Summary
Her beskriver vi en metode til realtidspåvisning af apoplastiske reaktive iltarter (ROS) produktion i risvæv i patogenassocieret molekylært mønsterudløst immunrespons. Denne metode er enkel, standardiseret og genererer meget reproducerbare resultater under kontrollerede forhold.
Abstract
Reaktive iltarter (ROS) spiller afgørende roller i en række biologiske processer, herunder sensing af abiotiske og biotiske belastninger. Ved patogeninfektion eller udfordring med patogenassocierede kemikalier (patogenassocierede molekylære mønstre [PAMP'er]) induceres en række immunresponser, herunder en ROS-burst, hurtigt i planter, der kaldes PAMP-udløst immunitet (PTI). Et ROS-udbrud er et kendetegnende PTI-respons, som katalyseres af en gruppe plasmamembranlokaliserede NADPH-oxidaser - RBOH-familiens proteiner. Langt størstedelen af ROS består af hydrogenperoxid (H2O2), som let og støt kan detekteres ved hjælp af en luminolbaseret kemiluminescensmetode. Kemiluminescens er en fotonproducerende reaktion, hvor luminol eller dets derivat (såsom L-012) gennemgår en redoxreaktion med ROS under virkningen af en katalysator. Dette papir beskriver en optimeret L-012-baseret kemiluminescensmetode til påvisning af apoplast ROS-produktion i realtid ved PAMP-udløsning i risvæv. Metoden er let, stabil, standardiseret og meget reproducerbar under stærkt kontrollerede forhold.
Introduction
Reaktive oxygenarter (ROS) omfatter en række kemisk aktive oxygenderivater, herunder superoxidanionradikaler (O2-) og dets derivater, hydroxylradikaler (OH-), hydrogenperoxid og produkter af singlet oxygen eller oxidationsreduktionsreaktioner, som konstant produceres i plastider og kloroplaster, mitokondrier, peroxisomer og andre subcellulære steder1 . ROS spiller vigtige roller i mange biologiske processer og er afgørende for alle planter 2,3,4. Det brede spektrum af ROS-funktioner varierer fra regulering af vækst og udvikling til opfattelsen af abiotiske og biotiske belastninger 5,6,7,8.
I plantens immunsystem opfatter plantecelleplasmamembranlokaliserede receptorer - såkaldte mønstergenkendelsesreceptorer (PRR'er) patogenafledte kemikalier-patogenassocierede molekylære mønstre (PAMP'er). Denne anerkendelse udløser en række hurtige immunresponser, herunder calciumtilstrømning, ROS-burst og MAPK-kaskade; således kaldes dette lag af immunitet PAMP-udløst immunitet (PTI). ROS-burst er et kendetegnende PTI-respons, hvis bestemmelse anvendes bredt til PTI-relaterede undersøgelser 9,10. ROS-produktion udløst af PAMP'er tilskrives plasmamembranresident NADPH-oxidase eller respiratorisk burstoxidasehomolog (RBOH) familieproteiner, som overfører elektroner fra cytosolisk NADPH eller NADH til ekstracellulært ilt for at producere superoxid (O2-), som spontant omdannes til hydrogenperoxid (H2O2) ved superoxiddismutase8 . PAMP-udløst ROS-udbrud er ret hurtigt, vises kun få minutter efter PAMP-behandling og topper ved ~ 10-12 minutter. Langt størstedelen af ROS-molekylerne omfatter hydrogenperoxid (H2O2), som let og støt kan detekteres med et kemiluminescensassay.
I kemiluminescens reagerer kemiluminescensreagenset med aktivt ilt under påvirkning af en katalysator for at producere de exciterede tilstandsmellemprodukter. Derefter vender elektronerne i produktet tilbage til jordtilstanden gennem ikke-strålingsovergang og udsender fotoner. Almindelige kemiluminescensreagensmidler inkluderer luminol og L-012, hvor luminol dominerer applikationen11,12,13. Imidlertid vælger flere forskere L-012 til at detektere ROS-produktion, da L-012 har en meget højere lysemissionseffektivitet under neutrale eller næsten neutrale pH-forhold sammenlignet med luminol.
Dette papir beskriver en optimeret kemiluminescensmetode, baseret på L-012, til realtidsdetektion af ROS-produktion efter udløsning af PAMP'er i risvæv-bladskiver og kappe (Oryza sativa). Metoden, der leveres her, er enkel, stabil og standardiseret og er meget tilpasningsdygtig til at imødekomme forskellige eksperimentelle behov. De data, der opnås med denne metode, er meget reproducerbare under fast kontrollerede forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Protokollen gælder for forskellige plantevæv. Riskedese og bladskiver blev anvendt i denne protokol til ROS-detektion ved PAMP-udløsning. Da der hovedsagelig opstår forskelle på grund af prøveudtagningsmetoden, er det kun de fælles procedurer, der beskrives nedenfor, og specifikke trin nævnes, hvor det er nødvendigt.
1. Plantekultur
- Steriliser de afskallede risfrø med 70% ethanol i 1 min, derefter med 40% natriumhypochlorit (NaClO) i 1 time. Skyl derefter frøene 5x med sterilt vand for at fjerne resterende klor.
- Frøene anbringes aseptisk på 1/2 MS-substrat (2,37 g/l Murashige og Skoog (MS) medium, 30 g/l saccharose, 2,1 g/l phytagel, pH 5,7, autoklaveret).
- I riskappemetoden plades frøene direkte i den sterile glasbeholder med MS-medium.
- I bladskivemetoden plades frøene på MS-plader i 5-7 dage og transplanteres til vækstmatrix eller jord (figur 1A).
- Dyrk frøplanterne i et vækstrum med en 12 timers lys / 12 timers mørk fotoperiode.
2. Vævsforberedelse og forbehandling
- Ris kappe
- Skær kappen fra 10 dage gamle risplanter i 3 mm segmenter med et skarpt barberblad eller kirurgisk blad til forbehandling 1 dag før ROS-analysen (figur 1B).
- Der anbringes fem kappesegmenter i en individuel brønd med en mikrotiterplade med 96 huller, der indeholder 100 μL ddH 2 O, i 10-12 timer i mørke ved 25 °C, hvilket gør det muligt for sårskaderelateret ionlækage og forsvarsrespons at aftage (figur 2).
BEMÆRK: At sørge for at holde snittene lodrette for at sikre et ensartet skærefladeareal, der udsættes for udløsningsopløsningen, er et vigtigt skridt for at opnå meget reproducerbare resultater. Flyt segmenterne forsigtigt. Foretag ikke ekstra snit eller sår på segmenterne, som kan være en kilde til datavariation. Som et princip skal hver test indeholde mindst fem replikater, da variationen af ROS-værdien er stor. Jo flere replikatorer der indstilles, jo mere pålidelige er dataene.
- Bladskive
- Skær bladskiverne (4 mm i diameter) fra 4-6 uger gamle risplanter ved hjælp af en biopsistans med et stempel. Skær altid bladskiver fra den midterste tredjedel af det andet blad (nummereret fra toppen) af hovedstyrestangen for at reducere datavariationen (figur 1C).
- En bladskive anbringes i et enkelt hul på en mikrotiterplade med 96 huller, der indeholder 100 μL ddH 2 O, i 10-12 timer til forbehandling, hvilket gør det muligt at mindske sårrelaterede reaktioner, da disse kan interferere med PAMP'ers induktion af ROS (figur 2).
BEMÆRK: Betjen bladskiverne forsigtigt. Foretag ikke ekstra snit eller sår på diskene i eksperimentet, da det kan resultere i datavariation. Induktionen af ROS forekommer for det meste fra cellerne i skærekanten, da overfladerne af risvæv (blade eller kapper) er dækket af hydrofobe lag. Kun cellerne i de afskårne kanter er i kontakt med udløsningsløsningen (se diskussionsafsnittet). - Hold alle bladskiverne flydende med den abaxiale overflade opad i brøndene på en mikrotiterplade til vandforbehandling for at undgå variation i bladsiden.
Figur 1: Væksttilstand og stadier af risplanter til prøveudtagning af skeder og dele af risskeden og risblade, der anvendes i analysen. A) Der kan udtages prøver af risplanter, der dyrkes på substrat 1/2 MS under sterile betingelser i 10 dage, til ROS-analyse. Steriliserede risfrø blev dyrket på 1/2 MS medium og dyrket i en 12 timers lys / 12 h mørk fotoperiode i klart glas hætteglas, 8,5 cm i diameter og 15 cm i højden. B) Skematisk diagram over prøveudtagningsdelene af bladskeder. Bladskeder blev skåret fra 10 dage gamle risplanter. Bladskedens positioner var over rødderne og under det første blad. C) Skematisk diagram over bladskivernes prøveudtagningssted. Bladskiverne kan skæres fra den midterste tredjedel af det andet blad (tæller fra toppen) af hovedskovlen af sunde risplanter på ethvert vækststadium. Forkortelser: ROS = reaktive iltarter; MS = Murashige og Skoog. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk diagram over pladeopsætningen til måling af ROS-produktion med forskellige linjer Oryza sativa. Forbehandling og test af risvæv ved hjælp af en 96-brøndplade. Linje 1, linje 2 og linje 3 (op til otte linjer på en plade) kan være ethvert materiale af interesse, forskellige sorter, mutanter eller transgene linjer. Vævene blev stimuleret med udløsningsopløsninger med PAMP (PAMP, hvid) eller uden PAMP (ddH2O, grå) til måling af ROS-respons. Det skal bemærkes, at jo flere prøver, der skal testes, jo længere er tidsintervallet mellem aflæsningerne. Forkortelser: ROS = reaktive iltarter; PAMP = patogen-associeret molekylært mønster; ddH2O = dobbeltdestilleret vand. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Forberedelse af udløsningsløsningen
- L-012 pulver opløses i 20 mM (6,23 mg/ml) vandig opløsning med ddH2O for at fremstille stamopløsningen. Derefter fortyndes stamopløsningen med 50 mM Tris HCl-buffer (pH 7,5) for at fremstille arbejdsløsningen ved den endelige koncentration på 500 μM L-012. Hold stamopløsningen frossen og fortynd til arbejdsløsningen før brug.
- Forbered udløsningsopløsningen indeholdende PAMP, L-012 og peberrodsperoxidase (HRP; 10 mg/ml i ddH2O). For en 10 ml udløsningsopløsning blandes 9,4 ml 50 ml Tris HCl (pH 7,5) opløsning, 400 μL L-012-opløsningen, 100 μL HRP og 100 μL flg22 (PAMP; 10 mM i ddH2O). Til den negative kontrol tilsættes 100 μL ddH2O i stedet for PAMP.
BEMÆRK: Opbevar de tilberedte udløsningsopløsninger ved stuetemperatur for at undgå kold stress på risvæv. Andre PAMP'er kan også anvendes til behandling efter behov, såsom chitin (20 ng / ml i slutkoncentration). Da L-012 er lysfølsom, skal du dække alle rør, der indeholder L-012-opløsning med aluminiumsfolie.
4. Start af softwaren og opsætning af protokollen med den refererede mikropladelæser (se materialetabellen)
BEMÆRK: Det tager lidt tid at konfigurere parametrene for mikropladelæsersoftwaren. Det anbefales at gøre maskinen og protokollen klar (et klik for at fortsætte), før du tilføjer udløsningsløsningen.
- Start softwaren. Klik på knappen Eksperimenter for at oprette en ny protokol eller bruge en eksisterende protokol.
- Klik på Procedure i pop op-vinduet for at konfigurere pladen. Vælg de brønde fra pladen, der skal overvåges.
- Klik på Start Kinetic for at indstille den samlede kørselstid og læseintervallet. Indstil kørselstiden til 35 minutter eller længere, afhængigt af de eksperimentelle krav. For at få aflæsninger så ofte som muligt skal du vælge Minimumsinterval. For integrationstid skal du vælge 1 s eller længere, afhængigt af signalintensiteten.
BEMÆRK: Aflæsningsintervallet afhænger af antallet af prøver og signalintegrationsvarigheden. - Klik på Godkend | OK for at bekræfte indstillingerne.
- Klik på Find den nye plade i pop op-vinduet, og vent på, at softwaren beder dialogboksen Indlæs plade. Anbring den plade, der skal afprøves, på holderen.
- Stop her for at vente på, at licitationssystemet etableres (i næste afsnit). Så snart licitationssystemet er klar, skal du klikke på Kør for at starte læsningen.
5. Etablering af licitationssystemet og måling af ROS-produktion i realtid
- ddH2O fjernes forsigtigt fra hullerne med det forbehandlede væv, idet vævsbeskadigelse eller udtørring undgås.
- Brug en multikanalpipette til at tilsætte 200 μL af udløsningsopløsningen til hullerne indeholdende vævene.
- Ryst forsigtigt for at blande. Klik på Kør for at starte registreringen.
BEMÆRK: Med PAMP-behandling reagerer plantevæv og producerer ROS meget hurtigt. Derfor foreslås det, at den negative kontrol uden PAMP behandles først for at reducere operationstiden, når der er flere behandlinger. Betjen så hurtigt som muligt for at reducere udløsningsforsinkelsen mellem behandlingerne. Jo kortere tid der går mellem tilsætningen af udløsningsløsningen og påvisningens start, desto bedre bliver indfangningen af vigtige eksperimentelle data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her tager vi rismateriale som et eksempel for at bestemme ROS produceret med flg22-behandling. Genereringen af ROS efter udløsning er forbigående. I ris blev stigningen i ROS-produktionen først detekteret på 1-2 min, toppede ved 10-12 minutter og vendte tilbage til basislinjen i ~ 30-35 min (figur 3). Sammenlignet med kontroltesten, hvor PAMP var fraværende i udløsningsopløsningen, hvilket ikke resulterede i nogen åbenlys ROS-induktion, blev der kun induceret en specifik ROS-burst, når udløsningsopløsningen indeholdende flg22 eller anden PAMP, såsom chitin. I mellemtiden kan den samlede mængde ROS beregnes ud fra kurven (figur 4).
Figur 3: ROS-induktion i risvæv. (A) Bladskiver (4 mm i diameter) og (B) 3 mm lange skeder blev brugt til at inducere ROS ved flg22. ROS-generering overvåges i 35 min. Søjler angiver SD-midlerne beregnet ud fra fem tekniske gentagelser. Læsedataene blev importeret til et regneark. Anvend formlerne "AVERAGE" og "STDEV. P" til datasættet for at beregne henholdsvis gennemsnitsværdien og standardfejlen fra replikaterne for hvert datapunkt. Derefter blev kurverne genereret ud fra ROS-værdierne (gennemsnitsværdi og standardfejl). Forkortelser: ROS = reaktive iltarter; FLG22 = 22-aminosyre flagellin peptid; ddH2O = dobbeltdestilleret vand RLU = relative luminescensenheder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Den samlede mængde ROS, der genereres med kappen. Den samlede mængde ROS beregnes normalt ud fra kurven opnået fra testen. De samlede ROS-beløb, der er vist her, er beregnet ud fra kurven svarende til figur 3A. For at opnå den samlede mængde ROS-værdier skal du anvende formlen "= (y̅ n + 
n + 1) × tidsinterval/2" på de tilsvarende datasæt for at beregne den ROS, der genereres ved hvert tidsinterval, som kan kombineres ved at anvende formlen "SUM" til at beregne det samlede genererede beløb. Forkortelser: ROS = reaktive iltarter; FLG22 = 22-aminosyre flagellin peptid; ddH2O = dobbeltdestilleret vand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: ROS-produktion i de eksponerede celler i skærkanten. En enkelt hel eller to halvdele af en bladskive blev anbragt i brøndene på en 96-brønds mikrotiterplade, forbehandlet med 100 μL ddH2O i 10-12 timer og derefter behandlet med flg22 til ROS-induktion. Aflæsningsværdierne fra de to halvskiveprøver er meget højere end for hele bladskiven (A). I gennemsnit er de samlede værdier fra de to halvskiveprøver ~1,6 gange værdierne fra hele bladskiven (B), hvilket er proportionalt med kantlængden, ikke med arealet, af prøverne. Dette resultat understøtter, at ROS hovedsageligt genereres i celler på sårstedet. Forkortelser: ROS = reaktive iltarter; FLG22 = 22-aminosyre flagellin peptid; ddH2O = dobbeltdestilleret vand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne undersøgelse var at etablere en yderst effektiv metode til at kvantificere tidlig ROS-produktion som reaktion på PAMP i risvæv. Denne metode giver en standardiseret procedure til realtidsbestemmelse af apoplast ROS fremstillet af behandlet risvæv. Denne metode er enkel i drift, lav i omkostninger, klar i sammensætning og uafhængig af kommercielle sæt. Ved hjælp af denne metode kan forskere studere realtidsproduktionen af apoplast ROS, når planter udsættes for biotiske eller abiotiske belastninger.
I denne protokol blev L-012 valgt som kemiluminescensreagenset, da det er et ikke-toksisk kemikalie. Luminol anvendes i vid udstrækning i kemiluminescensassays til påvisning af ROS-produktion. Der er dog tre ulemper ved luminol, som gør det uegnet til ROS-detektion i ris og andet plantevæv: dårlig vandopløselighed, kort responsvarighed og hård reaktions-pH. Luminol producerer kun lys under alkaliske forhold med en optimal pH ved 9,5, hvilket er for hårdt til at plante celler og fremkalder uønskede reaktioner. Derudover har luminol en meget lavere lysemissionseffektivitet end L-012, som har den højeste selvlysende følsomhed under fysiologiske forhold ved neutral eller nær neutral pH. Således anvendes L-012 i stigende grad i levende væv eller cellesystemer til at detektere ROS-produktion.
ROS-produktion i PTI-respons påvirkes af mange interne eller eksterne faktorer. Således er variationen i ROS-induktion i PTI-respons stor. For at eliminere variationer så meget som muligt træffer denne protokol foranstaltninger til fast kontrol af testbetingelserne. Først blev et 50 mM Tris-HCl buffersystem anvendt på udløsningsløsningen i protokollen. Selvom nogle forskere bruger ubufferede systemer til at teste ROS-produktion, fandt vi, at et buffersystem har en bedre ydeevne med hensyn til datakonsistens og reproducerbarhed og en bedre baseline i kontrolgruppen. For det andet foreslår forfatterne kraftigt at tage prøver så konsekvent som muligt.
Inkonsekvensen mellem væv er en væsentlig kilde til datavariation. Denne protokol anbefaler at vælge væv fra samme position af samme blad (antal) eller kappe af sunde planter under de samme dyrkningsbetingelser. Vi skærer altid bladskiver fra den midterste tredjedel af det andet blad (nummereret fra toppen) af hovedskovlen og opretholder konsistens mellem forskellige eksperimentelle grupper eller forskellige genotyper. Når kappen anvendes som testvæv, skal udskæringen af kappen holdes lodret under prøveudtagningsprocessen. Hvis snittet er skråt, kan det resulterende sårområde ikke holdes konsistent, hvilket vil føre til ustabile eksperimentelle resultater. For det tredje skal vævene betjenes forsigtigt og forbehandles på samme måde. Sår eller skader på testvævene bør undgås, da sår vil udsætte flere celler for udløsningsopløsningen, hvilket utvivlsomt vil resultere i datavariation. Som vist i figur 5 tilskrives udløsningen af ROS hovedsageligt eksponerede celler. Derudover reduceres værdien af ROS-produktionen dramatisk, når der sker nye skader lige før aflæsningen.
En anden vigtig faktor, der skal overvejes, når man detekterer realtidsproduktionen af ROS af plantevæv, er effekten af døgnrytmen. Vi bemærkede forskelle i læseværdierne på forskellige tidspunkter af dagen. Det er bevist, at døgnrytmen kan påvirke produktionen og responsen af ROS samt transkriptionel regulering af ROS-relaterede gener. Niveauet af ROS svinger hele dagen, når et højdepunkt ved middagstid og dypper ved midnat14. Sammenfattende tillader denne high-throughput procedure samtidig påvisning af flere prøver, hvilket kan hjælpe med at undgå effekten af døgnrytmen på ROS-produktion. For at opnå reproducerbare resultater anbefaler vi at udføre biologiske replikater på samme tidspunkt af dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Shanghai Natural Science Foundation (bevillingsnummer: 21ZR1429300 / BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Agri-X-program, bevillingsnummer: AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (tilskudsnummer: ZXWH2150201 / 001) til Jiangbo Fan og af Medical-Engineering Collaboration Project of Shanghai Jiao Tong Univesity (bevillingsnummer: 21X010301734) til Can Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
References
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R.
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).
