Summary
Her beskriver vi en metode for sanntidsdeteksjon av apoplastisk reaktiv oksygenart (ROS) produksjon i risvev i patogenassosiert molekylær mønsterutløst immunrespons. Denne metoden er enkel, standardisert og genererer svært reproduserbare resultater under kontrollerte forhold.
Abstract
Reaktive oksygenarter (ROS) spiller viktige roller i en rekke biologiske prosesser, inkludert sensing av abiotiske og biotiske påkjenninger. Ved patogeninfeksjon eller utfordring med patogenassosierte kjemikalier (patogenassosierte molekylære mønstre [PAMPs]), induseres en rekke immunresponser, inkludert et ROS-utbrudd, raskt i planter, som kalles PAMP-utløst immunitet (PTI). Et ROS-utbrudd er en kjennetegnet PTI-respons, som katalyseres av en gruppe plasmamembranlokaliserte NADPH-oksidaser - RBOH-familieproteinene. Det store flertallet av ROS består av hydrogenperoksid (H 2 O2), som enkelt og jevnt kan detekteres ved en luminolbasert kjemiluminescensmetode. Kjemiluminescens er en fotonproduserende reaksjon hvor luminol, eller dets derivat (slik som L-012), gjennomgår en redoksreaksjon med ROS under virkningen av en katalysator. Denne artikkelen beskriver en optimalisert L-012-basert kjemiluminescensmetode for å oppdage apoplast ROS-produksjon i sanntid ved PAMP-fremkalling i risvev. Metoden er enkel, stødig, standardisert og svært reproduserbar under godt kontrollerte forhold.
Introduction
Reaktive oksygenarter (ROS) omfatter en serie kjemisk aktive oksygenderivater, inkludert superoksidanionradikaler (O2-) og dets derivater, hydroksylradikaler (OH-), hydrogenperoksid og produkter av singlet oksygen eller oksidasjonsreduksjonsreaksjoner, som kontinuerlig produseres i plastider og kloroplaster, mitokondrier, peroksisomer og andre subcellulære steder1 . ROS spiller viktige roller i mange biologiske prosesser og er avgjørende for alle planter 2,3,4. Det brede spekteret av ROS-funksjoner varierer fra regulering av vekst og utvikling til oppfatningen av abiotiske og biotiske påkjenninger 5,6,7,8.
I planteimmunsystemet oppfatter plantecelleplasmamembranlokaliserte reseptorer - såkalte mønstergjenkjenningsreseptorer (PRR) - patogenavledede kjemikalier-patogenassosierte molekylære mønstre (PAMP). Denne anerkjennelsen utløser en rekke raske immunresponser, inkludert kalsiumtilstrømning, ROS-burst og MAPK-kaskade; Dermed kalles dette immunitetslaget PAMP-utløst immunitet (PTI). ROS-utbrudd er en kjennetegnende PTI-respons, hvis bestemmelse er mye brukt på PTI-relaterte studier 9,10. ROS-produksjon utløst av PAMPs tilskrives plasmamembranresident NADPH-oksidase, eller respiratorisk burst oxidase homolog (RBOH) familieproteiner, som overfører elektroner fra cytosolisk NADPH eller NADH til ekstracellulært oksygen for å produsere superoksid (O 2-) som spontant omdannes til hydrogenperoksid (H 2 O 2) av superoksiddismutase 8 . PAMP-utløst ROS-utbrudd er ganske rask, og vises bare noen få minutter etter PAMP-behandling og topper seg på ~ 10-12 min. De aller fleste ROS-molekylene består av hydrogenperoksid (H2O2), som enkelt og jevnt kan detekteres med en kjemiluminescensanalyse.
Ved kjemiluminescens reagerer kjemiluminescensreagenset med aktivt oksygen, under virkningen av en katalysator, for å produsere mellomprodukter i eksitert tilstand. Deretter går elektronene i produktet tilbake til grunntilstanden gjennom ikke-strålingsovergang og avgir fotoner. Vanlige kjemiluminescensreagensreagenser inkluderer luminol og L-012, med luminol som dominerer applikasjonen11,12,13. Imidlertid velger flere forskere L-012 for å oppdage ROS-produksjon, siden L-012 har en mye høyere lysutslippseffektivitet under nøytrale eller nær nøytrale pH-forhold sammenlignet med luminol.
Denne artikkelen beskriver en optimalisert kjemiluminescensmetode, basert på L-012, for sanntidsdeteksjon av ROS-produksjon etter fremkalling av PAMP-er i risskiver (Oryza sativa) vevsbladskiver og kappe. Metoden som tilbys her er enkel, stabil og standardisert, og er svært tilpasningsdyktig for å møte ulike eksperimentelle behov. Dataene oppnådd med denne metoden er svært reproduserbare under fast kontrollerte forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Protokollen gjelder for forskjellige plantevev. Riskappe og bladskiver ble brukt i denne protokollen for ROS-deteksjon ved PAMP-fremkalling. Siden forskjeller hovedsakelig oppstår på grunn av prøvetakingsmetoden, er bare de vanlige prosedyrene beskrevet nedenfor, med spesifikke trinn nevnt der det er nødvendig.
1. Plantekultur
- Steriliser de avskallede risfrøene med 70% etanol i 1 min, deretter med 40% natriumhypokloritt (NaClO) i 1 time. Skyll deretter frøene 5x med sterilt vann for å fjerne gjenværende klor.
- Plate frøene aseptisk på 1/2 MS medium (2,37 g/l Murashige og Skoog (MS) medium, 30 g/l sukrose, 2,1 g/l fytagel, pH 5,7, autoklavert).
- I risskjeden metoden, direkte plate frøene i det sterile glassbeholderen med MS-medium.
- I bladskivemetoden, plate frøene på MS-plater i 5-7 dager og transplanter dem til vekstmatrise eller jord (figur 1A).
- Dyrk plantene i et vekstrom med en 12 timers lys / 12 t mørk fotoperiode.
2. Vevpreparasjon og forbehandling
- Ris skjede
- Klipp kappen fra 10 dager gamle risplanter i 3 mm segmenter med et skarpt barberblad eller kirurgisk blad for forbehandling 1 dag før ROS-analysen (figur 1B).
- Plasser fem kappesegmenter i en individuell brønn på en 96-brønns mikrotiterplate inneholdende 100 μL ddH 2 O i 10-12 timer, i mørket ved 25 °C, noe som gjør det mulig for sårskaderelatert ionelekkasje og forsvarsrespons å avta (figur 2).
MERK: Å passe på å holde kuttene vertikale for å sikre et jevnt skjæreflate som utsettes for fremkallingsløsningen, er et viktig skritt for å oppnå svært reproduserbare resultater. Flytt segmentene forsiktig. Ikke lag ekstra kutt eller sår på segmentene, da dette kan være en kilde til variasjon i data. Som prinsipp må hver test inneholde minst fem replikater siden variasjonen av ROS-verdien er stor. Jo flere replikater sett, jo mer pålitelige er dataene.
- Bladskive
- Klipp bladskivene (4 mm i diameter) fra 4-6 uker gamle risplanter ved hjelp av en biopsistans med et stempel. Skjær alltid bladskiver fra den midterste tredjedelen av det andre bladet (nummerert fra toppen) på hovedrorkulten for å redusere datavariasjonen (figur 1C).
- Plasser en bladskive i en individuell brønn på en 96-brønns mikrotiterplate inneholdende 100 μL ddH 2 O i 10-12 timer for forbehandling, noe som gjør at sårrelaterte responser kan avta, da disse kan forstyrre induksjonen av ROS av PAMPs (figur 2).
NOTAT: Bruk bladskivene forsiktig. Ikke lag ekstra kutt eller sår på platene i forsøket, noe som kan føre til datavariasjon. Induksjonen av ROS skjer hovedsakelig fra cellene i kuttkanten, siden overflatene av risvev (blader eller skjeder), er dekket med hydrofobe lag. Bare cellene i de kuttede kantene er i kontakt med fremkallingsløsningen (se diskusjonsdelen). - Hold alle bladskivene flytende, med den abaksiale overflaten vendt oppover, i brønnene på en mikrotiterplate for vannforbehandling for å unngå variasjon i bladsiden.
Figur 1: Vekstkondisjonen og stadiene av risplanter for kappeprøvetaking og deler av risskjeden og risbladene som brukes i analysen. (A) Risplanter dyrket på 1/2 MS medium under sterile forhold i 10 dager kan prøvetas for ROS-analyse. Steriliserte risfrø ble dyrket på 1/2 MS medium og dyrket i en 12 t lys / 12 h mørk fotoperiode i klart glass hetteglass, 8,5 cm i diameter og 15 cm i høyden. (B) Skjematisk diagram over prøvetakingsdelene av bladskjeder. Bladskjede ble kuttet fra 10 dager gamle risplanter. Posisjonene til bladskjede var over røttene og under det første bladet. (C) Skjematisk diagram over prøvetakingsposisjonen til bladskiver. Bladskivene kan kuttes fra den midterste tredjedel av det andre bladet (telle fra toppen) av hovedrorkulten av sunne risplanter i ethvert vekststadium. Forkortelser: ROS = reaktive oksygenarter; MS = Murashige og Skoog. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk diagram over plateoppsettet for måling av ROS-produksjon med forskjellige linjer med Oryza sativa. Forbehandling og test av risvev ved bruk av en 96-brønnplate. Linje 1, linje 2 og linje 3 (opptil åtte linjer på en plate) kan være et hvilket som helst materiale av interesse, forskjellige kultivarer, mutanter eller transgene linjer. Vevene ble stimulert med fremkallingsløsninger med PAMP (PAMP, hvit) eller uten PAMP (ddH2O, grå) for å måle ROS-respons. Det skal bemerkes at jo flere prøvene som skal testes, desto lengre er tidsintervallet mellom avlesningene. Forkortelser: ROS = reaktive oksygenarter; PAMP = patogenassosiert molekylært mønster; ddH2O = dobbeltdestillert vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Klargjøring av lokkeløsningen
- Løs opp L-012 pulver i 20 mM (6,23 mg/ml) vandig oppløsning med ddH2O for å lage stamløsningen. Fortynn deretter stamløsningen med 50 mM Tris HCl-buffer (pH 7,5) for å lage arbeidsløsningen ved den endelige konsentrasjonen på 500 μM L-012. Hold stamløsningen frossen og fortynn til arbeidsløsningen før bruk.
- Forbered elicitasjonsoppløsningen som inneholder PAMP, L-012 og pepperrotperoksidase (HRP; 10 mg / ml i ddH2O). For en 10 ml fremkallingsløsning, bland 9,4 ml 50 mM Tris HCl (pH 7,5) løsning, 400 μL av L-012-løsningen, 100 mikrol HRP og 100 mikrol flg22 (PAMP; 10 mM i ddH2O). For den negative kontrollen, legg til 100 μL ddH2O i stedet for PAMP.
MERK: Hold de tilberedte fremkallingsløsningene ved romtemperatur for å unngå kaldt stress på risvev. Andre forsterkere kan også brukes til behandling etter behov, for eksempel kitin (20 ng/ml i sluttkonsentrasjon). Siden L-012 er lysfølsom, dekk alle rørene som inneholder L-012-løsning med aluminiumsfolie.
4. Starte programvaren og sette opp protokollen med den refererte mikroplateleseren (se Materialfortegnelse)
MERK: Det tar litt tid å sette opp parametrene til mikroplateleserprogramvaren. Det anbefales å gjøre maskinen og protokollen klar (ett klikk for å fortsette) før du legger til fremkallingsløsningen.
- Start programvaren. Klikk på Eksperimenter-knappen for å opprette en ny protokoll eller bruke en eksisterende protokoll.
- Klikk Prosedyre i popup-vinduet for å sette opp platen. Velg brønnene fra platen som skal overvåkes.
- Klikk Start kinetikk for å konfigurere total kjøretid og leseintervall. Sett kjøretiden til 35 minutter eller mer, avhengig av eksperimentelle krav. Hvis du vil hente avlesninger så ofte som mulig, velger du Minimumsintervall. For integrasjonstid, velg 1 s eller lengre, avhengig av signalintensiteten.
MERK: Leseintervallet avhenger av antall samplinger og varigheten av signalintegrasjonen. - Klikk på Valider | OK for å bekrefte innstillingene.
- Klikk på Oppdag den nye platen i popup-vinduet og vent til programvaren ber om lastplatedialogboksen. Plasser platen som skal testes på stativet.
- Stopp her for å vente på at fremkallingssystemet skal etableres (i neste avsnitt). Så snart fremkallingssystemet er klart, klikker du på Kjør for å starte lesingen.
5. Etablering av lokkesystemet og måling av sanntids ROS-produksjon
- Fjern forsiktig ddH2O fra brønnene som inneholder det forbehandlede vevet, og unngå vevskader eller uttørking.
- Bruk en flerkanalspipett til å tilsette 200 μL av fremkallingsløsningen til brønnene som inneholder vevet.
- Rist forsiktig for å blande. Klikk Kjør for å begynne gjenkjenningen.
MERK: Med PAMP-behandling reagerer plantevev og produserer ROS veldig raskt. Derfor foreslås det at den negative kontrollen uten PAMP behandles først for å redusere operasjonstiden når det er flere behandlinger. Operer så raskt som mulig for å redusere fremkallingsforsinkelsen mellom behandlingene. Jo kortere tid mellom tilsetning av fremkallingsløsningen og starten av deteksjonen, desto bedre blir fangsten av viktige eksperimentelle data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her tar vi rismateriale som et eksempel for å bestemme ROS produsert med flg22-behandling. Genereringen av ROS etter fremkalling er forbigående. Hos ris ble økningen i ROS-produksjonen først oppdaget på 1-2 minutter, toppet seg ved 10-12 min, og returnert til baseline i ~30-35 min (figur 3). Sammenlignet med kontrolltesten, der PAMP var fraværende i fremkallingsløsningen som ikke resulterte i noen åpenbar ROS-induksjon, ble et spesifikt ROS-utbrudd indusert bare når fremkallingsoppløsningen inneholdt flg22 eller annen PAMP, slik som kitin. I mellomtiden kan den totale mengden ROS beregnes ut fra kurven (figur 4).
Figur 3: ROS-induksjon i risvev. (A) Bladskiver (4 mm i diameter) og (B) 3 mm lange kapper ble brukt til å indusere ROS ved flg22. ROS-genereringen overvåkes i 35 minutter. Barer indikerer SD-middelet beregnet fra fem tekniske gjentakelser. Lesedataene ble importert til et regneark. Bruk formlene "GJENNOMSNITT" og "STDEV. P" til datasettet for å beregne henholdsvis gjennomsnittsverdien og standardfeilen fra replikatene for hvert datapunkt. Deretter ble kurvene generert fra ROS-verdiene (gjennomsnittsverdi og standardfeil). Forkortelser: ROS = reaktive oksygenarter; flg22 = 22-aminosyre flagellinpeptid; ddH2O = dobbeltdestillert vann; RLU = relative luminescensenheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Den totale mengden ROS generert med kappen. Den totale mengden ROS beregnes vanligvis ut fra kurven hentet fra testen. De totale ROS-beløpene som er vist her, er beregnet ut fra kurven som tilsvarer figur 3A. For å oppnå den totale mengden ROS-verdier, bruk formelen "= (y̅ n + n + 
1) × tidsintervall / 2" til de tilsvarende datasettene for å beregne ROS generert ved hvert tidsintervall, som kan kombineres ved å bruke formelen "SUM" for å beregne den totale mengden generert. Forkortelser: ROS = reaktive oksygenarter; flg22 = 22-aminosyre flagellinpeptid; ddH2O = dobbeltdestillert vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: ROS-produksjon i de eksponerte cellene i kuttkanten. En enkelt hel eller to halvdeler av en bladskive ble plassert i brønnene til en 96-brønns mikrotiterplate, forbehandlet med 100 μL ddH2O i 10-12 timer, og deretter behandlet med flg22 for ROS-induksjon. Leseverdiene fra de to halvskiveprøvene er mye høyere enn verdiene fra hele bladskiven (A). I gjennomsnitt er de totale verdiene fra de to halvskiveprøvene ~ 1,6 ganger de fra hele bladskiven (B), som er proporsjonal med kantlengden, ikke til området, av prøvene. Dette resultatet støtter at ROS hovedsakelig genereres i celler på sårstedet. Forkortelser: ROS = reaktive oksygenarter; flg22 = 22-aminosyre flagellinpeptid; ddH2O = dobbeltdestillert vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne studien var å etablere en svært effektiv metode for å kvantifisere tidlig ROS-produksjon som respons på PAMP i risvev. Denne metoden gir en standardisert prosedyre for sanntidsbestemmelse av apoplast ROS produsert fra behandlet risvev. Denne metoden er enkel i drift, lav kostnad, klar i sammensetning og uavhengig av kommersielle sett. Ved hjelp av denne metoden kan forskere studere sanntidsproduksjonen av apoplast ROS når planter blir utsatt for biotiske eller abiotiske påkjenninger.
I denne protokollen ble L-012 valgt som kjemiluminescensreagens, da det er et ikke-toksisk kjemikalie. Luminol er mye brukt i kjemiluminescensanalyser for å oppdage ROS-produksjon. Imidlertid er det tre ulemper med luminol, noe som gjør det uegnet for ROS-deteksjon i ris og andre plantevev: dårlig vannløselighet, kort responsvarighet og hard reaksjons-pH. Luminol produserer lys bare under alkaliske forhold, med en optimal pH ved 9,5, som er for hard til å plante celler og induserer uønskede responser. I tillegg har luminol en mye lavere lysutslippseffektivitet enn L-012, som har den høyeste luminescerende følsomheten under fysiologiske forhold, ved nøytral eller nær nøytral pH. Dermed brukes L-012 i økende grad i levende vev eller cellesystemer for å oppdage ROS-produksjon.
ROS-produksjon i PTI-respons påvirkes av mange interne eller eksterne faktorer. Dermed er variasjonen i ROS-induksjon i PTI-respons stor. For å eliminere variasjoner så mye som mulig, tar denne protokollen tiltak for å kontrollere testforholdene fast. Først ble et 50 mM Tris-HCl buffersystem brukt på fremkallingsløsningen i protokollen. Selv om noen forskere bruker ubufrede systemer for å teste ROS-produksjon, fant vi at et buffersystem har bedre ytelse med hensyn til datakonsistens og reproduserbarhet og en bedre grunnlinje i kontrollgruppen. For det andre anbefaler forfatterne sterkt å ta prøver så konsekvent som mulig.
Inkonsistensen mellom vev er en viktig kilde til datavariasjon. Denne protokollen anbefaler å velge vev fra samme posisjon av samme blad (antall) eller skjede av sunne planter under samme kulturforhold. Vi kutter alltid bladskiver fra den midterste tredjedelen av det andre bladet (nummerert fra toppen) på hovedrorkulten og opprettholder konsistens mellom forskjellige forsøksgrupper eller forskjellige genotyper. Ved bruk av kappe som testvev skal snittet av kappen holdes vertikalt under prøvetakingsprosessen. Hvis kuttet er skrått, kan det resulterende sårområdet ikke holdes konsistent, noe som vil føre til ustabile eksperimentelle resultater. For det tredje skal vevet opereres forsiktig og forbehandles på samme måte. Sår eller skader på testvevet bør unngås, da sår vil utsette flere celler for fremkallingsløsningen, noe som utvilsomt vil resultere i datavariasjon. Som vist i figur 5 tilskrives fremkallingen av ROS hovedsakelig eksponerte celler. I tillegg vil verdien av ROS-produksjonen bli dramatisk redusert når nye skader skjer like før avlesningen.
En annen viktig faktor å vurdere når man oppdager sanntidsproduksjon av ROS av plantevev, er effekten av den sirkadiske klokken. Vi la merke til forskjeller i leseverdiene på ulike tider av døgnet. Det har blitt bevist at den sirkadiske klokken kan påvirke produksjonen og responsen til ROS, samt transkripsjonsreguleringen av ROS-relaterte gener. Nivået på ROS svinger gjennom dagen, når en topp ved middagstid og dypper ved midnatt14. Oppsummert tillater denne høye gjennomstrømningsprosedyren samtidig deteksjon av flere prøver, noe som kan bidra til å unngå effekten av den sirkadiske klokken på ROS-produksjon. For å oppnå reproduserbare resultater, anbefaler vi å utføre biologiske replikater på samme tid på dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Shanghai Natural Science Foundation (tilskuddsnummer: 21ZR1429300 / BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Agri-X-programmet, stipendnummer: AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (tilskuddsnummer: ZXWH2150201/001) til Jiangbo Fan, og av Medical-Engineering Collaboration Project of Shanghai Jiao Tong Univesity (tilskuddsnummer: 21X010301734) til Can Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
References
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648 (2015).
