Summary
باستخدام نموذج فأر مرض الكبد الدهني غير الكحولي الناجم عن النظام الغذائي (NAFLD) ، وصفنا استخدام تقنيات التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة الجديدة في الجسم الحي كطريقة غير جراحية لتقييم مراحل تطور NAFLD ، مع التركيز في الغالب على شبكة الأوعية الدموية الكبدية بسبب مشاركتها الكبيرة في خلل التنظيم الكبدي المرتبط ب NAFLD.
Abstract
يعد مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) مشكلة صحية عالمية متنامية ، ويتفاقم تأثير NAFLD بسبب النقص الحالي في العلاجات الفعالة. العوامل المحددة الكبيرة التي تعيق التشخيص الدقيق في الوقت المناسب (بما في ذلك الدرجات) ومراقبة مرض الكبد الدهني غير الكحولي ، فضلا عن تطوير العلاجات المحتملة ، هي أوجه القصور الحالية في توصيف بنية البيئة المكروية الكبدية وتسجيل مرحلة المرض بطريقة مكانية زمانية وغير جراحية. باستخدام نموذج فأر NAFLD الناجم عن النظام الغذائي ، قمنا بالتحقيق في استخدام تقنيات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (CT) في الجسم الحي كطريقة غير جراحية لتقييم مراحل تطور NAFLD ، مع التركيز في الغالب على شبكة الأوعية الدموية الكبدية بسبب مشاركتها الكبيرة في خلل التنظيم الكبدي المرتبط ب NAFLD. تسمح منهجية التصوير هذه بالتحليل الطولي لتنكس دهني الكبد وامتصاص الأنسجة الوظيفية ، بالإضافة إلى تقييم حجم الدم النسبي وقطر الوريد البابي وكثافة شبكة الأوعية الدموية. إن فهم تكيفات شبكة الأوعية الدموية الكبدية أثناء تطور NAFLD وربط ذلك بطرق أخرى لتوصيف تطور المرض (التنكس الدهني ، الالتهاب ، التليف) باستخدام الطريقة المقترحة يمكن أن يمهد الطريق نحو إنشاء مناهج جديدة وأكثر كفاءة وقابلة للتكرار لأبحاث NAFLD في الفئران. ومن المتوقع أيضا أن يؤدي هذا البروتوكول إلى رفع قيمة النماذج الحيوانية قبل السريرية للتحقيق في تطوير علاجات جديدة ضد تطور المرض.
Introduction
مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) هو مرض استقلابي يصيب حوالي 25٪ من السكان و >80٪ من الأشخاص الذين يعانون من السمنة المفرطة1. ما يقدر بنحو ثلث هؤلاء الأفراد يتقدمون إلى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) ، والذي يتميز بالتنكس الدهني الكبدي والالتهاب والتليف2. NASH هي مرحلة مرضية ذات مخاطر أعلى بكثير لتطوير تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية (HCC)3,4. لهذا السبب ، يعد NASH حاليا السبب الثاني الأكثر شيوعا لزراعة الكبد ، ومن المتوقع أيضا أن يصبح قريبا أهم مؤشر لزراعة الكبد5،6،7. على الرغم من انتشاره وشدته ، لا يتوفر علاج خاص بالمرض لمرض الكبد الدهني غير الكحولي ، وتهدف العلاجات الحالية فقط إلى معالجة الأمراض المرتبطة بالأمراض مثل مقاومة الأنسولين وفرط شحميات الدم 5,6.
في السنوات الأخيرة ، اكتسب الدور الفيزيولوجي المرضي وتكيفات البطانة ، وبشكل عام ، شبكة الأوعية الدموية للأنسجة الأيضية ، مثل الأنسجة الدهنية والكبد ، أهمية أكبر في البحث ، خاصة أثناء السمنة وعدم التنظيم الأيضي 7,8. البطانة هي طبقة أحادية خلوية تبطن شبكة الأوعية الدموية داخليا ، وتعمل كحاجز وظيفي وهيكلي. كما أنه يساهم في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ، مثل تجلط الدم ، ونقل الأيض ، والالتهابات ، وتكوين الأوعيةالدموية 9,10. في حالة الكبد ، تتميز شبكة الأوعية الدموية ، من بين ميزات أخرى ، بوجود خلايا عالية التخصص ، تعرف باسم الخلايا البطانية الجيبية للكبد (LSECs). تفتقر هذه الخلايا إلى غشاء قاعدي ولها العديد من الفينسترات ، مما يسمح بنقل أسهل للركائز بين حمة الدم والكبد. نظرا لموقعها وخصائصها التشريحية المميزة ، من المحتمل أن يكون ل LSECs دور حاسم في العمليات الفيزيولوجية المرضية للكبد ، بما في ذلك تطور التهاب الكبد والتليف أثناء NAFLD / NASH. في الواقع ، تساهم التكيفات المرضية والجزيئية والخلوية التي تخضع لها LSECs في سياق NAFLD في تطور المرض11. على وجه التحديد ، يرتبط تكوين الأوعية الكبدية المعتمد على LSEC الذي يحدث أثناء NAFLD بشكل كبير بتطور الالتهاب وتطور المرض إلى NASH أو حتى HCC12. إلى جانب ذلك ، يتميز NAFLD المبكر المرتبط بالسمنة بتطور مقاومة الأنسولين في LSECs ، والتي تسبق تطور التهاب الكبد أو علامات NAFLD المتقدمةالأخرى 13.
بالإضافة إلى ذلك ، ظهرت LSECs مؤخرا كمنظم مركزي لتدفق الدم الكبدي وتكيفات شبكة الأوعية الدموية أثناء أمراض الكبد للعديد من مسبباتالأمراض 14,15. في الواقع ، يتميز مرض الكبد المزمن بتضيق الأوعية داخل الكبد البارز وزيادة مقاومة تدفق الدم ، مما يساهم في تطور ارتفاع ضغط الدم البابي16. في حالة NAFLD ، تساهم العديد من الآليات ذات الصلة ب LSEC في هذه الظاهرة. على سبيل المثال ، ترتبط مقاومة الأنسولين الخاصة ب LSEC ، كما ذكر أعلاه ، بانخفاض توسع الأوعية المعتمد على الأنسولين في الأوعية الدموية الكبدية13. إلى جانب ذلك ، على مدار المرض ، تصبح الأوعية الدموية الكبدية أكثر حساسية لمضيقات الأوعية ، مما يساهم بشكل أكبر في ضعف تدفق الدم الكبدي ويؤدي إلى ظهور إجهاد القص ، وكلاهما يؤدي إلى تعطيل دوران الأوعية الدقيقة الجيبية17. تشير هذه الحقائق إلى أن الأوعية الدموية هي هدف رئيسي في أمراض الكبد. ومع ذلك ، فإن العوامل المقيدة التي تعيق التشخيص والمراقبة في الوقت المناسب ل NAFLD / NASH ، وكذلك تطوير العلاجات المحتملة ، هي أوجه القصور في التوصيف المتسق للبيئة المكروية الكبدية والبنية الوعائية (الدقيقة) ، وكذلك تسجيل مرحلة المرض بطريقة مكانية زمانية وغير جراحية.
التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (CT) هو حاليا طريقة التصوير غير الغازية القياسية الذهبية لتصوير المعلومات التشريحية بدقة داخل الكائن الحي. يمثل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق والتصوير بالرنين المغناطيسي طريقتين للتصوير التكميلي يمكن أن تغطي مجموعة واسعة من الأمراض وتوفر دقة وتفاصيل استثنائية في الهياكل والأنسجة المصورة. Micro-CT ، على وجه الخصوص ، هي أداة سريعة ودقيقة للغاية تستخدم غالبا لدراسة أمراض مثل أمراض العظام والتغيرات المرتبطة بها في سطح العظام18 ، وتقييم تطور التليف الرئوي بمرور الوقت19 ، وتشخيص سرطان الرئة وتدريجه20 ، أو حتى فحص أمراض الأسنان21 ، دون أي تحضير خاص (أو تدمير) للعينات التي يتم تصويرها.
تعتمد تقنية التصوير بالأشعة المقطعية الدقيقة على خصائص التوهين المختلفة للأعضاء المختلفة من حيث تفاعل الأشعة السينية مع المادة. يتم تصوير الأعضاء التي تظهر اختلافات عالية في توهين الأشعة السينية بتباين عال في صور التصوير المقطعي المحوسب (أي أن الرئتين تبدوان مظلمتين والعظام فاتحة). الأعضاء التي تقدم خصائص توهين متشابهة جدا (الأنسجة الرخوة المختلفة) ، يصعب تمييزها في صور التصوير المقطعيالمحوسب 22. لمعالجة هذا القيد ، تم التحقيق على نطاق واسع في عوامل التباين المتخصصة القائمة على اليود والذهب والبزموت للاستخدام في الجسم الحي . هذه العوامل تغير خصائص التوهين للأنسجة التي تتراكم فيها ، ويتم تطهيرها ببطء من الدورة الدموية ، وتمكن من عتامة موحدة ومستقرة لنظام الأوعية الدموية بأكمله أو الأنسجة المختارة23.
في التشخيص البشري ، يتم بالفعل استخدام التصوير المقطعي المحوسب والتقنيات المماثلة ، مثل جزء الدهون في كثافة البروتون المشتق من التصوير بالرنين المغناطيسي ، لتحديد محتوى الدهون الكبدية24,25. في سياق NAFLD ، يعد تباين الأنسجة الرخوة العالي ضروريا للتمييز الدقيق بين الآفات المرضية أو الأوعية الصغيرة. لهذا الغرض ، يتم استخدام عوامل التباين التي توفر تباينا محسنا لخصائص أنسجة الكبد. تسمح هذه الأدوات والمواد بدراسة خصائص الكبد المتعددة والتعبيرات المرضية المحتملة ، مثل بنية وكثافة شبكة الأوعية الدموية ، وترسب الدهون / التنكس الدهني ، وامتصاص الأنسجة الوظيفية / نقل الدهون (chylomicron) في الكبد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تقييم حجم الدم النسبي الكبدي وقطر الوريد البابي. في وقت فحص قصير جدا ، توفر كل هذه المعلمات معلومات مختلفة وتكميلية حول تقييم وتطور NAFLD ، والتي يمكن استخدامها لتطوير تشخيص غير جراحي ومفصل.
في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لاستخدام تقنيات التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة الجديدة في الجسم الحي كطريقة غير جراحية لتقييم مراحل تقدم NAFLD. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن إجراء التحليل الطولي لتنكس دهني الكبد وامتصاص الأنسجة الوظيفية ، وكذلك تقييم حجم الدم النسبي وقطر الوريد البابي وكثافة شبكة الأوعية الدموية ، وتطبيقه في نماذج الفئران لأمراض الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات من قبل موظفي BIOEMTECH وفقا للوائح الرعاية الأوروبية والوطنية وتمت الموافقة عليها من قبل السلطات الوطنية (رقم الترخيص EL 25 BIOexp 45 / PN 49553 21/01/20). تم تصميم جميع التجارب والإبلاغ عنها مع الالتزام بإرشادات REACH26. تم شراء الفئران من معهد باستور اليوناني ، أثينا ، اليونان.
ملاحظة: تم إيواء الحيوانات بشكل جماعي في أقفاص جيدة التهوية غنية بقضبان وأنابيب من الورق المقوى في غرفة عند 20-22 درجة مئوية ، مع رطوبة نسبية تتراوح بين 50٪ و 60٪ ودورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة (الضوء 07:00 صباحا - 07:00 مساء). تم استخدام مزيج من نظام غذائي عالي الدهون (HFD) وشراب الذرة عالي الفركتوز (HFCS) ، وهو محلي يحتوي على الفركتوز والجلوكوز يستخدم على نطاق واسع في الأنواع الحديثة من الأنظمة الغذائية الغنية بالدهون ، للحث على NAFLD كنموذج موثوق بهمعترف به 27،28،29،30. في عمر 7-8 أسابيع ، تم منح ذكور الفئران C57BL / 6 إمكانية الوصول إلى نظام غذائي عادي (ن = 2) مع 10٪ من السعرات الحرارية من الدهون أو HFD (ن = 2) يحتوي على 60٪ من السعرات الحرارية من الدهون المكملة ب 5٪ HFCS في الماء لمدة 22 أسبوعا. تم الحصول على وزن الجسم أسبوعيا باستخدام ميزان رقمي ، وخلال الفترة التجريبية ، تمت مراقبة رعاية الحيوان في أيام بديلة باستخدام ورقة النتائج. في نهاية بروتوكول التصوير ، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
1. إعداد الحيوان
ملاحظة: يتم تلخيص بروتوكول التصوير في الشكل 1.
- تخدير الماوس باستخدام 3٪ -4٪ إيزوفلوران (في هواء الغرفة) ، والحفاظ على درجة حرارة جسمه باستخدام وسادة تدفئة مخصصة.
ملاحظة: يجب استخدام عدم وجود منعكس سحب الدواسة لتأكيد عمق التخدير الكافي قبل بدء الفحص. - ضع مرهما للعيون على عيون الحيوان قبل التجربة.
- ضع الحيوان في مهد الماسح الضوئي بالأشعة المقطعية ، وقم بتأمين مخروط الأنف ، وانتقل إلى 1.5٪ -3٪ إيزوفلوران (في هواء الغرفة) للصيانة.
ملاحظة: يجب استخدام عدم وجود منعكس سحب الدواسة لتأكيد النسبة المئوية المناسبة من الأيزوفلوران للحفاظ على التخدير. - مراقبة الماوس بشكل مستمر.
2. إعداد ما قبل المسح
ملاحظة: يتم إجراء التصوير على مرحلتين تجريبيتين للسماح بإزالة عامل التباين الأول بشكل كاف من الدورة الدموية والأنسجة. يتم إعطاء eXIA (عامل التباين الأول) في المرحلة الأولى و ExiTron (عامل التباين الثاني) في المرحلة الثانية ، كما هو موضح في قسم "سير عمل التصوير" (القسم 3) أدناه.
- اسمح لعامل التباين (إما eXIA أو ExiTron ، اعتمادا على المرحلة التجريبية) بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات.
- اضبط معلمات المسح التالية على ماسح التصوير المقطعي المحوسب: بروتوكول عالي الدقة تحت جهد أنبوب 50 كيلو فولت وتيار 460 μA ، غير حلزوني ، 720 إسقاط / دوران ، أربع دورات ، ووقت اكتساب 4 دقائق.
3. سير عمل التصوير
- المرحلة التجريبية 1
- احسب وقم بإعداد حجم عامل التباين الأول الذي سيتم إعطاؤه بجرعة غير مخففة تبلغ 6 ميكرولتر / جم من وزن الجسم للحصول على أقصى تباين.
- قم بإعداد قسطرة الوريد الذيل عن طريق ملئها بالمحلول الملحي وتوصيلها بالمحقنة المملوءة بعامل التباين.
- احصل على فحص الجسم كله (WB) والكبد الأساسي قبل التباين.
- تأكد من عدم وجود فقاعات أو انسداد في المحقنة أو القسطرة.
- أدخل القسطرة المملوءة مسبقا في الوريد الذيلي ، وقم بتطبيق عامل التباين عن طريق حقنة يتم إجراؤها ببطء ويدويا ، لمدة 1-3 دقائق (وليس كحقن بلعة). يمكن استخدام مضخة حقنة عند ضبطها على معدل التسريب المناسب.
ملاحظة: يمكن وضع ذيل الحيوان في ماء فاتر للحث على توسع الأوعية والمساعدة في إدخال القسطرة - الحصول على مسح WB والكبد في نقاط زمنية مختلفة ، كما هو موضح في الجدول 1.
ملاحظة: إذا لم يكن الحصول على جميع النقاط ممكنا ، فيجب التركيز على 45 دقيقة بعد الحقن (PI) ، وهي نقطة الحد الأقصى لامتصاص الكبد ، و 48 ساعة PI ، وهي عندما يتم تحقيق الخلوص.
- المرحلة التجريبية 2
- قم بإعداد الماوس مرة أخرى كما هو موضح في القسم 1 لإدارة عامل التباين الثاني بعد 10 أيام من القراءة النهائية باستخدام عامل التباين الأول (48 h PI).
- قم بتنفيذ الخطوات من 2.1 إلى 2.2.
- احسب واعد حجم عامل التباين الثاني الذي سيتم إعطاؤه بجرعة غير مخففة تبلغ 8 ميكرولتر / جم من وزن الجسم للحصول على أقصى تباين.
- قم بإعداد قسطرة الوريد الذيل عن طريق ملئها بالمحلول الملحي وتوصيلها بالمحقنة المملوءة بعامل التباين.
- احصل على فحص توازن الدم الأبيض والكبد الأساسي قبل التباين لتقييم حجم الدم النسبي وتنكس دهني الكبد.
- تأكد من عدم اكتشاف أي تباين في الفحص كمؤشر على الخلوص الكامل لعامل التباين الأول.
- أدخل القسطرة المملوءة مسبقا في الوريد الذيلي ، وقم بتطبيق عامل التباين عن طريق الحقن في الوريد الذي يتم إجراؤه ببطء ويدويا ، لمدة 1-3 دقائق (وليس كحقن بلعة). يمكن استخدام مضخة حقنة عند ضبطها على معدل التسريب المناسب.
- الحصول على مسح WB والكبد في نقاط زمنية مختلفة ، كما هو موضح في الجدول 1.
ملاحظة: يتم الحصول على عمليات مسح WB في 10 دقائق و 4 ساعات PI. يسمح الفاصل الزمني الكبير بينهما بتقييم التوزيع البيولوجي للمقتفي في الجسم وكذلك إزالته النسبية.
4. استخراج البيانات وتحليلها
ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم توفير خطوات استخراج البيانات وتحليلها بناء على برنامج معالجة تصوير محدد (انظر جدول المواد). قد تحتاج الخطوات الموضحة إلى التكيف عند استخدام برامج مختلفة.
- تقييم ترسب الدهون الكبدية / تنكس دهني.
ملاحظة: لتقييم التنكس الدهني الكبدي ، لا يتم استخدام عامل تباين ، ويتم إجراء مقارنة بين السيطرة وعلم الأمراض. بسبب الانحرافات العالية نسبيا في خصائص توهين الأنسجة بين الفئران المختلفة ، يتم تطبيع قيم الكثافة للكبد مقابل الطحال (الأنسجة الخالية من الدهون) والدهون (الأنسجة الدهنية المطلقة) وفقا للمعادلة التالية وكما هو موضح سابقا25:
- لإجراء التحليل ، قم بتحميل ملف DICOM لفحص ما قبل التباين ، واضبط الشريط / التباين لرؤية الكبد والطحال والأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) بوضوح.
- قم بالوصول إلى أداة مشغل النمذجة عبر القائمة المنسدلة للأداة على اللوحة الأمامية ، وحدد أداة 3D ROI.
- ضمن مشغل 3D ROI ، حدد إضافة عائد استثمار لتوليد عائد استثمار متعدد (حتى ثمانية لكل نسيج) لإجراء أخذ العينات في المناطق التي يظهر فيها الكبد (يفضل أن يكون ذلك في مناطق الفص الإنسي الأيسر والفص الإنسي الأيمن والفص الجانبي الأيسر) والطحال واضحا ، مع عدم وجود أوعية دموية ودهون واضحة.
ملاحظة: بالنسبة إلى WAT ، يتم تحديد عائد الاستثمار في منتصف مستودع الأنسجة الدهنية الحشوية. المناطق الموصى بها موضحة في الشكل 2. يمكن أيضا تطبيق طرق التطبيع باستخدام نسبة الكبد / الطحال وبدون تضمين WAT كما هو محدد سابقا31. - ضمن ميزة وضع الطلاء ثلاثي الأبعاد و Erode / Dill ، حدد 2D ، واستخدم الواجهة التي تظهر لتحديد اسم ولون لكل عائد استثمار.
- استخدم أداة عائد استثمار طلاء Sphere بقطر 8 بكسل لرسم عائد الاستثمار 2D يدويا.
- قم بإجراء أخذ العينات عن طريق تقسيم عائد الاستثمار ثنائي الأبعاد في مناطق الاهتمام باستخدام أداة Cross Hair على المستوى العرضي ، كما هو موضح في الشكل 3A.
- انقر فوق النقطة المحددة في المستوى السهمي والإكليلي لإكمال تجزئة عائد الاستثمار 2D ، كما هو موضح في الشكل 3B.
- كرر العملية لتحديد بقية عائد الاستثمار.
ملاحظة: عند أخذ العينات ، تجنب المناطق الحدودية للأعضاء ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى حدوث ضوضاء ويؤثر على موثوقية قيمة وحدة Hounsfield (HU) المحسوبة لكل عائد استثمار. - بمجرد الرضا عن عائد الاستثمار المجزأ ، انتقل إلى التنقل ، وحدد إظهار الجدول لعرض جدول القياس الكمي الذي يحتوي على قيم HU المحسوبة لكل عائد استثمار.
ملاحظة: يتم سرد قيم الاهتمام في عمود "المتوسط" ، الذي يحتوي على قيم المتوسط العددي للفوكسل (HU) الواردة في عائد الاستثمار للأجهزة ذات الاهتمام. لاحظ قيم الاهتمام، أو احفظ الجدول بأكمله عن طريق تحديد تصدير الجدول. - احسب متوسط HU للكبد والطحال ووات ، وقم بتوصيل القيم في المعادلة أعلاه لحساب النسبة المئوية لدهون الكبد.
- امتصاص الأنسجة الوظيفية / نقل الدهون (كيلوميكرون) في الكبد
ملاحظة: يتم تحليل امتصاص الأنسجة الوظيفية / نقل الدهون (chylomicron) من الفحوصات المكتسبة في 45 دقيقة و 48 ساعة بعد ضخ عامل التباين الأول ، بناء على طريقة32 المنشورة مسبقا. يتم حساب التباين للأنسجة المختلفة والنقاط الزمنية باستخدام المعادلة أدناه:
العضو الكهروضوئي t i هو متوسط قيمة البكسل في العضو في الوقت t i (يتراوح من 0 h إلى 48 h) ، و PV organ t0 هو متوسط قيمة البكسل في العضو في الصورة بدون تباين.- لإجراء هذا التحليل ، قم بتحميل ملف فحص eXIA DICOM ، واضبط الشريط / التباين لرؤية الكبد والطحال والبطين الأيسر بوضوح.
- قم بالوصول إلى مشغل النمذجة عبر القائمة المنسدلة للأداة على اللوحة الأمامية ، وحدد أداة 3D ROI.
- ضمن عامل تشغيل عائد الاستثمار ثلاثي الأبعاد (3D)، حدد إضافة عائد استثمار لتقسيم عائد استثمار متعدد للكبد.
- ضمن ميزة وضع الطلاء ثلاثي الأبعاد والتآكل / التمدد ، استخدم أداة عائد استثمار طلاء Sphere بقطر 8 بكسل وتآكل −1.
ملاحظة: حدد عائد استثمار متعدد على الشرائح حيث يظهر كل عضو بوضوح. تجنب المناطق الحدودية ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى حدوث ضوضاء ويؤثر على موثوقية قيمة HU المحسوبة لكل عائد استثمار. سيؤدي ذلك إلى أخذ عينات من عائد استثمار 3D متعدد ، والذي يتوافق مع أحجام الأعضاء الصغيرة. - استخدم الواجهة التي تظهر لتحديد اسم ولون لكل عائد استثمار.
- بمجرد الرضا عن عائد الاستثمار المصمم ، انتقل إلى التنقل ، وحدد إظهار الجدول لعرض جدول القياس الكمي الذي يحتوي على قيم HU المحسوبة لكل عائد استثمار.
ملاحظة: يتم سرد قيم الاهتمام ضمن عمود "المتوسط" ، والذي يعرض قيم المتوسط العددي للفوكسل (HU) المضمنة في عائد الاستثمار. يتوافق متوسط قيمة HU لعائد الاستثمار لكل عضو مع الجهاز الكهروضوئي ti. لاحظ قيم الاهتمام، أو احفظ الجدول بأكمله عن طريق تحديد تصدير الجدول. - للحصول على الجهاز الكهروضوئي t0 ، كرر جميع الخطوات المذكورة أعلاه باستخدام ملف DICOM قبل التباين لحساب متوسط سطوع الكبد والطحال والبطين الأيسر قبل حقن عامل التباين.
- أدخل القيم في المعادلة أعلاه لاستخراج النسبة المئوية للتباين المقابلة لنقل امتصاص الأنسجة الوظيفية / الدهون (chylomicron).
- بنية وكثافة شبكة الأوعية الدموية الكبدية
ملاحظة: يعتمد تحليل بنية وكثافة شبكة الأوعية الدموية الكبدية على منهجية منشورة مسبقا33 ويتم إجراؤه على فحوصات الكبد التي تم الحصول عليها 10 دقائق PI من عامل التباين الثاني.- لإجراء هذا التحليل ، قم بتحميل ملف ExiTron scan DICOM ، واضبط الشريط / التباين لرؤية شبكة الأوعية الدموية للكبد بوضوح.
- قم بالوصول إلى مشغل النمذجة عبر القائمة المنسدلة للأداة على اللوحة الأمامية ، وحدد أداة 3D ROI.
- ضمن عامل تشغيل عائد الاستثمار ثلاثي الأبعاد ، حدد إضافة عائد استثمار لإنشاء عائد استثمار ثلاثي الأبعاد للكبد.
- ضمن ميزة وضع الطلاء ثلاثي الأبعاد والتآكل / التمدد ، حدد 3D.
ملاحظة: استخدم أداة عائد استثمار طلاء Sphere مع تآكل −1 لتحديد طبقات التجزئة عبر المستوى الإكليلي. يجب ضبط قطر أداة طلاء عائد الاستثمار وفقا لكل طبقة (لإضافة / حذف أي تحديدات voxel مطلوبة / غير مرغوب فيها). يوصى بتحديد حجم الكبد في البداية عبر المستوى الإكليلي ، ومن ثم يمكن استخدام المستويات المستعرضة والسهمية لتصحيح عائد الاستثمار. هذه العملية تتطلب الدقة. يجب أن يكون المستخدم حريصا جدا على عدم تضمين الأنسجة والأوعية والعظام الأخرى عند تقسيم كل طبقة من طبقات عائد الاستثمار مع ضمان تضمين جميع مناطق الكبد في عائد الاستثمار المحدد. لهذا السبب ، فإن التعرف على الحدود التشريحية للكبد أمر بالغ الأهمية. - بمجرد الرضا عن عائد الاستثمار الناتج للكبد ، قم بإجراء قطع لإزالة جميع voxels من بيانات الصورة التي لا تنتمي إلى عائد الاستثمار للكبد المجزأ في البداية. لهذا ، اختر عائد استثمار الكبد من محدد عائد الاستثمار ، وانقر على أيقونة إجراء القص . تزيل هذه العملية الخلفية وتترك عائد الاستثمار للكبد دون تغيير.
ملاحظة: على الرغم من أن وظائف التراجع / الإعادة قابلة للتطبيق على جميع العمليات التي يتم إجراؤها بموجب أداة 3D ROI ، إلا أنه لا يمكن التراجع عن إجراء قطع عائد الاستثمار. لذلك ، قبل هذا الإجراء ، قد يفكر المستخدم في حفظ عائد الاستثمار الأولي للكبد بتنسيق DICOM. - يشمل عائد الاستثمار الناتج للكبد شبكة الأوعية الدموية والأنسجة المحيطة بها ، والتي يجب إزالتها. لهذا ، أعد تعيين عائد الاستثمار للكبد بالنقر فوق الزر "إعادة تعيين مكنسة عائد الاستثمار ".
- استخدم الواجهة التي تظهر لنقل جميع وحدات بكسل عائد الاستثمار للكبد إلى الخلفية.
ملاحظة: سيظل عائد الاستثمار في الكبد موجودا بعد هذه العملية ، لكنه لن يحتوي على أي فوكسل. - لإعادة تقسيم عائد الاستثمار للكبد بحيث يحتوي فقط على وحدات البكسل المرتبطة بالأوعية الدموية ، انتقل إلى خوارزميات التجزئة المشار إليها برمز العصا السحرية ، وحدد عتبة متصلة.
- حدد عائد الاستثمار كناتج والخلفية كمدخلات من القائمة المنسدلة للإدخال قبل تطبيق الحد.
- قم بتعيين العتبات بالنقر فوق رمزي الحد الأدنى والحد الأقصى على يسار كل حقل عتبة لملء القيم القصوى والدنيا والحصول على شبكة الأوعية الدموية.
ملاحظة: سيتم تضمين وحدات البكسل فقط ضمن النطاق المحدد في عائد الاستثمار الناتج. يضمن ضبط قيم العتبة بين الحيوانات المختلفة أخذ نفس المناطق التشريحية في الاعتبار فيما يتعلق بالكمية الدقيقة لعامل التباين الذي يتم حقنه في كل. هذا ثابت بين الأنسجة المختارة حتى لو كانت القيم العددية غير متطابقة. - استخدم أداة Cross Hair للنقر على نقطة تظهر فيها شبكة الأوعية الدموية واضحة ، وانقر فوق Apply لإجراء التجزئة.
- قم بتنشيط عارض الإسقاط الأقصى الكثافة (MIP).
- قم بتقييم عائد الاستثمار الناتج للكبد من حيث مدى وضوح شبكة الأوعية الدموية في عرض MIP.
- إذا بقي النسيج في أجزاء من عائد الاستثمار للكبد ، فكرر الخطوات 4.3.5-4.3.11 عن طريق ضبط قيمة الحد الأدنى حتى يمثل عائد الاستثمار للكبد المجزأ شبكة الأوعية الدموية بوضوح.
- بمجرد الرضا عن عائد الاستثمار الناتج للكبد ، قم بإنشاء جدول القياس الكمي الذي يحتوي على حجم عائد الاستثمار المحسوب للكبد بالمليمترات المكعبة.
ملاحظة: يتم سرد قيم الاهتمام في العمود "mm3" ، والذي يحتوي على قيمة الحجم العددية للفوكسل (HU) الموجودة في عائد الاستثمار للكبد. لاحظ قيم الاهتمام، أو احفظ الجدول بأكمله عن طريق تحديد تصدير الجدول.
- حجم الدم النسبي الكبدي
ملاحظة: لقياس حجم الدم النسبي الكبدي (rBV) ، والذي يرتبط بشكل كبير بكمية الأوعية الدموية المشكلة حديثا أثناء تطور التليف ، يتم استخدام فحوصات وفحوصات ما قبل التباين في 4 ساعات بعد حقن عامل التباين الثاني. يتم إجراء التحليل كما هو موضح سابقا34.- لإجراء هذا التحليل ، قم بتحميل ملف DICOM لفحص ExiTron ، واضبط الشريط / التباين.
ملاحظة: قم بتعطيل عارض MIP: ضمن التفضيلات ، حدد المربع لتعطيل عارض MIP عند التحميل. بالنسبة لمجموعات البيانات الكبيرة ، يمكن أن يؤدي ذلك إلى تحسين سرعة التحميل. - قم بالوصول إلى مشغل النمذجة عبر القائمة المنسدلة للأداة على اللوحة الأمامية ، وحدد أداة 3D ROI. توفر هذه الأداة خيارات متقدمة للرسم والتصور والحفظ والقياس الكمي لكل من مناطق 2D و 3D.
- ضمن عامل تشغيل عائد الاستثمار ثلاثي الأبعاد (3D ROI)، حدد إضافة عائد استثمار، وقم بتقسيم عائدي استثمار: أحدهما للكبد والآخر لوعاء دموي كبير.
- ضمن ميزة وضع الطلاء ثلاثي الأبعاد والتآكل / التمدد ، حدد 2D.
ملاحظة: يوصى باستخدام أداة عائد استثمار طلاء اسفير بقطر 8-10 بكسل للكبد و 4-6 بكسل للأوعية الدموية. ومع ذلك ، يمكن ضبط قطر أداة الطلاء اعتمادا على مدى صغر المساحة المراد تحديدها. - استخدم الواجهة التي تظهر لتحديد اسم ولون لكل عائد استثمار.
ملاحظة: حدد شريحتين إلى خمس شرائح من الأجزاء المركزية للأنسجة ذات الاهتمام ، وحدد طبقات التجزئة لتوليد 2D ROIs لكل نسيج. عند تحديد المناطق الموجودة على كل شريحة ، تجنب مناطق حدود الأعضاء ، كما هو موضح في الشكل 4 ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى حدوث ضوضاء ويؤثر على موثوقية قيمة HU المحسوبة لكل عائد استثمار. - بمجرد الرضا عن عائد الاستثمار المصمم ، انتقل إلى التنقل ، وحدد إظهار الجدول لعرض جدول القياس الكمي الذي يحتوي على قيم HU المحسوبة لكل عائد استثمار.
ملاحظة: يتم سرد قيم الاهتمام ضمن عمود "المتوسط" ، والذي يعرض قيم المتوسط العددي للفوكسل (HU) المضمنة في عائد الاستثمار. لاحظ قيم الاهتمام، أو احفظ الجدول بأكمله عن طريق تحديد تصدير الجدول. - كرر جميع الخطوات الخاصة بملف DICOM قبل التباين للحصول على متوسط سطوع الكبد قبل حقن عامل التباين. لهذا ، نفذ الخطوات 4.4.2-4.4.5 للكبد فقط.
- احسب متوسط قيم HU لكل نسيج في النقاط الزمنية المكافئة ، وأدخل القيم التي تم الحصول عليها في المعادلة أدناه:
ملاحظة: يعتبر الوعاء الدموي الكبير بعد حقن عامل التباين 100٪ rBV ، والكبد ، قبل إعطاء عامل التباين ، يعتبر 0٪ rBV.
- لإجراء هذا التحليل ، قم بتحميل ملف DICOM لفحص ExiTron ، واضبط الشريط / التباين.
- قطر الوريد البابي
ملاحظة: بالنسبة لقياسات قطر الوريد البابي ، يتم تحليل نفس الفحوصات المستخدمة لقياسات rBV الكبدية كما هو موضح سابقا35.- قم بتحميل ملف DICOM لفحص ExiTron ، واضبط الشريط / التباين.
- حدد المستويات المستعرضة المكونة من ثلاث إلى أربع شرائح فوق تقاطع الأوردة المساريقية والطحالية العلوية (الشكل 5).
- استخدم أداة المسطرة لقياس المسافة الدقيقة بين نقطتين (أي قطر منطقة الوريد الدائري).
ملاحظة: يتم استخراج المسافة على الصورة ، ولكن يمكن للمرء أيضا الانتقال إلى التنقل وتحديد إظهار الجدول لعرض جدول القياس الكمي الذي يحتوي على المسافة المحسوبة أو تحديد تصدير الجدول لحفظ النتيجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة التمثيلية ، أشار التصوير المقطعي المحوسب الدقيق بدون أي عامل تباين إلى نسبة أعلى من دهون الكبد في الفئران المصابة ب NAFLD مقارنة بالضوابط (الجدول 2) ، مما يؤكد علم الأمراض. باستخدام عامل التباين ExiTron وبنية شبكة الأوعية الدموية الكبدية وتحليل الكثافة الموصوف أعلاه ، تم العثور على كثافة الحجم الإجمالية لشبكة الأوعية الدموية الكبدية أعلى في الفئران المصابة ب NAFLD مقارنة بالضوابط الصحية (الشكل 6 ، الجدول 2). كان لدى الفئران المصابة ب NAFLD أيضا قطر وريد بابي أكبر مقارنة بالفئران الضابطة (الجدول 2) ، وهو تغيير هيكلي مرتبط بارتفاع ضغط الدم البابي أثناء أمراض الكبد34،36،37. وبالمثل ، تم حساب rBV الكبدي للحيوانات المصابة بمرض الكبد الدهني غير الكحولي ليكون أعلى مقارنة بالضوابط الصحية (الجدول 2).
علاوة على ذلك ، أشار تحليل مقايسة امتصاص الأنسجة الوظيفية إلى تراكم أعلى وإزالة أبطأ لعامل تباين eXIA في الفئران المصابة ب NAFLD مقارنة بالضوابط الصحية (الشكل 7). تشير هذه النتائج إلى أن خلايا الكبد الدهنية من المحتمل أن تخضع لمستويات عالية من التكاثر الخلوي الخلوي والتوزيع ، على الرغم من أنه مصحوب بانخفاض الهدم الأيضي أو الإزالة / الإفراز. بشكل عام ، تتوافق هذه النتيجة مع النمط الظاهري لانخفاض النشاط الأيضي الكبدي ، كما هو متوقع في حالة التسلل الدهني / NAFLD38,39.
الشكل 1: رسم تخطيطي يصور نظرة عامة على البروتوكول التجريبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: صور تمثيلية تسلط الضوء على المناطق المقترحة المستخدمة لإجراء أخذ العينات لتقسيم عائد الاستثمار ثنائي الأبعاد للكبد (الأحمر) والطحال (الأخضر) ووات (الأزرق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مثال تمثيلي لتجزئة عائد استثمار ثنائي الأبعاد لحساب التنكس الدهني . (أ) تستخدم أداة الشعر المتقاطع لتحديد عائد استثمار 2D على المنطقة المرغوبة من الكبد على المستوى المستعرض. (ب) تتكرر العملية على المستويين السهمي والإكليلي لإكمال تجزئة عائد الاستثمار 2D. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال تمثيلي لطبقة تجزئة لتوليد عائد استثمار للكبد 2D. يتم اختيار الأجزاء المركزية من العضو يدويا ، وتجنب المناطق الحدودية للتخلص من الضوضاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: منطقة محورية 2D. أمثلة تمثيلية للمنطقة المحورية 2D للشرائح المختلفة المختارة لقياس قطر الوريد البابي في الفئران مع NAFLD والضوابط الصحية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: بنية الشبكة الوعائية الكبدية. صور مستخرجة تمثيلية لبنية شبكة الأوعية الدموية الكبدية ، كما هو موضح من خلال تجزئة التصوير المقطعي المحوسب ، تم الحصول عليها من فأر تحكم (176.9 مم 3) وفأر مع NAFLD (390.3 مم3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: متوسط قيم التباين. بيانات مجمعة توضح متوسط قيم التباين ، والتي تمثل امتصاص الأنسجة الكبدية لأكثر من 48 ساعة بعد حقن eXIA في الفئران المصابة ب NAFLD (n = 2) والضوابط الصحية (n = 2). يتم التعبير عن جميع البيانات المجمعة كمتوسط ± الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| إكسيا | إكسيترون | |||
| النقطة الزمنية | مسح الجسم بالكامل | فحص الكبد | مسح الجسم بالكامل | فحص الكبد |
| ما قبل التباين | X | X | X | X |
| 10 دقائق PI | - | - | - | X |
| 15 دقيقة PI | O | O | - | - |
| 45 دقيقة PI | X | X | - | - |
| 2 ساعة PI | O | O | - | - |
| 4 ساعات PI | - | - | X | X |
| 24 ساعة PI | O | O | - | - |
| 48 ساعة PI | X | X | - | - |
الجدول 1: النقاط الزمنية للأشعة المقطعية. النقاط الزمنية المناسبة لمسح الجسم كله والكبد المكتسبة قبل وبعد الحقن (PI) من عوامل التباين. يشير X إلى عمليات الفحص الإلزامية ، - يشير إلى عدم وجود عمليات مسح ضوئي ، ويشير O إلى عمليات الفحص الاختيارية (الموصى بها ولكن ليست إلزامية).
| التحكم (ن = 1-2) | NAFLD (ن = 1-2) | |
| ٪ دهون الكبد | 2.4 ± 1.5٪ | 18.4 ± 3.1٪ |
| حجم شبكة الأوعية الدموية الكبدية | 176.9 مم3 | 390,3 مم3 |
| قطر الوريد البابي | 1.1 ملم | 1.4 ملم |
| حجم الدم النسبي الكبدي | ~ 54٪ | ~ 79٪ |
الجدول 2: نتائج تمثيلية تشير إلى الاختلافات في النسبة المئوية لدهون الكبد ، وحجم شبكة الأوعية الدموية الكبدية ، وقطر الوريد البابي ، وحجم الدم النسبي الكبدي بين الفئران المصابة ب NAFLD والضوابط الصحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الحالية الموصى بها لتشخيص NAFLD وتنظيمه في البشر هي خزعة الكبد ، والتي تؤوي خطر حدوث مضاعفات النزيف ، بالإضافة إلى عدم دقة أخذ العينات40. على العكس من ذلك ، في النماذج الحيوانية ، يتم إجراء هذا التشخيص عن طريق الأنسجة بعد الوفاة ، على الرغم من أن بروتوكولات خزعة الكبد القابلة للبقاء على قيد الحياة متاحة الآن ويوصى بها عندما يسمح تصميم الدراسةب 41. استخدام الأنسجة بعد الوفاة يعني أن هناك حاجة إلى عدد كبير من الحيوانات للتحقيق في تطور هذا المرض. على هذا النحو ، لا يمكن إجراء دراسة في نفس الحيوان أثناء تقدم المرض ؛ ومن المتوقع أيضا أن يكون التباين أعلى عند مقارنة العينات التي تم الحصول عليها في نقاط زمنية مختلفة من مختلفة. في هذه المقالة ، نقدم نهجا مبتكرا وغير جراحي في الجسم الحي للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، مطبقا في نموذج حيواني تجريبي راسخ ل NAFLD ، والذي يتيح التقييم الطولي لتطور المرض من خلال القياس الكمي للمعلمات الوظيفية ، وهي تنكس دهني الكبد وامتصاص الأنسجة الوظيفية ، وحجم الدم النسبي ، وقطر الوريد البابي ، وكثافة شبكة الأوعية الدموية ، في نفس الحيوان.
التصوير المقطعي المحوسب الدقيق هو حاليا طريقة التصوير غير الغازية القياسية الذهبية لتصوير المعلومات التشريحية بدقة داخل الكائن الحي. يتمتع التصوير المقطعي المحوسب الدقيق بالقدرة على الوصول إلى دقة مكانية عالية ، وبالتالي يمثل أداة قيمة لدراسة التفاصيل الدقيقة جدا في مجموعة واسعة من الأمراض. علاوة على ذلك ، فهي أداة سريعة وموثوقة لدراسة تطور المرض بمرور الوقت21،22،23،24 من خلال استغلال الخصائص الجوهرية للأشعة السينية دون التدخل في سلامة العينة المصورة. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذه التقنية في الأبحاث على الحيوانات في القدرة على استخدام مجموعة من عوامل التباين المختارة التي تدار دون أي مستحضرات معقدة (غير جراحية). يسمح ذلك باستخراج العديد من المعلمات من نفس الحيوان الممسوح ضوئيا طوليا أثناء تطور المرض ، مما يضمن أقصى قدر من الإنتاج والامتثال لإرشادات REACH و 3Rs26. علاوة على ذلك ، توفر الماسحات الضوئية micro-CT صورا عالية الدقة في أوقات اكتساب قصيرة جدا (مع فترات مسح لا تتجاوز بضع دقائق أو أقل) ، مع تفسير النتائج بتنسيقات 2D و 3D بسهولة نسبية (خاصة عند استخدام برامج سهلة الاستخدام ، كما هو مقترح هنا).
تم إجراء جميع عمليات المسح الموصوفة في هذا البروتوكول على ماسح ضوئي صغير للقوارض المقطعية (انظر جدول المواد). يقوم نظام التصوير المقطعي المحوسب بإجراء مسح حلزوني ، ويمكنه توفير صور بدقة 100 ميكرومتر. تعمل بين 35-80 كيلو فولت و 10-500 μA أنبوب الحالي. تستغرق عمليات الحصول على بيانات التصوير المقطعي المحوسب من 7 إلى 10 دقائق لكل مسح ويتم إعادة بنائها من خلال خوارزمية إعادة بناء مساحة الصورة (ISRA) بدقة مكانية تبلغ 100 ميكرومتر. يتم إجراء التصوير المقطعي المحوسب باستخدام المعلمات التالية: أ) بروتوكول عالي الدقة عند 50 كيلو فولت لمسح WB و ب) مسح محلي متعدد الدوران عالي الدقة عند 50 كيلو فولت لمسح الكبد المحلي. يتم إعداد جميع المعلمات في برنامج جهاز المسح الضوئي (انظر جدول المواد) المزود مع النظام باتباع الإرشادات الموجودة على واجهة المستخدم. يتم إجراء إعادة البناء من خلال خوارزمية Feldkamp و Davis و Kress (FDK) بحجم فوكسل يبلغ 0.1 مم. يتم تقليل القطع الأثرية المقطعية عن طريق معايرة أجهزة الكشف بشكل دوري والحفاظ على النظام جيدا من خلال الخدمات المناسبة. في حالة حدوث عيوب ، يمكن إلغاء الكاشف الإشكالي الذي يتسبب في ظهور الأداة الحلقية عن بعد وتصحيح الصورة.
تم تحسين البروتوكول الفني الموصوف باستخدام عوامل التباين eXIA و ExiTron ، والتي تم اختيارها بسبب تركيباتها الخاصة والحرائك الحيوية الزمنية في الأنسجة المختلفة. eXIA هو عامل تباين قابل للتحلل بالكامل يحتوي على 160 مجم / مل من اليود كعامل مخفف للأشعة السينية. بمجرد حقنه عن طريق الوريد ، يظهر عامل التباين هذا وقت بقاء الدم (مع تصفية نصف الوقت >30 دقيقة) ثم يتم تناوله بواسطة الأعضاء النشطة الأيضية مثل الكبد والطحال وعضلة القلب والأنسجة الدهنية البنية. وبالتالي ، فإن عامل التباين الأول مناسب للكشف غير الجراحي في الجسم الحي عن تشوهات الكبد والطحال ، واحتشاء عضلة القلب ، واعتلال عضلة القلب ، وكذلك لتحديد وقياس الأنسجة الدهنية البنية النشطة. ExiTron هو عامل تباين للجسيمات النانوية الأرضية القلوية من ~ 12000 HU كثافة غير مخففة42 ، والتي تم تصميمها خصيصا للتصوير المقطعي المحوسب قبل السريري. عند الحقن في الوريد ، يدور عامل التباين الثاني في مجرى الدم ، ويتم تناوله بواسطة خلايا الجهاز الشبكيالبطاني 43 ، بما في ذلك الضامة داخل الكبد.
هناك بعض القيود المرتبطة بالمنهجية المقترحة. لكي ينجح هذا البروتوكول ، لا ينبغي الكشف عن أي إشارة CT من عامل التباين الأول قبل إعطاء عامل التباين الثاني. تم اختيار الإطار الزمني المقترح في هذا البروتوكول بعد تجارب التحسين (واستنادا إلى دراسات أخرى)44 ، مما يشير إلى أن عامل التباين الأول لديه إزالة بطيئة. نظرا لأن عامل التباين الثاني لديه معدل تخليص أبطأ45,46 ، فيجب إعطاؤه ثانيا ، بعد التخليص الكامل لعامل التباين الأول. في الواقع ، لقد حددنا إزالة عامل التباين الأول لتكون مرضية بعد 12 يوما من الحقن. اعتمادا على مدة النموذج الحيواني المستخدم ، يمكن أن يسمح هذا المقياس الزمني بمقارنة نقطتين زمنيتين قد يكون مرض الكبد قد تقدم فيهما. بالنظر إلى أن بروتوكول التغذية المستخدم هنا يستغرق 22 أسبوعا ، فمن غير المتوقع أن يتسبب الفاصل الزمني البالغ 12 يوما في حدوث تغييرات كبيرة في تطور المرض. يطلب من المجرب إجراء التحقق والتحسين المناسبين قبل ضبط بروتوكول التصوير المقترح. يجب على المرء أيضا تقييم تحليل التكلفة والعائد للتقدم وإشارة الصورة قبل تغيير نوع وتركيز عوامل التباين المستخدمة ، وكذلك الإطار الزمني للإدارة.
بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تحمل كلا عاملي التباين إلا حتى حجم إجمالي محدد من الإدارة قبل الوصول إلى مستويات سامة للحيوان43. نظرا لحقيقة أن الحد الأقصى لحجم عامل التباين مطلوب لضمان التباين الأمثل ، بالاقتران مع معدل التخليص البطيء للعوامل ، يقترح الحقن لمرة واحدة لهذا التحليل. ويمكن أيضا استخدام الإدارات المتكررة لهذه العوامل أو غيرها من عوامل التباين البديلة المناسبة لإجراء تجارب مختلفة، طالما ظل الحجم الإجمالي لعامل التباين أقل من الحد الموصى به في أي نقطة زمنية معينة. مطلب آخر للتصوير الناجح باستخدام بروتوكول التصوير المقطعي المحوسب الدقيق هذا هو الإدارة الصحيحة لعوامل التباين. كما هو مذكور في البروتوكول ، يجب على المجرب ضمان ضخ بطيء للعامل بالجرعة المناسبة مباشرة في مجرى الدم عبر الوريد ، دون أي فقاعات. سيؤدي عدم القيام بذلك إلى الإضرار بدقة التصوير والمخرجات. لذلك ، فإن اختيار الجرعة المثلى وطرق الإدارة المناسبة (التسريب والمدة بين العوامل المختلفة) يقلل من خطر السمية والقيود المرتبطة بها في التصوير المقطعي.
للمسح في نقاط زمنية متعددة ، يجب الانتباه إلى إبقاء مدة التخدير قصيرة قدر الإمكان. نظرا لأن التصوير المقطعي المحوسب يستغرق بضع دقائق فقط حتى يكتمل ، يمكن عكس التخدير بين بعض الفحوصات لتقليل المخاطر المرتبطة بفترات التخدير الطويلة. تحريض التخدير المتكرر له مخاطر أيضا. ومع ذلك ، فإن وضع الحيوانات على وسادة ساخنة بين عمليات المسح وضمان الترطيب الكافي يساعد في التعافي والحفاظ على علم وظائف الأعضاء. علاوة على ذلك ، فإن التعرض للإشعاع المؤين المنبعث من الأشعة السينية كاف للتأثير على بيولوجيا الأعضاء والخلايا ، مما يجعل هذا ضارا بالحيوانات ، وبالتالي يؤدي إلى بيانات تجريبية متحيزةومضللة 22. نظرا لأن الجرعة المتوقعة التي سيتم تسليمها لكل فحص تبلغ حوالي 385 ملي جراي ، يمكن للفئران التي تتلقى عمليات مسح متعددة أثناء الدراسة تلقي ما يصل إلى 1.8 جراي أو أكثر. هذه جرعة إشعاعية كبيرة للفئران يمكن أن يكون لها آثار ضارة محتملة على بيولوجيا أنسجتها. هذا أمر مثير للقلق بشكل خاص لأن زيادة الجرعة مطلوبة عند تقليل تباعد الفوكسل الخواص مع الحفاظ على نفس جودة الصورة22.
فيما يتعلق بالمعالجة اللاحقة للصور باستخدام البرنامج الموصى به (انظر جدول المواد) ، يتم إنشاء أقنعة التجزئة باستخدام مزيج من أدوات زراعة المنطقة والعتبة ، وهذه هي الخطوة الأكثر استهلاكا للوقت في التحليل. في بعض الحالات ، يجب إجراء تعديلات يدوية للتجزئة التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة التنعيم. لتحسين خصائص الحفاظ على الحافة وتقليل الضوضاء للشبكة المطلوبة ، نوصي باستخدام مرشح Gaussian بقيمة 0.3. يتم عرض الصور التمثيلية لمثل هذه الشبكة الوعائية في الشكل 6 (بعد المعالجة باستخدام عارض صور طبي DICOM مفتوح الوصول). القيد الرئيسي من حيث قياس شبكة الأوعية الدموية هو أن البرنامج ليس لديه القدرة على فصل عائد الاستثمار المحدد المحدد بدقة (والذي يمثل شبكة الأوعية الدموية للكبد) عن الخلفية (التي تمثل أنسجة الكبد المحيطة) ؛ لذلك ، يجب اختيار العتبة المناسبة من خلال التجربة والخطأ. في البداية ، يحدد المستخدم قيمة عتبة أقل تبلغ 600 HU وبحد أقصى 10000 HU. إذا كانت شبكة الأوعية الدموية المستخرجة والانفصال عن الأنسجة المحيطة غير مقبولة ، ضبط القيمة الأقل عن طريق التجربة والخطأ بعد التغييرات التدريجية من 50-100 HU. يتم تكرار العملية من قبل المستخدم حتى يتم فصل شبكة الأوعية الدموية بشكل كاف عن الأنسجة.
في الختام ، فإن فهم تكيفات شبكة الأوعية الدموية الكبدية أثناء تطور NAFLD وربطها بطرق أخرى لتوصيف المرض باستخدام الطريقة المقترحة يمكن أن يمهد الطريق نحو إنشاء مناهج جديدة وأكثر كفاءة وقابلة للتكرار لأبحاث NAFLD في الفئران. ومن المتوقع أيضا أن يؤدي هذا البروتوكول إلى رفع قيمة النماذج الحيوانية قبل السريرية للتحقيق في تطوير علاجات جديدة ضد تطور المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار (# 3222 إلى AC.). يتم تمويل آنا حاجيهامبي من قبل معهد روجر ويليامز لأمراض الكبد ، مؤسسة أبحاث الكبد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| eXIA160 | Binitio Biomedical, Inc. | https://www.binitio.com/?Page=Products | |
| High fat diet with 60% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12492 | |
| High-fructose corn syrup | Best flavors, CA | hfcs-1gallon | |
| Lacrinorm ophthalmic ointment | Bausch & Lomb | ||
| Normal diet with 10% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12450 | |
| Viscover ExiTron nano 12000 | Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-698 | |
| VivoQuant | Invicro | ||
| X-CUBE | Molecubes, Belgium | https://www.molecubes.com/systems/ |
References
- Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
- Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
- Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
- Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467 (2021).
- Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
- Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
- Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51 (2017).
- Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
- Koyama, Y., Brenner, D. A.
- Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511 (2022).
- Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
- Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
- Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
- Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
- Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis - current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
- Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
- Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
- Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181 (2010).
- Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
- Feng, J., et al.
- Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
- Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178 (2015).
- Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
- Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026 (2012).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410 (2020).
- Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
- Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991 (2015).
- Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
- Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
- Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085 (2016).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
- Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626 (2013).
- Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68 (2022).
- Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6 (2010).
- Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
- Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751 (2022).
- Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130 (2019).
- Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
- Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
