Summary

Новые методы микрокомпьютерной томографии in vivo для оценки прогрессирования неалкогольной жировой болезни печени

Published: March 24, 2023
doi:

Summary

Используя модель мышей с неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), вызванной диетой, мы описали использование новых методов микрокомпьютерной томографии in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП, уделяя особое внимание сосудистой сети печени из-за ее значительного участия в дисрегуляции печени, связанной с НАЖБП.

Abstract

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является растущей глобальной проблемой здравоохранения, и воздействие НАЖБП усугубляется отсутствием эффективных методов лечения. Существенными ограничивающими факторами, препятствующими своевременной и точной диагностике (включая классификацию) и мониторингу НАЖБП, а также разработке потенциальных методов лечения, являются существующие недостатки в характеристике структуры микроокружения печени и оценке стадии заболевания пространственно-временным и неинвазивным способом. Используя модель мышей с НАЖБП, индуцированной диетой, мы исследовали использование методов микрокомпьютерной томографии (КТ) in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП, уделяя особое внимание сосудистой сети печени из-за ее значительного участия в дисрегуляции печени, связанной с НАЖБП. Эта методика визуализации позволяет проводить лонгитюдный анализ стеатоза печени и функционального поглощения тканей, а также оценивать относительный объем крови, диаметр воротной вены и плотность сосудистой сети. Понимание адаптации сосудистой сети печени во время прогрессирования НАЖБП и соотнесение этого с другими способами характеристики прогрессирования заболевания (стеатоз, воспаление, фиброз) с использованием предложенного метода может проложить путь к созданию новых, более эффективных и воспроизводимых подходов к исследованию НАЖБП на мышах. Ожидается, что этот протокол также повысит ценность доклинических моделей на животных для исследования разработки новых методов лечения прогрессирования заболевания.

Introduction

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) — это метаболическое заболевание, которое поражает примерно 25% населения и >80% людей с морбидныможирением1. По оценкам, у одной трети этих людей прогрессирует неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), который характеризуется стеатозом печени, воспалением и фиброзом2. НАСГ – стадия заболевания со значительно более высоким риском развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК)3,4. По этой причине НАСГ в настоящее время является второй наиболее распространенной причиной трансплантации печени, и ожидается, что в скором времени он также станет наиболее важным предиктором трансплантации печени 5,6,7. Несмотря на распространенность и тяжесть заболевания, для НАЖБП не существует специфической терапии, а существующие методы лечения направлены только на борьбу с ассоциированными с заболеванием патологиями, такими как резистентность к инсулину и гиперлипидемия 5,6.

В последние годы патофизиологическая роль и адаптации эндотелия и, в целом, сосудистой сети метаболических тканей, таких как жировая ткань и печень, приобретают все большее значение в исследованиях, особенно при ожирении и метаболической дисрегуляции 7,8. Эндотелий представляет собой клеточный монослой, который выстилает сосудистую сеть изнутри, действуя как функциональный и структурный барьер. Он также способствует различным физиологическим и патологическим процессам, таким как тромбоз, транспорт метаболитов, воспаление и ангиогенез 9,10. В случае печени сосудистая сеть, среди прочих особенностей, характеризуется наличием высокоспециализированных клеток, определяемых как синусоидальные эндотелиальные клетки печени (ЛСЕК). Эти клетки не имеют базальной мембраны и имеют несколько фенестр, что облегчает перенос субстратов между кровью и паренхимой печени. Благодаря своему уникальному анатомическому расположению и характеристикам, LSEC, вероятно, играют решающую роль в патофизиологических процессах печени, включая развитие воспаления и фиброза печени во время НАЖБП/НАСГ. Действительно, патологические, молекулярные и клеточные адаптации, которые ЛСЕК претерпевают в ходе НАЖБП, способствуют прогрессированиюзаболевания11. В частности, LSEC-зависимый печеночный ангиогенез, происходящий во время НАЖБП, в значительной степени связан с развитием воспаления и прогрессированием заболевания до НАСГ или даже ГЦК12. Кроме того, ранняя НАЖБП, связанная с ожирением, характеризуется развитием инсулинорезистентности в ЛЖБП, что предшествует развитию воспаления печени или других распространенных признаков НАЖБП13.

Кроме того, в последнее время LSEC стали центральными регуляторами печеночного кровотока и адаптации сосудистой сети при заболеваниях печени различной этиологии14,15. Действительно, хроническое заболевание печени характеризуется выраженной внутрипеченочной вазоконстрикцией и повышенным сопротивлением кровотоку, что способствует развитию портальной гипертензии16. В случае с НАЖБП этому явлению способствуют несколько механизмов, связанных с LSEC. Например, инсулинорезистентность, специфичная для LSEC, как упоминалось выше, связана со снижением инсулинозависимой вазодилатации сосудистой сети печени13. Кроме того, в течение заболевания сосудистая сеть печени становится более чувствительной к сосудосуживающим средствам, что в дальнейшем способствует нарушению печеночного кровотока и приводит к возникновению сдвигового напряжения, что приводит к нарушению синусоидальной микроциркуляции17. Эти факты свидетельствуют о том, что сосудистая сеть является ключевой мишенью при заболеваниях печени. Тем не менее, ограничивающими факторами, препятствующими своевременной диагностике и мониторингу НАЖБП/НАСГ, а также разработке потенциальных методов лечения, являются недостатки в последовательной характеристике микроокружения печени и (микро)сосудистой структуры, а также в оценке стадии заболевания пространственно-временным и неинвазивным способом.

Микрокомпьютерная томография (КТ) в настоящее время является золотым стандартом неинвазивного метода визуализации для точного отображения анатомической информации в живом организме. Микро-КТ и МРТ представляют собой два взаимодополняющих метода визуализации, которые могут охватить широкий спектр патологий и обеспечить исключительное разрешение и детализацию визуализируемых структур и тканей. Микро-КТ, в частности, является очень быстрым и точным инструментом, который часто используется для изучения таких патологий, как заболевания костей и связанные с ними изменения костной поверхности18, оценки прогрессирования фиброза легких с течением времени19, диагностики рака легких и его стадии20 или даже исследования стоматологических патологий21 без какой-либо специальной подготовки (или разрушения) визуализируемых образцов.

Технология визуализации микро-КТ основана на различных свойствах затухания различных органов с точки зрения взаимодействия рентгеновских лучей с веществом. Органы с высокими различиями в ослаблении рентгеновского излучения изображаются на КТ-изображениях с высокой контрастностью (т.е. легкие кажутся темными, а кости светлыми). Органы, обладающие очень похожими свойствами ослабления (разные мягкие ткани), трудно различимы на КТ-изображениях22. Чтобы устранить это ограничение, специализированные контрастные вещества на основе йода, золота и висмута были широко исследованы для использования in vivo . Эти агенты изменяют свойства ослабления тканей, в которых они накапливаются, медленно выводятся из кровообращения и обеспечивают равномерное и стабильное помутнение всей сосудистой системы или выбранных тканей23.

В диагностике человека для определения содержания жира в печени уже используются компьютерная томография и аналогичные методы, такие как МРТ-измерение протонной плотности жировой фракции24,25. В контексте НАЖБП высокий контраст мягких тканей необходим для точного различения патологических поражений или мелких сосудов. Для этого используются контрастные вещества, обеспечивающие повышенное контрастирование характеристик печеночной ткани. Такие инструменты и материалы позволяют изучать множественные характеристики печени и возможные проявления патологии, такие как архитектура и плотность сосудистой сети, отложение липидов/стеатоз и функциональный захват тканей/перенос липидов (хиломикрон) в печени. Кроме того, можно оценить относительный объем крови в печени и диаметр воротной вены. За очень короткое время сканирования все эти параметры предоставляют различную и дополняющую информацию об оценке и прогрессировании НАЖБП, которая может быть использована для разработки неинвазивной и детальной диагностики.

В данной статье мы приводим пошаговый протокол использования новых методов микро-КТ визуализации in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП. Используя этот протокол, можно провести продольный анализ стеатоза печени и функционального поглощения тканей, а также оценить относительный объем крови, диаметр воротной вены и плотность сосудистой сети, которые могут быть применены на мышиных моделях заболеваний печени.

Protocol

Все процедуры были проведены персоналом BIOEMTECH в соответствии с европейскими и национальными нормами благосостояния и были одобрены национальными органами (номер лицензии EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Все эксперименты были спланированы и представлены в соответствии с руководящими принципами П…

Representative Results

В этом репрезентативном исследовании микро-КТ без какого-либо контрастного вещества показала более высокий процент жира в печени у мышей с НАЖБП по сравнению с контрольной группой (табл. 2), что подтверждает патологию. С помощью контрастного вещества ExiTron и описанного выше анал…

Discussion

В настоящее время рекомендуемым методом диагностики и определения стадии НАЖБП у людей является биопсия печени, которая таит в себе риск осложнений кровотечения, а также неточностей отбора проб40. Напротив, на животных моделях такой диагноз ставится путем гистологическог?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com. Эта работа была поддержана Греческим фондом исследований и инноваций (#3222 to A.C.). Анна Хаджихамби финансируется Институтом гепатологии Роджера Уильямса, Фондом исследований печени.

Materials

eXIA160 Binitio Biomedical, Inc. https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fat Research Diets, New Brunswick, NJ, USA D12492
High-fructose corn syrup  Best flavors, CA hfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment  Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat  Research Diets, New Brunswick, NJ, USA D12450
Viscover ExiTron nano 12000  Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 130-095-698
VivoQuant Invicro
X-CUBE  Molecubes, Belgium https://www.molecubes.com/systems/

References

  1. Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
  2. Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
  3. Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
  4. Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467 (2021).
  5. Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
  6. Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
  7. Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51 (2017).
  8. Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
  9. Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  10. Koyama, Y., Brenner, D. A. Liver inflammation and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 55-64 (2017).
  11. Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511 (2022).
  12. Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
  13. Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
  14. Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
  15. Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
  16. Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis – current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
  17. Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
  18. Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
  19. Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181 (2010).
  20. Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
  21. Feng, J., et al. Abnormalities in the enamel in bmp2-deficient mice. Cells, Tissues, Organs. 194 (2-4), 216-221 (2011).
  22. Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
  23. Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178 (2015).
  24. Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
  25. Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026 (2012).
  26. Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410 (2020).
  27. Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
  28. Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991 (2015).
  29. Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
  30. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease – A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  31. De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
  32. Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
  33. Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085 (2016).
  34. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
  35. Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626 (2013).
  36. Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68 (2022).
  37. Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6 (2010).
  38. Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
  39. Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751 (2022).
  40. Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
  41. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130 (2019).
  42. Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
  43. Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
  44. Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
  45. Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
  46. Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).

Play Video

Cite This Article
Hadjihambi, A., Velliou, R., Tsialios, P., Legaki, A., Chatzigeorgiou, A., Rouchota, M. G. Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. J. Vis. Exp. (193), e64838, doi:10.3791/64838 (2023).

View Video