Summary
Den här artikeln syftar till att ge forskare en detaljerad och lättillgänglig guide för att skapa en modell av hemorragisk chock hos spädbarnssvin.
Abstract
Hemorragisk chock är en ledande orsak till morbiditet och mortalitet hos pediatriska patienter. Tolkning av de kliniska indikatorer som validerats hos vuxna för att vägleda återupplivning och jämförelse mellan olika behandlingar är svårt hos barn på grund av den inneboende heterogeniteten hos denna population. Som ett resultat av detta är lämplig behandling av pediatrisk hemorragisk chock fortfarande inte väl etablerad jämfört med vuxna. Dessutom gör bristen på pediatriska patienter med hemorragisk chock att kliniskt relevanta studier inte kan utvecklas. Av denna anledning är en experimentell pediatrisk djurmodell nödvändig för att studera effekterna av blödning hos barn samt deras svar på olika terapier. Vi presenterar en djurmodell av volymkontrollerad hemorragisk chock hos sövda unga grisar. Blödningen induceras genom att en tidigare beräknad blodvolym tas ut, varefter grisen övervakas och återupplivas med olika behandlingar. Här beskriver vi en exakt och mycket reproducerbar modell av hemorragisk chock hos omogna svin. Modellen ger hemodynamiska data som karakteriserar kompensatoriska mekanismer som aktiveras som svar på svåra blödningar.
Introduction
Livshotande blödningar på grund av trauma, även om de är ovanliga, är den vanligaste dödsorsaken hos pediatriska patienter 1,2. Ytterligare orsaker till hemorragisk chock inkluderar hemorragisk feber, gastrointestinal blödning, leverkirurgi och hjärtkirurgi, särskilt när kardiopulmonell bypass används3.
Till skillnad från den vuxna befolkningen finns det otillräckliga data om hanteringen av pediatrisk hemorragisk chock, som till stor del är baserad på expertutlåtanden eller direkt översatta från vuxenpraxis 2,4. Det kan dock vara olämpligt att översätta förvaltningsstrategier från vuxna. Till exempel är kliniska indikatorer som validerats på vuxna svåra att extrapolera till pediatriska patienter på grund av den fysiologiska heterogenitet som finns mellan grupper i olika åldrar och de olika skademönster som dominerar i den pediatriska populationen. Följaktligen är specifika effektmått som skulle utlösa intervention hos den pediatriska patienten inte väldefinierade. Dessutom finns det inte tillräckligt med bevis för de skadliga effekter som behandlingar som för närvarande tillämpas på vuxna kan ha på barn 2,4,5.
Mot bakgrund av allt detta behövs ytterligare undersökningar för att fastställa specifika återupplivningströsklar för att påskynda intervention, samt för att bättre kunna avgöra vilka som är de mest lämpliga behandlingarna för pediatrisk hemorragisk chock. Det är dock svårt att utveckla kvalitativa och kliniskt relevanta studier av livshotande blödningar hos barn på grund av bristen på patienter och den redan nämnda heterogeniteten i den pediatriska populationen från nyföddhetsperioden till tonåren.
Den kliniska relevansen av hemorragisk chock, liksom svårigheterna att utföra kliniska studier på pediatriska patienter, understryker behovet av prekliniska utvärderingar på djurmodeller för att studera patofysiologi efter hemorragisk chock hos barn, samt för att jämföra olika terapier. Flera djurmodeller har använts i stor utsträckning i forskning för att studera hemorragisk chock 6,7,8,9. På grund av deras anatomiska och fysiologiska likheter med människor är grisar högt värderade inom biomedicinsk forskning. När det gäller fördelarna med att använda specifika spädbarnsmodeller finns det belägg för att omogna svinhemodynamiker, såväl som andningsvägar, hematologiska och metaboliska system, är mycket jämförbara med dem hos unga människor9. Detta ger en unik möjlighet att simulera ett kliniskt scenario med hemorragisk chock hos barn.
I denna modell induceras blödning genom att dra tillbaka en tidigare beräknad blodvolym. Därefter övervakas grisen och olika återupplivningsvätskor administreras.
Här beskriver vi en exakt och mycket reproducerbar modell av hemorragisk chock hos omogna svin. Modellen ger hemodynamiska data som karakteriserar kompensatoriska mekanismer som aktiveras som svar på svåra blödningar.
Protocol
Experimenten i detta protokoll godkändes av den institutionella etiska kommittén för djurforskning vid Gregorio Marañón University Hospital, Madrid, Spanien, och jordbruks- och miljörådet i Madrids autonoma regering (tillståndsnummer: 12/0013). Europeiska och spanska riktlinjer för etisk vård och användning av försöksdjur tillämpades under hela studien. Experimenten utfördes vid avdelningen för experimentell medicin och kirurgi, Gregorio Marañón University Hospital, Madrid, Spanien.
OBS: Den valda djurmodellen bestod av friska 2-3 månader gamla (8-12 kg) minigrisar (Sus scrofa domestica). Minigrisar är resultatet av en korsning av tre olika raser som gör dem lämpliga för biomedicinsk forskning. Djuren är nästan identiska linjer och tillhandahålls av en särskilt godkänd avelsanläggning i Madrid (IMIDRA), som håller upprätthållandet av tre homozygota genetiska linjer i renhet. Han- och hondjur användes omväxlande. Djuren utfodrades med en standarddiet för svin och observerades under minst 2 dagar för att säkerställa god hälsa. Mat, men inte vatten, drogs in natten före ingreppen för att minska risken för aspiration. Ett typiskt experiment tar cirka 6 timmar att genomföra, inklusive 30 minuter för anestesiinduktion och kirurgisk förberedelse, 60 min för instrumentering, 30 min för återhämtning, 60 min för blödningsinduktion och bakre stabilisering, 30 min för återupplivning och 120 min för uppföljning.
1. Anestesi, intubation och mekanisk ventilation
- Premedicinera grisen med en intramuskulär injektion av ketamin (10 mg/kg) och atropin (0,02 mg/kg) i den laterala delen av halsen, bakom örat eller i den bakre lårbensregionen.
OBS: Antikolinerga läkemedel, såsom atropin, är användbara eftersom svin kan dregla överdrivet under narkos10. Enligt vår erfarenhet är denna dos ketamin tillräcklig för att minska stress och inducerar adekvat sedering och smärtlindring hos grisar utan negativa effekter. Men om djuret inte är ordentligt sövt eller om avståndet från stallet till operationssalen är långt, kan ytterligare en dos ketamin (10 mg/kg) administreras på ett säkert sätt.
VARNING: Handskar är nödvändiga vid hantering av djur. - Transportera det nedsövda djuret till operationssalen och lägg det på ett operationsbord med en värmefilt.
- Mät perifer syremättnad (Sp02) med en sensor fäst vid grisens öra och initiera kontinuerlig övervakning med tre avledningar och elektrokardiografi (EKG).
- Desinficera huden med minst 3 omväxlande omgångar av povidon-jod- eller klorhexidinskrubb och alkohol. För in en perifer venkateter (22-24 G) i öronvenen. Desinficera huden med en antiseptisk lösning.
- Inducera anestesi genom en intravenös injektion av fentanyl (5 μg/kg), propofol (4 mg/kg) och atrakurium (0,5 mg/kg). När den spontana andningen försvinner och frånvaron av reflexer har bekräftats, placera djuret i ryggläge och initiera omedelbart ventilation av handväskan med en hundmask med fraktion av inandat syre (Fi02) inställd på 100 %.
ANMÄRKNING: För att minska risken för oavsiktlig medvetenhet i samband med användning av neuromuskulära blockerare bör anestesimedel med känd effekt på svin och med doser på den högre gränsen användas för att säkerställa en adekvat anestesinivå. Övervaka dessutom kontinuerligt kardiovaskulära tecken som hjärtfrekvens, blodtryck och kroppstemperatur, och administrera neuromuskulära blockerare endast när tillbakadragande reflexer saknas (pedaltillbakadragande, palpebrala reflexer och käktonus) och muskeltonus är avslappnad. - Utför endotrakeal intubation. Minst två operatörer behövs för detta förfarande.
- Se till att den grundläggande utrustningen och de kirurgiska verktyg som behövs för endotrakeal intubation är redo: knyt gasbinda för att öppna munnen och säkra sonden, veterinärt laryngoskop med ett rakt blad mellan 17 och 25 cm långt, en vanlig endotrakealtub (ID 4-5), stylett, spruta med luft och tejp.
- Dra ut tungan något och håll käken öppen med hjälp av bindväv som placeras bakom de övre och nedre hörntänderna.
- Utför en laryngoskopi och, när struplocket är synligt, använd spetsen på laryngoskopet för att trycka struplocket uppåt mot tungroten.
OBS: Om struplocket sitter fast i den mjuka gommen kan det förskjutas dorsalt med spetsen på röret. Operatör 1 utför steg 1.6.2 medan operatör 2 utför steg 1.6.3. - När stämbanden har visualiserats, för försiktigt in röret med lätt rotation i luftstrupen.
OBS: Den smalaste punkten på luftstrupen är på den subglottiska nivån. Om det är svårt att sätta in slangen, prova en lätt rotation eller ett mindre rör. - Ta bort styletten och använd en 5 ml spruta för att blåsa upp manschetten.
- Säkerställ placeringen av endotrakealtuben genom att observera symmetrisk brösthöjning, tillräcklig syremättnad (95%-100%) och en korrekt vågform och endtidal CO2 (EtCO2) avläsning.
VARNING: Svin är mycket mottagliga för laryngospasm och ödem i struphuvudets slemhinna, och larynxperforering kan till och med uppstå efter flera försök till intubation eller om sederingen är otillräcklig10.
- Efter att ha bekräftat intubationen, initiera mekanisk ventilation med en mekanisk ventilator med en andningsfrekvens på 20 andetag per minut, tidalvolym på 8 ml/kg, FiO2 på 40 % och positivt slutexpiratoriskt tryck på 4 cm H2O. Justera ventilationen för att uppnå ett partialtryck av koldioxid (PaCO2) mellan 35 och 45 mmHg.
- Bibehåll djup anestesi under hela försöket via en kontinuerlig infusion av fentanyl (10 μg/kg/timme), propofol (10 mg/kg/timme) och atrakurium (2 mg/kg/timme).
2. Instrumentering
- Förbered lårbensområdet för kärlkateterisering. Använd bandage för att dra benen bakåt och desinficera ljumskområdet med minst 3 alternerande omgångar av povidon-jod eller klorhexidinskrubb och alkohol.
- Bedöm lårbenskärlet med ultraljud och använd dopplertekniken för att skilja mellan artären och venen. Beroende på venens storlek, sätt in en 5,5-7,5 fransk (F) central venkateter med tre portar i en av lårbensvenerna under kontinuerlig ultraljudsundersökning och med hjälp av Seldinger-teknik11,12.
- Omedelbart efter placering av central venkateter, anslut ett givarsystem för att mäta det centrala ventrycket.
- Se till att en elektrolyt med glukosinfusion (20 ml/timme) är ansluten till en av portarna i centrallinjen och att en underhållsinfusion med koksaltlösning (5 ml/timme) infunderas via den återstående porten för att förhindra ocklusion av katetern.
- Använd samma teknik för att kanylera den motsatta lårbensartären med en 4 F artärkateter som är särskilt utformad för övervakning av hjärtminutvolymen. Utför ett blodgastest för att fastställa kateterns korrekta position om ultraljudsbekräftelse inte är möjlig.
OBS: Vid betydande spasm eller hematom, gå över till den kontralaterala lårbensartären. - När artärkatetern har satts in, anslut artärtråden på hjärtminutvolymövervakningssystemet och artärgivaren direkt till monitorporten. Anslut samtidigt monitorns venmätenhet till den centrala vengivaren.
OBS: Hjärtminutvolymmonitorn som används i detta experiment specificeras i materialtabellen. För installation, kalibrering och mätningar, se tillverkarens instruktioner13. - Se till att både ven- och arteriella givare är kalibrerade till noll.
- Exponera den vänstra inre halspulsådern och den vänstra yttre halsvenen med hjälp av cut-down-tekniken.
- Se till att nödvändig utrustning och kirurgiska verktyg finns tillgängliga: skalpell, kirurgisk sax med trubbig spets, vävnadstång, liten självkvarhållande vävnadsupprullare, nålhållare, kirurgiska byten, sutur med nål, en 18 G IV-kanyl, en 5 F kateterhylsa med en introducer och en Seldinger-ledare.
- Med djuret i ryggläge, desinficera nackhuden med en antiseptisk lösning.
- Använd en skalpell för att göra ett ~10 cm vänster paratrakealsnitt, dela en linje mellan manubrium och käkens vinkel.
- För att exponera den yttre jugularvenen, dissekera vävnaden lateralt mot SCM och isolera venen från den omgivande fascian.
- Efter att ha isolerats, använd två icke-absorberbara silkessuturer (USP-0) slingor runt venen för att fixera kärlet före punkteringen.
- Snitta venen med en venflonnål (18 G). Väl inne i venen, dra tillbaka nålen och för in guidetråden genom venflonröret.
- Ta bort venflonröret och sätt in manteln med introducern (5 F) över tråden. Efter insättning, ta bort både introducern och tråden.
- Omedelbart efter insättning, skölj manteln med 0,9 % NaCl (5 ml/h) för att förhindra trombbildning.
- Knyt upp den proximala silkessuturen runt slidan för att fixera den. Fäst sedan mantelns handtag vid SCM och stäng huden med häftklamrar.
- Efter den kirurgiska förberedelsen ska djuren stabiliseras i 30 minuter innan de får baslinjeövervakningsvärdena och blodproverna.
- Håll blodtemperaturen på 37-39 °C med hjälp av en värmefilt och en takvärmare under hela experimentet.
OBS: Temperaturen mäts med en termistor placerad vid den termodilution arteriella kateterspetsen.
3. Hemodynamisk övervakning och perfusionsövervakning
- Övervaka EKG, perifer syremättnad, andningsvolymer och andningstryck och Fi02.
- Anslut en spirometer mellan endotrakealtuben och en multiparametermonitor för att mäta kvalitativ och kvantitativ EtC02.
OBS: För mer information om multiparametermonitorn, se materialtabellen. - Använd nära-infraröd spektroskopi (NIRS) för att övervaka hjärnvävnadens syresättningsindex (bTOI) och splanchnic tissue oxygenation index (aTOI). Placera sensorerna på huden i pannan och den främre bukväggen (subhepatisk region).
OBS: Placera inte hjärnsensorn i mittlinjen, eftersom den kan vara kontaminerad med det överlägsna sagittala sinusvenösa blodet14. - Anslut blodflödessonden som är ansluten till den inre halspulsådern till en flödesmätare för att mäta blodflödet i halspulsådern (CaBF).
- Placera en laserdopplersensor över huden på den främre bukväggen för kontinuerlig mätning av det kutana tisulära blodflödet (CuTBF).
OBS: För mer information om karotis- och kutana tissulära blåsflödessensorer, se materialtabellen. - Registrera följande parametrar vid baslinjen och var 30:e minut: blodtemperatur, inspiratorisk tidalvolym, EtCO2, hjärtrytm, hjärtfrekvens (HR), systoliskt och diastoliskt blodtryck, genomsnittligt arteriellt blodtryck (MAP), chockindex (HR/systoliskt blodtryck)15, centralt venöst tryck, hjärtindex (CI), globalt slut diastoliskt volymindex (GEDVI), slagvolymindex (SVI), vänster kammares kontraktilitet (Dt/Dpmax), systemiskt vaskulärt resistensindex (SVRI), extravaskulärt lungvattenindex (ELWI), tryckpulsvariation (PPV), perifer hemoglobinmättnad, central venös mättnad (ScvO2), cerebral (bTOI) och splanchnic (aTOI) vävnadssyresättningsindex av NIRS, CaBF och CuTBF.
- För att erhålla CI-värden, infunderas 5 ml bolusar med 0,9 % normal koksaltlösning vid en temperatur under 8 °C genom den centrala venkatetern. Registrera medelvärdet av två på varandra följande mått.
- Bestäm de arteriella och venösa blodgasprofilerna och laktatkoncentrationen var 30:e minut genom att ta 0,3 ml blod från lårbenskärlen. Utför standard fullständiga blodstatusar, koagulationsstudier och biokemi vid baslinjen, efter blödningsinduktion och i slutet av experimentet.
- Efter varje blodprov, spola linjerna med 0,5 ml 100 IE/ml heparin.
4. Induktion av hemorragisk chock
- När steady state har uppnåtts efter att instrumentering och baslinjedata har samlats in, induceras hypovolemisk chock genom att 30 ml/kg blod dras ut från halsvenen under 30 minuter.
- Tillåt en period på 30 minuter för stabilisering. Gör inga återupplivningsförsök under denna period för att efterlikna förseningen i ankomsten av akutmedicinska team.
5. Infusion och uppföljning
- Efter stabiliseringsperioden infunderas en bolus av en volymexpander eller ett vasoaktivt medel under en 30-minutersperiod.
OBS: Exempel på volymexpanders och vasoaktiva medel som testas är normal koksaltlösning, hypertoniskt albumin, angiotensin och terlipressin. I denna studie användes 30 ml/kg normal koksaltlösning (NS) (n = 13), 15 ml/kg 5 % albumin plus 3 % hyperton koksaltlösning (AHS) (n = 13) eller en intravenös engångsbolus på 15 μg/kg terlipressin plus 15 ml/kg 5 % albumin plus 3 % hyperton koksaltlösning (TAHS) (n = 13). - Efter infusionen ska djuret följas upp i 120 minuter. Anteckna de hemodynamiska parametrarna och ta blodprover var 30:e minut för arteriella och venösa blodgasprofiler och bestämning av laktatkoncentration. Gör inga återupplivningsförsök under denna period.
6. Slut på försöket och eutanasi
- När försöket är avslutat används en överdos av lugnande medel (5 μg/kg fentanyl och 10 mg/kg propofol) och en intravenös injektion av kaliumklorid (2 mEq/kg) för att avliva alla djur som framgångsrikt återupplivats.
- Bekräfta frånvaron av cirkulation genom asystoli eller pulslös elektrisk aktivitet på en kontinuerlig EKG-display, frånvaron av pulserande flöde under invasiv övervakning av artärtryck och frånvaron av andra vitala tecken.
- Om det arteriella blodtrycket sjunker under 25 mmHg under uppföljningsperioden ska djuret offras för att undvika ytterligare lidande.
Representative Results
Den presenterade modellen har framgångsrikt använts i flera experiment för att studera makrocirkulatoriska och mikrocirkulatoriska förändringar efter hemorragisk chock och efterföljande återupplivning, genom att jämföra olika vätskor och vasoaktiva läkemedel16,17,18,19.
Med tanke på reaktionen på chock har denna modell konsekvent visat att en kontrollerad blödning ger markanta förändringar i hemodynamiska parametrar, såväl som i cerebral och vävnadsperfusion.
Efter volymuttag detekteras signifikant takykardi och en minskning av MAP, CI, SVI, blodvolymparametrar (GEDVI och ITBI) och karotisarteriellt blodflöde, tillsammans med en ökning av systemiskt vaskulärt resistensindex, (Figur 1 och Figur 2).
När det gäller systemiska perfusionsparametrar ökar laktat signifikant, medan ScvO2, CuTBF och bTO minskar (Figur 3). Variationer i centralt venöst tryck, Dt/Dpmax och ELW registreras vanligtvis inte.
När det gäller laboratorieparametrar minskar inte hemoglobinhalten och hematokriten förrän efter att vätskor har administrerats. Albuminkoncentrationen minskar och troponinnivåerna ökar signifikant efter kontrollerad blödning. Andra parametrar, inklusive kärntemperatur, PaO2, PaCO2, arteriell syremättnad, EtCO2, elektrolyter och njur- och leverfunktionsparametrar, förblir vanligtvis stabila.
Förutom dess användbarhet för att analysera de kardiovaskulära och biokemiska reaktionerna på chock, har denna modell visat sig framgångsrikt skilja mellan olika återupplivningsvätskor.
I tidigare studier har vi strävat efter att avgöra om, i en spädbarnsmodell av hemorragisk chock, användningen av en lägre volyminfusion av hypertoniska vätskor - ensamma eller i kombination med olika vasopressorer - skulle förbättra globala hemodynamiska och perfusionsparametrar jämfört med normal koksaltlösning.
Som tidigare rapporterats har vi konsekvent observerat att infusion av hypertoniska vätskor ger ett liknande svar på infusionen av dubbelt så stor volym isoton vätska16,17,18.
Mer specifikt gav användningen av albumin plus hyperton koksaltlösning en större och längre volymexpansion än normal koksaltlösning eller hyperton koksaltlösning enbart, med signifikanta skillnader i HR, SVI och PPV, och frånvaron av ett progressivt fall efter volymexpansion av blodtryck och GEDVI, som observerats i de andra grupperna (Figur 1 och Figur 2). Vidare har vi också observerat en större förbättring av perfusionsparametrar med hypertoniskt albumin, representerat som en större ökning av bTOI och CaBF, och en större minskning av laktatnivåer än de andra grupperna jämfört med början av vätskeexpansionen (Figur 3). Vi tror att denna skillnad kan vara sekundär till albuminets förmåga att öka blodvolymen och stanna kvar under en längre tid i det intravaskulära facket än normal koksaltlösning. Intressant nog har vi sett att tillsatsen av en enda bolus terlipressin i början av vätskeåterupplivning gav liknande resultat som de som observerades i den hypertoniska albumingruppen, utan några extra fördelar när det gäller hemodynamiska eller perfusionsparametrar17,18.
Figur 1: Hemodynamiska parametrar. (A) Utveckling av hjärtfrekvens, (B) genomsnittligt artärtryck, (C) hjärtindex vid baslinjen (t0') och (D) systemiskt vaskulärt resistensindex vid baslinjen (t0'). Under hela experimentets gång: slut på kontrollerad blödning (Shock30'); infusionens början, 30 minuter efter avslutad kontrollerad blödning (Res0'); slut på infusionen (Res30'); uppföljning 30 minuter efter avslutad infusion (Obs30'); uppföljning 60 minuter efter avslutad infusion (Obs60'); uppföljning 90 minuter efter avslutad infusion (Obs90'). (*) Signifikant skillnad (p < 0,05) från baslinjen, samma grupp. (‡) p < 0,05 från blödning, samma grupp. (#) p < 0,05 från grupp NS. Förkortningar: NS = normal saltlösning; AHS = hypertoniskt koksaltalbumin; TAHS = terlipressin plus hypertoniskt koksaltalbumin. Data presenteras som medelvärde och standardavvikelse. Denna figur är anpassad med tillstånd från Urbano et al.17. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Parametrar för blodvolym. (A) Utveckling av slagvolymindex, (B) pulstrycksvariation och (C) globalt slutdiastoliskt volymindex vid baslinjen (t0'). Under hela experimentets gång: slut på kontrollerad blödning (Shock30'); infusionsstart, 30 minuter efter avslutad kontrollerad blödning (Res0'); slut på infusionen (Res30'); uppföljning 30 minuter efter avslutad infusion (Obs30'); uppföljning 60 minuter efter avslutad infusion (Obs60'); uppföljning 90 minuter efter avslutad infusion (Obs90'). (*) Signifikant skillnad (p < 0,05) från baslinjen, samma grupp. (‡) p < 0,05 från blödning, samma grupp. (#) p < 0,05 från grupp NS. Förkortningar: NS = normal saltlösning; AHS = hypertoniskt koksaltalbumin; TAHS = terlipressin plus hypertoniskt koksaltalbumin. Data presenteras som medelvärde och standardavvikelse. Denna figur är anpassad med tillstånd från Urbano et al.17. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Systemiska perfusionsparametrar. (A) Utveckling av arteriellt blodlaktat, (B) central venös syremättnad i blodet och (C) syresättningsindex för hjärnvävnad vid baslinjen (t0'). Under hela experimentets gång: slut på kontrollerad blödning (Shock30'); infusionsstart, 30 minuter efter avslutad kontrollerad blödning (Res0'); slut på infusionen (Res30'); uppföljning 30 minuter efter avslutad infusion (Obs30'); uppföljning 60 minuter efter avslutad infusion (Obs60'); uppföljning 90 minuter efter avslutad infusion (Obs90'). (*) Signifikant skillnad (p < 0,05) från baslinjen, samma grupp. (‡) p < 0,05 från blödning, samma grupp. (#) p < 0,05 från grupp NS. Data presenteras som medelvärde och standardavvikelse. Denna figur är anpassad med tillstånd från Urbano et al.17. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Att utföra försök på unga grisar kan vara komplicerat och potentiellt livshotande på grund av vissa anatomiska och fysiologiska egenskaper hos dessa djur. För att uppnå konsekventa resultat och minska förlusten av djur finns det några kritiska steg som bör övervägas noggrant. För det första är det viktigt att uppnå en tillräcklig nivå av sedering för att minimera djurets stressrespons, som, om den är överdriven, kan förändra resultaten på grund av endogen katekolaminfrisättning. Det är också viktigt att undvika fördröjningar mellan den intramuskulära injektionen och intubationen, eftersom djuren kan utveckla en allvarlig stressreaktion med takykardi och irreversibel metabolisk acidos som kan påskynda slutet av försöket. Även om andra grupper använder inhalationsbedövningsmedel med goda resultat20,21, föredrar vi intravenösa läkemedel, eftersom inhalationssedativa medel inte tillåter mätning av andningsgasutbyte med indirekt kalorimetri. Enligt vår erfarenhet är en kombination av propofol och fentanyl effektiv och har mycket få biverkningar. Noggrann temperaturhantering under hela försöket är en annan viktig aspekt av protokollet, eftersom snabba temperaturförändringar avsevärt kan påverka djurets hemodynamiska reaktion på chock, förfalska resultaten eller i slutändan leda till att försöket misslyckas.
En annan viktig del av instrumenteringen är intubation, med tanke på särdragen i grisens anatomi och deras känslighet för laryngospasm. Därför bör proceduren utföras av minst en operatör med tidigare erfarenhet, och användning av en stilett och muskelavslappning rekommenderas10,22. Kateterisering av kärl kan också vara utmanande på grund av djurens ringa storlek. För lårbensåtkomst är en sonografistyrd punktering att föredra, eftersom kärlen ligger djupt, vanligtvis har små diametrar och visar olika banor och positioner22. För cervikal åtkomst använder vi kirurgisk åtkomst för att möjliggöra placering av halspulsådern, men ultraljudstekniken är också genomförbar23,24. Kanylering av den yttre halsvenen är vanligtvis att föredra på grund av dess bredare diameter, dess ytliga läge och lägre antal omgivande strukturer22. Katetrar ska spolas omedelbart efter insättning med koksaltlösning för att förhindra ocklusion. Vi använder inte heparin för att undvika koagulationsförändringar. Till en början undvek vi också administrering av glukosinfusioner för att förhindra potentiell förvrängning av det hemodynamiska svaret genom administrering av extra vätska, men vi fann att djuren utvecklade allvarlig och tidig hypoglykemi. Slutligen, även med anestesi och de mindre invasiva tekniker som används nuförtiden, genererar instrumentering en betydande stressreaktion hos djur, så det är önskvärt att lämna tillräckligt med tid för återhämtning innan man påbörjar avlägsnandet av blod. När det gäller induktion av den hemorragiska chocken rekommenderar vi att 30 ml/kg tas bort, eftersom detta genererar ett signifikant patofysiologiskt svar med utmärkt överlevnad. Enligt vår erfarenhet tål inte smågrisar större mängder blodförlust och dödligheten är hög. Gradvis blodtappning är också viktigt, eftersom ett snabbt avlägsnande kan leda till allvarlig hemodynamisk instabilitet och för tidig död hos djuret.
Även om det finns en mängd olika arter och experimentella modeller tillgängliga för forskare, utgör den ideala modellen för hemorragisk chock hos djur - enkel, lätt reproducerbar och exakt replikering av den kliniska situationen - fortfarande en utmaning. Smådjursmodeller – främst möss och råttor – används för att undersöka de patofysiologiska mekanismerna bakom chock. Deras lilla storlek komplicerar dock avsevärt utförandet av kirurgiska ingrepp och provtagningsprocedurer. Större djur, som hundar och grisar, är dyrare och mer komplexa att hantera, men deras storlek och fysiologiska likheter med människor gör dem mer lämpade för preklinisk utvärdering av behandlingsstrategierna. Användningen av hundar i det förflutna och fortfarande idag är dock etiskt tvivelaktig. De erbjuder inga fördelar jämfört med grisar som experimentella djurmodeller, och deras intelligens och det speciella bilaterala förhållandet mellan människor och hundar placerar dem i en högre position på den fylogenetiska skalan 6,7,8.
Med tanke på allt detta har vuxna svin använts i stor utsträckning för kardiovaskulär forskning på grund av deras likheter med vuxna människors fysiologi, storlek och anatomi, vilket är bättre än de flesta arter. Men eftersom det är väl etablerat i litteraturen finns det signifikanta skillnader mellan mänskliga vuxna och pediatriska patienter när det gäller det kardiovaskulära systemet, blodvolymen, temperaturreglering och respons på chock 2,3,4. Samtidigt finns det belägg för att dessa skillnader även gäller för svin, och smågrisar har visat sig ha kardiovaskulära, cerebrovaskulära, hematologiska och elektrolytprofiler som är mycket lika dem hos pediatriska mänskliga patienter 9,25. Slutligen, utöver dessa anatomiska och fysiologiska skillnader mellan vuxna och spädbarn i båda arterna, ger användningen av spädbarnsmodeller, särskilt minigrisar, möjlighet att testa samma enheter som används i den verkliga kliniska miljön för övervakning. I många fall har tillförlitligheten hos dessa enheter visat sig vara låg på grund av en enkel anpassning av de vuxna algoritmerna, sensorerna eller vågarna. Alla dessa aspekter stöder vikten av att utveckla specifika pediatriska djurmodeller och deras relevans när det gäller translationell nytta för den pediatriska kliniska miljön.
Förutom typen av djur finns det tre grundläggande modeller som vanligtvis används i studiet av hemorragisk chock: kontrollerad blödning - antingen genom volym eller tryck - och okontrollerad blödning. Protokollet som presenteras i den här artikeln beskriver en blödningsmodell med fast volym, där en fast blodvolym, vanligtvis beräknad med procentandelen av kroppsvikten, avlägsnas under en tidsperiod som bestäms av observatören. Tvärtom, i modeller med fast tryck blöder djuren till en förutbestämd MAP, som sedan upprätthålls med periodiska blödningar eller vätskeinfusioner under en viss period, beroende på djurart och graden eller resultatet av chock. Både hemorragiska chockmodeller med fast volym och fast tryck gör det möjligt att studera chockinducerade patofysiologiska förändringar under kontrollerade förhållanden, vilket ger en klar fördel när det gäller reproducerbarhet och standardisering. Deras främsta begränsning är dock att de inte tillåter studier av effekterna av olika återupplivningsstrategier på aktiv blödning, där aggressiv vätskeåterupplivning före kirurgisk kontroll av blödning är känd för att öka blödningen och minska överlevnaden, på grund av hämning av trombbildningen och ökningen av medelblodtrycket. Okontrollerade blödningsmodeller inducerade av ett standardiserat vaskulärt trauma - krossning/laceration av lever och mjälte, artärskada eller amputation av ett bihang - har föreslagits för att bättre återspegla den kliniska situationen, vilket möjliggör en bättre förståelse av effekterna av olika vätskeåterupplivningsstrategier och andra interventioner, såsom hypotermi och hemostatiska produkter. Men trots att de är kliniskt mest relevanta har dessa okontrollerade blödningsmodeller några tydliga nackdelar när det gäller standardisering och reproducerbarhet. Med tanke på allt detta verkar det som om den ideala modellen inte existerar, och därför måste forskningen inom detta område balansera klinisk relevans med experimentell standardisering och tillförlitlighet 6,7,8,9,26.
Modellen som beskrivs i denna studie kan erbjuda breda potentiella tillämpningar inom kardiovaskulär forskning, såsom undersökning av endoteldysfunktion och mikrocirkulationsförändringar18 under chock, samt validering av olika hemodynamiska övervakningssystem. Dessutom kan det också användas inom andra forskningsområden, vilket möjliggör studier av endokrina eller immunsvar efter svår blödning samt bestämning av biverkningar av olika vätskor och vasopressorer. När det gäller forskningen om olika återupplivningsstrategier är det dock lämpligt att studera deras effekter i okontrollerade blödningsmodeller innan man genomför förändringar i den kliniska miljön 7,26.
Förutom svårigheten att extrapolera resultaten till verkligheten har denna modell andra begränsningar. Till att börja med finns det några förväxlingsvariabler relaterade till experimentuppställningen, såsom användning av anestesimedel eller mekanisk ventilation, som kan dämpa de fysiologiska reaktionerna under chock och komplicera tolkningen av resultaten. Dessutom kan instrumenteringens stressrespons på djuren och temperaturkontroll påverka makro- och mikrocirkulationen genom olika mekanismer. En annan viktig begränsning i denna modell – relaterad till de experimentella nödvändigheterna och tillgången på resurser – är den begränsade posttraumatiska observationsperioden, vilket ytterligare begränsar studiet av de långsiktiga konsekvenserna av hemorragisk chock. Dessutom, trots de fysiologiska likheterna mellan människor och grisar, finns det vissa skillnader mellan arter som bör beaktas. Koagulationssystemet verkar till exempel vara mer effektivt hos svin27,28. Plasmanivåerna av laktat och succinat skiljer sig också åt mellan olika djurslag, och svin har basalkalos, vilket kan leda till en underskattning av effekterna av blödning på syra-basbalansen29. Slutligen är det också välkänt att de inflammatoriska och immunologiska reaktionerna, liksom vissa vasopressorreceptorer, är olika hos svin9. Specifika skillnader mellan djur måste också beaktas som påverkande faktorer. Flera studier har visat på könsskillnader när det gäller känslighet för chock, där honor har en signifikant överlevnadsfördel jämfört med hanar 6,9. I de experiment som utförs i denna studie använder vi dock djur från samma åldersgrupp och med liknande genetisk bakgrund för att minimera den potentiella variationen hos arter.
Sammanfattningsvis ger den här artikeln en praktisk steg-för-steg-guide för att ställa in en svinmodell av pediatrisk hemorragisk chock. Jämfört med andra befintliga modeller är detta ett tillförlitligt och lättförståeligt protokoll med bred tillämpbarhet inom biomedicinsk forskning, antingen för undersökning av patofysiologiska svar efter svår blödning eller för utvärdering av olika återupplivningsstrategier.
Disclosures
Författarna till detta arbete har ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) genom projektet "PI20/01706" och medgrundats av Europeiska unionen. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller förberedelse av manuskriptet. Vi vill visa vår tacksamhet till alla våra kollegor från Gregorio Marañón Pediatric Intensive Care Unit och från Gregorio Marañón Experimental Institute, eftersom detta projekt inte skulle ha varit möjligt utan deras arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADA swabs | Albino Dias de Andrade, S.A. | 300575750400 | Non-woven swabs |
| Alaris SE | Carefusion | N/A | Volumetric infusion pump |
| Atracurium | Aspen Pharma Trading Limited. Dublin, Ireland | N/A | Muscle relaxant |
| Atropine 1 mg/mL | B. Braun | 481377/1013 | |
| Barrier adhesive aperture drape | Mölnlycke | 63621 | |
| BD emerald syringe 5 mL, 10 mL, 20 mL | Becton Dickinson S.A | https://www.bd.com/en-eu/offerings/capabilities/syringes-and-needles/injection-syringes/bd-emerald-3-piece-syringe | various options available |
| BLF21A laser doppler monitor | Transonic Systems Inc. | BLF21A | Skin blood flow monitor |
| BlueSensor NF ECG electrodes | Ambu | NF-50-A/12 | |
| Check-Flo performer introducer set 5Fr | Cook Medical | G12018 | Vascular Sheath |
| Datex ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland | M1162897 | Hemodynamic monitor |
| Fentanyl 0.05 mg/mL | Kern Pharma | N/A | Anesthesia |
| GE Vivid S5 | GE Healthcare | S series | Ultrasound machine |
| Introcan Safety 18 G, 22 G, 24 G | B. Braun | Introcan series | Safety intravenous catheter |
| INVOS cerebral/somatic oximetry adult sensors | Medtronic PLC, USA | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry/invos-cerebral-somatic-oximetry-adult-sensors.html | |
| INVOS OXIMETER cerebral/somatic | Somanetics | 08-10566 | Regional oxygenation monitor |
| Ketamin 50 mg/mL | Pfizer, S.L. | 47034 | Sedation |
| Leon plus | Heinen + Löwenstein | N/A | Ventilator |
| Life scope VS | Nihon Kohden | N/A | Bedside monitor |
| Miller laryngoscope blade 12″ | Jorgensen Labs, USA | J0449F | Laryngoscope |
| Multi-lumen central venous catheterization set 7 French, 3 lumen, 30 cm | Arrow | CS-14703 | Central venous catheter |
| Nellcor WarmTouch 5300A | Covidien | Thermal blancket | |
| Nitrile gloves | Medihands | KS-ST RT021 | Single use gloves |
| Pediatric SomaSensor INVOS cerebral/somatic | Covidien | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry.html | Disposable regional oxygen saturation sensor |
| PICCO monitoring kit | Pulsion Medical Systems | PV8215 | |
| PICCO thermodilution catheter 5F/20 cm | Pulsion Medical Systems | N/A | |
| Propofol Lipoven 10 mg/mL | Fresenius Kabi, Spain | N/A | Anesthesia |
| Pulse contour cardiac output (PiCCO2) | Pulsion Medical Systems | N/A | Hemodynamic monitor |
| Rüsch flexislip | Teleflex Medical | 503700 | Endotracheal tube stylet |
| Softa swabs | B. Braun | 19579 | Alcohol pads |
| Surgical silk sutures USP 0 | Aragó, Barcelona, Spain. | 6245 | |
| TruWave pressure monitoring set | Edwards | T001767A | Pressure monitoring set |
| Ultrasound transmission gel | Ultragel Hungary 2000 Kft. | UC260 |
References
- Disease Control and Prevention (CDC). Vital signs: Unintentional injury deaths among persons aged 0-19 years-United States, 2000-2009. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 61, 270-276 (2012).
- Russell, R. T., et al. Pediatric traumatic hemorrhagic shock consensus conference recommendations. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 94, S2-S10 (2023).
- Leonard, J. C., et al. Life-threatening bleeding in children: A prospective observational study. Critical Care Medicine. 49 (11), 1943-1954 (2021).
- Cannon, J. W.
- Dehmer, J. J., Adamson, W. T. Massive transfusion and blood product use in the pediatric trauma patient. Seminars in Pediatric Surgery. 19 (4), 286-291 (2010).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Moochhala, S., Wu, J., Lu, J. Hemorrhagic shock: an overview of animal models. Frontiers in Bioscience. 14 (12), 4631-4639 (2009).
- Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. S., Ayala, A. Shock and hemorrhage: an overview of animal models. Shock. 24, 33-39 (2005).
- Hildebrand, F., Andruszkow, H., Huber-Lang, M., Pape, H. C., van Griensven, M. Combined hemorrhage/trauma models in pigs-current state and future perspectives. Shock. 40 (4), 247-273 (2013).
- Chum, H., Pacharinsak, C.
- Leibowitz, A., Oren-Grinberg, A., Matyal, R. Ultrasound guidance for central venous access: Current evidence and clinical recommendations. Journal of Intensive Care Medicine. 35 (3), 303-321 (2020).
- Lockwood, J., Desai, N.
- Operator's Manual PiCCO2. Version 3.1. Pulsion Medical Systems. , Available from: https://www.manualslib.com/manual/2821743/Pulsion-Picco2.html#manual (2013).
- Operations Manual INVOS ® System, Model 5100C. Medtronic. , Available from: http://www.wemed1.com/downloads/dl/files/id/7947/product/10495/manual_for_mo_s_5100c.pdf (2013).
- Acker, S. N., Ross, J. T., Partrick, D. A., Tong, S., Bensard, D. D. Pediatric specific shock index accurately identifies severely injured children. Journal of Pediatric Surgery. 50 (2), 331-334 (2015).
- Urbano, J., et al. Comparison of normal saline, hypertonic saline and hypertonic saline colloid resuscitation fluids in an infant animal model of hypovolemic shock. Resuscitation. 83 (9), 1159-1165 (2012).
- Urbano, J., et al. Comparison of normal saline, hypertonic saline albumin and terlipressin plus hypertonic saline albumin in an infant animal model of hypovolemic shock. PLoS One. 10 (3), e0121678 (2015).
- González, R., et al. Microcirculatory alterations during haemorrhagic shock and after resuscitation in a paediatric animal model. Injury. 47 (2), 335-341 (2016).
- López-Herce, J., Rupérez, M., Sánchez, C., García, C., García, E. Haemodynamic response to acute hypovolaemia, rapid blood volume expansion and adrenaline administration in an infant animal model. Resuscitation. 68 (2), 259-265 (2006).
- Gil-Anton, J., et al. Addition of terlipressin to initial volume resuscitation in a pediatric model of hemorrhagic shock improves hemodynamics and cerebral perfusion. PLoS One. 15 (7), e0235084 (2020).
- Williams, A. M., et al. Complete and partial aortic occlusion for the treatment of hemorrhagic shock in swine. Journal of Visualized Experiments. (138), e58284 (2018).
- Schüttler, D., et al. A practical guide to setting up pig models for cardiovascular catheterization, electrophysiological assessment, and heart disease research. Lab Animal. 51 (2), 46-67 (2022).
- Chiesa, O. A., et al. Minimally invasive ultrasound-guided technique for central venous catheterization via the external jugular vein in pigs. American Journal of Veterinary Research. 82 (9), 760-769 (2021).
- Anderson, J. H., et al. Ultrasound guided percutaneous common carotid artery access in piglets for intracoronary stem cell infusion. Laboratory Animals. 52 (1), 88-92 (2018).
- Hughes, H. C.
- Mayer, A. R., et al. A systematic review of large animal models of combined traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 104, 160-177 (2019).
- Velik-Salchner, C., et al. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thrombosis Research. 117 (5), 597-602 (2006).
- Siller-Matula, J. M., Plasenzotti, R., Spiel, A., Quehenberger, P., Jilma, B.
- Reisz, J. A., et al. All animals are equal but some animals are more equal than others: Plasma lactate and succinate in hemorrhagic shock-A comparison in rodents, swine, nonhuman primates, and injured patients. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 84 (3), 537-541 (2018).
