorkomen. Andere PAMP's kunnen ook worden gebruikt voor de behandeling indien nodig, zoals chitine (20 ng / ml in de uiteindelijke concentratie). Aangezien L-012 lichtgevoelig is, bedek alle buizen met L-012-oplossing met aluminiumfolie.
4. De software starten en het protocol instellen met de microplaatlezer waarnaar wordt verwezen (zie Materiaaltabel)
OPMERKING: Het duurt enige tijd om de parameters van de microplaatlezersoftware in te stellen. Het wordt aanbevolen om de machine en het protocol gereed te maken (één klik om door te gaan) voordat u de elicitatie-oplossing toevoegt.
- Start de software. Klik op de knop Experimenten om een nieuw protocol te maken of een bestaand protocol te gebruiken.
- Klik op Procedure in het pop-upvenster om de plaat in te stellen. Selecteer de putten van de plaat die u wilt controleren.
- Klik op Start Kinetic om de totale looptijd en het leesinterval in te stellen. Stel de looptijd in op 35 minuten of langer, afhankelijk van de experimentele vereisten. Als u zo vaak mogelijk metingen wilt verkrijgen, selecteert u Minimuminterval. Kies voor de integratietijd 1 s of langer, afhankelijk van de signaalintensiteit.
OPMERKING: Het leesinterval is afhankelijk van het aantal monsters en de duur van de signaalintegratie. - Klik op Valideren | OK om de instellingen te bevestigen.
- Klik op De nieuwe plaat detecteren in de pop-up en wacht tot de software het dialoogvenster van de laadplaat vraagt. Plaats de te testen plaat op de drager.
- Stop hier om te wachten tot het elicitatiesysteem is vastgesteld (in de volgende sectie). Zodra het elicitatiesysteem klaar is, klikt u op Uitvoeren om het lezen te starten.
5. Het opzetten van het elicitatiesysteem en het meten van real-time ROS-productie
- Verwijder de ddH2O voorzichtig uit de putjes met de voorbehandelde weefsels en vermijd weefselbeschadiging of uitdroging.
- Gebruik een meerkanaalspipet om 200 μL van de elicitatieoplossing toe te voegen aan de putjes die de weefsels bevatten.
- Schud zachtjes om te mengen. Klik op Uitvoeren om de detectie te starten.
OPMERKING: Met PAMP-behandeling reageren plantenweefsels en produceren ze zeer snel ROS. Daarom wordt voorgesteld om de negatieve controle zonder PAMP eerst te behandelen om de operatietijd te verkorten, wanneer er meerdere behandelingen zijn. Werk zo snel mogelijk om de elicitatievertraging tussen behandelingen te verminderen. Hoe korter de tijd tussen de toevoeging van de elicitatieoplossing en het begin van de detectie, hoe beter de vastlegging van belangrijke experimentele gegevens zal zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier nemen we rijstmateriaal als voorbeeld om de ROS te bepalen die wordt geproduceerd met flg22-behandeling. De generatie van ROS na elicitatie is van voorbijgaande aard. In rijst werd de toename van de ROS-productie voor het eerst gedetecteerd in 1-2 minuten, piekte op 10-12 min en keerde terug naar de basislijn in ~ 30-35 min (figuur 3). In vergelijking met de controletest, waarbij PAMP afwezig was in de elicitatieoplossing die resulteerde in geen duidelijke ROS-inductie, werd een specifieke ROS-burst alleen geïnduceerd wanneer de elicitatieoplossing flg22 of andere PAMP, zoals chitine, bevatte. Ondertussen kan de totale hoeveelheid ROS worden berekend uit de curve (figuur 4).
Figuur 3: ROS-inductie in rijstweefsels. (A) Bladschijven (4 mm in diameter) en (B) 3 mm lange mantels werden gebruikt om ROS te induceren door flg22. ROS-generatie wordt gedurende 35 minuten bewaakt. Balken geven het sd-middel aan, berekend op basis van vijf technische herhalingen. De leesgegevens werden geïmporteerd in een spreadsheet. Pas de formules "GEMIDDELDE" en "STDEV" toe. P" naar de gegevensset om respectievelijk de gemiddelde waarde en de standaardfout te berekenen op basis van de replicaties voor elk gegevenspunt. Vervolgens werden de curven gegenereerd op basis van de ROS-waarden (gemiddelde waarde en standaardfout). Afkortingen: ROS = reactieve zuurstofsoorten; flg22 = 22-aminozuur flagellinepeptide; ddH2O = dubbel gedestilleerd water; RLU = relatieve luminescentie-eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De totale hoeveelheid ROS die met de mantel wordt gegenereerd. De totale hoeveelheid ROS wordt meestal berekend op basis van de curve die uit de test wordt verkregen. De hier weergegeven totale ROS-bedragen zijn berekend op basis van de curve die overeenkomt met figuur 3A. Om het totale aantal ROS-waarden te verkrijgen, past u de formule "= (y̅ n + n + 
1) × tijdsinterval/2" toe op de overeenkomstige gegevenssets om de ROS te berekenen die bij elk tijdsinterval wordt gegenereerd, die kan worden gecombineerd door de formule "SOM" toe te passen om het totale gegenereerde bedrag te berekenen. Afkortingen: ROS = reactieve zuurstofsoorten; flg22 = 22-aminozuur flagellinepeptide; ddH2O = dubbel gedestilleerd water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: ROS-productie in de blootgestelde cellen van de snijkant. Een enkele geheel of twee helften van een bladschijf werden in de putjes van een 96-well microtiterplaat geplaatst, voorbehandeld met 100 μL ddH2O gedurende 10-12 uur, en vervolgens behandeld met flg22 voor ROS-inductie. De afleeswaarden van de twee halve schijfmonsters zijn veel hoger dan die van de hele bladschijf (A). Gemiddeld zijn de totale waarden van de twee halve schijfmonsters ~ 1,6 keer die van de hele bladschijf (B), wat evenredig is met de randlengte, niet met het gebied, van de monsters. Dit resultaat ondersteunt dat ROS voornamelijk worden gegenereerd in cellen op de wondplaats. Afkortingen: ROS = reactieve zuurstofsoorten; flg22 = 22-aminozuur flagellinepeptide; ddH2O = dubbel gedestilleerd water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van deze studie was om een zeer efficiënte methode vast te stellen om de vroege ROS-productie te kwantificeren als reactie op PAMP in rijstweefsels. Deze methode biedt een gestandaardiseerde procedure voor de real-time bepaling van apoplast ROS geproduceerd uit behandelde rijstweefsels. Deze methode is eenvoudig in gebruik, laag in kosten, duidelijk van samenstelling en onafhankelijk van commerciële kits. Met behulp van deze methode kunnen onderzoekers de real-time productie van apoplast ROS bestuderen wanneer planten worden blootgesteld aan biotische of abiotische stress.
In dit protocol werd L-012 gekozen als chemiluminescentiereagens omdat het een niet-toxische chemische stof is. Luminol wordt veel gebruikt in chemiluminescentietests om ros-productie te detecteren. Er zijn echter drie nadelen aan luminol, waardoor het ongeschikt is voor ROS-detectie in rijst en andere plantenweefsels: slechte oplosbaarheid in water, korte reactieduur en harde reactie-pH. Luminol produceert alleen licht onder alkalische omstandigheden, met een optimale pH van 9,5, wat te hard is voor plantencellen en ongewenste reacties veroorzaakt. Bovendien bezit luminol een veel lagere lichtemissie-efficiëntie dan die van L-012, dat de hoogste luminescerende gevoeligheid bezit onder fysiologische omstandigheden, bij neutrale of bijna neutrale pH. L-012 wordt dus steeds vaker gebruikt in levend weefsel of celsystemen om ros-productie te detecteren.
ROS-productie in PTI-respons wordt beïnvloed door vele interne of externe factoren. De variatie in ROS-inductie in PTI-respons is dus groot. Om variaties zoveel mogelijk te elimineren, neemt dit protocol maatregelen om de testomstandigheden stevig te beheersen. Eerst werd een 50 mM Tris-HCl buffersysteem toegepast op de elicitatieoplossing in het protocol. Hoewel sommige onderzoekers niet-gebufferde systemen gebruiken om de ROS-productie te testen, ontdekten we dat een buffersysteem betere prestaties heeft met betrekking tot gegevensconsistentie en reproduceerbaarheid en een betere basislijn in de controlegroep. Ten tweede raden de auteurs sterk aan om zo consistent mogelijk monsters te nemen.
De inconsistentie tussen weefsels is een belangrijke bron van gegevensvariatie. Dit protocol beveelt aan om weefsels te kiezen van dezelfde positie van hetzelfde blad (nummer) of omhulsel van gezonde planten onder dezelfde kweekomstandigheden. We snijden altijd bladschijven uit het middelste derde deel van het tweede blad (genummerd vanaf de bovenkant) van de hoofdhelmstok en behouden consistentie tussen verschillende experimentele groepen of verschillende genotypen. Wanneer de mantel als testweefsel wordt gebruikt, moet de snede van de schede tijdens het bemonsteringsproces verticaal worden gehouden. Als de snede schuin is, kan het resulterende wondgebied niet consistent worden gehouden, wat zal leiden tot onstabiele experimentele resultaten. Ten derde moeten de weefsels voorzichtig worden bediend en op dezelfde manier worden voorbehandeld. Wonden of verwondingen op de testweefsels moeten worden vermeden, omdat verwonding meer cellen zal blootstellen aan de elicitatieoplossing, wat ongetwijfeld zal resulteren in gegevensvariatie. Zoals te zien is in figuur 5, wordt de elicitatie van ROS voornamelijk toegeschreven aan blootgestelde cellen. Bovendien zal de waarde van de ROS-productie drastisch worden verminderd wanneer er vlak voor de meting nieuwe schade optreedt.
Een andere belangrijke factor om te overwegen bij het detecteren van de real-time productie van ROS door plantenweefsels is het effect van de circadiane klok. We merkten verschillen in de leeswaarden op verschillende momenten van de dag. Het is bewezen dat de circadiane klok de productie en respons van ROS kan beïnvloeden, evenals de transcriptionele regulatie van ROS-gerelateerde genen. Het niveau van ROS fluctueert gedurende de dag en bereikt een piek op de middag en duikt om middernacht14. Kortom, deze high-throughput-procedure maakt de gelijktijdige detectie van meerdere monsters mogelijk, wat kan helpen het effect van de circadiane klok op de ROS-productie te voorkomen. Om reproduceerbare resultaten te bereiken, raden we aan om biologische replicaties op hetzelfde moment van de dag uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van Shanghai Natural Science Foundation (Grant Number: 21ZR1429300/BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Agri-X program, Grant Number:AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (Grant Number: ZXWH2150201/001) aan Jiangbo Fan, en door het Medical-Engineering Collaboration Project van Shanghai Jiao Tong Univesity (subsidienummer: 21X010301734) aan Can Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
References
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R.
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).
