Summary
Используя модель мышей с неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), вызванной диетой, мы описали использование новых методов микрокомпьютерной томографии in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП, уделяя особое внимание сосудистой сети печени из-за ее значительного участия в дисрегуляции печени, связанной с НАЖБП.
Abstract
Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является растущей глобальной проблемой здравоохранения, и воздействие НАЖБП усугубляется отсутствием эффективных методов лечения. Существенными ограничивающими факторами, препятствующими своевременной и точной диагностике (включая классификацию) и мониторингу НАЖБП, а также разработке потенциальных методов лечения, являются существующие недостатки в характеристике структуры микроокружения печени и оценке стадии заболевания пространственно-временным и неинвазивным способом. Используя модель мышей с НАЖБП, индуцированной диетой, мы исследовали использование методов микрокомпьютерной томографии (КТ) in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП, уделяя особое внимание сосудистой сети печени из-за ее значительного участия в дисрегуляции печени, связанной с НАЖБП. Эта методика визуализации позволяет проводить лонгитюдный анализ стеатоза печени и функционального поглощения тканей, а также оценивать относительный объем крови, диаметр воротной вены и плотность сосудистой сети. Понимание адаптации сосудистой сети печени во время прогрессирования НАЖБП и соотнесение этого с другими способами характеристики прогрессирования заболевания (стеатоз, воспаление, фиброз) с использованием предложенного метода может проложить путь к созданию новых, более эффективных и воспроизводимых подходов к исследованию НАЖБП на мышах. Ожидается, что этот протокол также повысит ценность доклинических моделей на животных для исследования разработки новых методов лечения прогрессирования заболевания.
Introduction
Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) — это метаболическое заболевание, которое поражает примерно 25% населения и >80% людей с морбидныможирением1. По оценкам, у одной трети этих людей прогрессирует неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), который характеризуется стеатозом печени, воспалением и фиброзом2. НАСГ – стадия заболевания со значительно более высоким риском развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК)3,4. По этой причине НАСГ в настоящее время является второй наиболее распространенной причиной трансплантации печени, и ожидается, что в скором времени он также станет наиболее важным предиктором трансплантации печени 5,6,7. Несмотря на распространенность и тяжесть заболевания, для НАЖБП не существует специфической терапии, а существующие методы лечения направлены только на борьбу с ассоциированными с заболеванием патологиями, такими как резистентность к инсулину и гиперлипидемия 5,6.
В последние годы патофизиологическая роль и адаптации эндотелия и, в целом, сосудистой сети метаболических тканей, таких как жировая ткань и печень, приобретают все большее значение в исследованиях, особенно при ожирении и метаболической дисрегуляции 7,8. Эндотелий представляет собой клеточный монослой, который выстилает сосудистую сеть изнутри, действуя как функциональный и структурный барьер. Он также способствует различным физиологическим и патологическим процессам, таким как тромбоз, транспорт метаболитов, воспаление и ангиогенез 9,10. В случае печени сосудистая сеть, среди прочих особенностей, характеризуется наличием высокоспециализированных клеток, определяемых как синусоидальные эндотелиальные клетки печени (ЛСЕК). Эти клетки не имеют базальной мембраны и имеют несколько фенестр, что облегчает перенос субстратов между кровью и паренхимой печени. Благодаря своему уникальному анатомическому расположению и характеристикам, LSEC, вероятно, играют решающую роль в патофизиологических процессах печени, включая развитие воспаления и фиброза печени во время НАЖБП/НАСГ. Действительно, патологические, молекулярные и клеточные адаптации, которые ЛСЕК претерпевают в ходе НАЖБП, способствуют прогрессированиюзаболевания11. В частности, LSEC-зависимый печеночный ангиогенез, происходящий во время НАЖБП, в значительной степени связан с развитием воспаления и прогрессированием заболевания до НАСГ или даже ГЦК12. Кроме того, ранняя НАЖБП, связанная с ожирением, характеризуется развитием инсулинорезистентности в ЛЖБП, что предшествует развитию воспаления печени или других распространенных признаков НАЖБП13.
Кроме того, в последнее время LSEC стали центральными регуляторами печеночного кровотока и адаптации сосудистой сети при заболеваниях печени различной этиологии14,15. Действительно, хроническое заболевание печени характеризуется выраженной внутрипеченочной вазоконстрикцией и повышенным сопротивлением кровотоку, что способствует развитию портальной гипертензии16. В случае с НАЖБП этому явлению способствуют несколько механизмов, связанных с LSEC. Например, инсулинорезистентность, специфичная для LSEC, как упоминалось выше, связана со снижением инсулинозависимой вазодилатации сосудистой сети печени13. Кроме того, в течение заболевания сосудистая сеть печени становится более чувствительной к сосудосуживающим средствам, что в дальнейшем способствует нарушению печеночного кровотока и приводит к возникновению сдвигового напряжения, что приводит к нарушению синусоидальной микроциркуляции17. Эти факты свидетельствуют о том, что сосудистая сеть является ключевой мишенью при заболеваниях печени. Тем не менее, ограничивающими факторами, препятствующими своевременной диагностике и мониторингу НАЖБП/НАСГ, а также разработке потенциальных методов лечения, являются недостатки в последовательной характеристике микроокружения печени и (микро)сосудистой структуры, а также в оценке стадии заболевания пространственно-временным и неинвазивным способом.
Микрокомпьютерная томография (КТ) в настоящее время является золотым стандартом неинвазивного метода визуализации для точного отображения анатомической информации в живом организме. Микро-КТ и МРТ представляют собой два взаимодополняющих метода визуализации, которые могут охватить широкий спектр патологий и обеспечить исключительное разрешение и детализацию визуализируемых структур и тканей. Микро-КТ, в частности, является очень быстрым и точным инструментом, который часто используется для изучения таких патологий, как заболевания костей и связанные с ними изменения костной поверхности18, оценки прогрессирования фиброза легких с течением времени19, диагностики рака легких и его стадии20 или даже исследования стоматологических патологий21 без какой-либо специальной подготовки (или разрушения) визуализируемых образцов.
Технология визуализации микро-КТ основана на различных свойствах затухания различных органов с точки зрения взаимодействия рентгеновских лучей с веществом. Органы с высокими различиями в ослаблении рентгеновского излучения изображаются на КТ-изображениях с высокой контрастностью (т.е. легкие кажутся темными, а кости светлыми). Органы, обладающие очень похожими свойствами ослабления (разные мягкие ткани), трудно различимы на КТ-изображениях22. Чтобы устранить это ограничение, специализированные контрастные вещества на основе йода, золота и висмута были широко исследованы для использования in vivo . Эти агенты изменяют свойства ослабления тканей, в которых они накапливаются, медленно выводятся из кровообращения и обеспечивают равномерное и стабильное помутнение всей сосудистой системы или выбранных тканей23.
В диагностике человека для определения содержания жира в печени уже используются компьютерная томография и аналогичные методы, такие как МРТ-измерение протонной плотности жировой фракции24,25. В контексте НАЖБП высокий контраст мягких тканей необходим для точного различения патологических поражений или мелких сосудов. Для этого используются контрастные вещества, обеспечивающие повышенное контрастирование характеристик печеночной ткани. Такие инструменты и материалы позволяют изучать множественные характеристики печени и возможные проявления патологии, такие как архитектура и плотность сосудистой сети, отложение липидов/стеатоз и функциональный захват тканей/перенос липидов (хиломикрон) в печени. Кроме того, можно оценить относительный объем крови в печени и диаметр воротной вены. За очень короткое время сканирования все эти параметры предоставляют различную и дополняющую информацию об оценке и прогрессировании НАЖБП, которая может быть использована для разработки неинвазивной и детальной диагностики.
В данной статье мы приводим пошаговый протокол использования новых методов микро-КТ визуализации in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП. Используя этот протокол, можно провести продольный анализ стеатоза печени и функционального поглощения тканей, а также оценить относительный объем крови, диаметр воротной вены и плотность сосудистой сети, которые могут быть применены на мышиных моделях заболеваний печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были проведены персоналом BIOEMTECH в соответствии с европейскими и национальными нормами благосостояния и были одобрены национальными органами (номер лицензии EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Все эксперименты были спланированы и представлены в соответствии с руководящими принципами ПРИБК26. Мыши были приобретены в Греческом институте Пастера, Афины, Греция.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные содержались в индивидуально вентилируемых клетках, обогащенных рельсами и картонными тубами, в помещении при температуре 20-22 °C, относительной влажности 50%-60% и 12-часовом цикле свет/темнота (свет 07:00-19:00). Комбинация диеты с высоким содержанием жиров (HFD) и кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы (HFCS), фруктозо- и глюкозосодержащего подсластителя, широко используемого в современных типах диет, обогащенных жирами, была использована для индуцирования НАЖБП в качестве признанной надежной модели27,28,29,30. В возрасте 7-8 недель самцам мышей C57BL/6 предоставляли свободный доступ либо к нормальной диете (n = 2) с 10% килокалорий из жира, либо к HFD (n = 2), содержащей 60% килокалорий из жира с добавлением 5% HFCS в воде в течение 22 недель. Масса тела измерялась еженедельно с помощью цифровых весов, а в течение экспериментального периода за благополучием животных следили через день с помощью оценочного листа. В конце протокола визуализации мышей усыпили путем вывиха шейки матки.
1. Подготовка животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол визуализации представлен на рисунке 1.
- Обезболивайте мышь 3%-4% изофлураном (в комнатном воздухе) и поддерживайте температуру ее тела с помощью специальной грелки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие рефлекса отведения педали должно быть использовано для подтверждения достаточной глубины анестезии перед началом сканирования. - Наносите офтальмологическую мазь на глаза животного перед экспериментами.
- Поместите животное в люльку компьютерного томографа, закрепите носовой конус и перейдите на 1,5%-3% изофлуран (в комнатном воздухе) для обслуживания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие рефлекса отведения педали должно быть использовано для подтверждения соответствующего процентного содержания изофлурана для поддержания анестезии. - Постоянно следите за мышью.
2. Предварительная подготовка к сканированию
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация проводится в два экспериментальных этапа, чтобы позволить первому контрастному веществу быть надлежащим образом выведено из кровообращения и тканей. На первом этапе вводится eXIA (первое контрастное вещество), а на втором — ExiTron (второе контрастное вещество), как описано в разделе «Рабочий процесс визуализации» (раздел 3) ниже.
- Дайте контрастному веществу (eXIA или ExiTron, в зависимости от фазы эксперимента) нагреться до комнатной температуры в течение 3 часов.
- Установите следующие параметры сканирования на компьютерном томографе: протокол высокого разрешения при напряжении лампы 50 кВ и токе 460 мкА, неспиральный, 720 проекций/оборотов, четыре оборота и время сбора данных 4 минуты.
3. Рабочий процесс визуализации
- Экспериментальная фаза 1
- Рассчитайте и приготовьте объем первого вводимого контрастного вещества в неразбавленной дозе 6 мкл/г массы тела для максимального контрастирования.
- Подготовьте катетер для хвостовой вены, наполнив его физиологическим раствором и подключив к шприцу, наполненному контрастным веществом.
- Сделайте предварительное контрастное сканирование всего тела (WB) и печени.
- Убедитесь, что в шприце или катетере нет пузырьков или засоров.
- Введите предварительно заполненный катетер в хвостовую вену и введите контрастное вещество с помощью инъекции, выполняемой медленно и вручную, продолжительностью 1-3 минуты (не в виде болюсной инъекции). Шприцевой насос можно использовать, если он настроен на соответствующую скорость инфузии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хвост животного можно поместить в теплую воду, чтобы вызвать расширение сосудов и помочь с введением катетера - Проводите сканирование ББ и печени в разные моменты времени, как указано в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если получение всех точек невозможно, основное внимание следует уделять 45-минутному периоду после инъекции (PI), который является точкой максимального поглощения печенью, и 48-часовому PI, когда достигается клиренс.
- Экспериментальная фаза 2
- Снова подготовьте мышь, как описано в разделе 1, к введению второго контрастного вещества через 10 дней после окончательного считывания первого контрастного вещества (48 ч ПИ).
- Выполните шаги 2.1-2.2.
- Рассчитайте и приготовьте объем второго контрастного вещества, которое необходимо ввести в неразбавленной дозе 8 мкл/г массы тела для максимального контрастирования.
- Подготовьте катетер для хвостовой вены, наполнив его физиологическим раствором и подключив к шприцу, наполненному контрастным веществом.
- Сделайте предварительное КБ с контрастированием и исходное сканирование печени для оценки относительного объема крови и стеатоза печени.
- Убедитесь, что при сканировании не обнаруживается контрастное вещество, что свидетельствует о полном удалении первого контрастного вещества.
- Введите предварительно заполненный катетер в хвостовую вену и введите контрастное вещество с помощью внутривенной инъекции, выполняемой медленно и вручную, продолжительностью 1-3 минуты (не в виде болюсной инъекции). Шприцевой насос можно использовать, если он настроен на соответствующую скорость инфузии.
- Проводите сканирование ББ и печени в разные моменты времени, как указано в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование ББ проводится через 10 мин и 4 ч ПИ. Значительный промежуток времени между ними позволяет оценить биораспределение индикатора в организме, а также его относительный клиренс.
4. Извлечение и анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе предусмотрены этапы извлечения и анализа данных на основе специального программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов). Описанные шаги могут потребоваться адаптировать при использовании другого программного обеспечения.
- Оценка липидного отложения/стеатоза печени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки стеатоза печени контрастное вещество не используется, а проводится сравнение контроля и патологии. Из-за относительно высоких отклонений в свойствах ослабления тканей у разных мышей значения плотности нормализуются для печени по отношению к селезенке (безжировая ткань) и жиру (абсолютная жировая ткань) в соответствии со следующим уравнением и как описано ранее25:
- Чтобы выполнить анализ, загрузите DICOM-файл сканирования перед контрастированием и отрегулируйте полосу/контрастное вещество, чтобы четко видеть печень, селезенку и белую жировую ткань (WAT).
- Откройте инструмент Оператор моделирования с помощью выпадающего меню на передней панели и выберите 3D ROI Tool.
- В разделе Оператор 3D ROI выберите Добавить ROI, чтобы создать несколько ROI (до восьми для каждой ткани) для выполнения выборки в областях, где печень (предпочтительно в области левой медиальной доли, правой медиальной доли и левой боковой доли) и селезенка выглядят чистыми, без видимых кровеносных сосудов и жира.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для ВАТ ROI выбираются в середине депо висцеральной жировой ткани. Рекомендуемые области показаны на рисунке 2. Методы нормализации с использованием соотношения печень/селезенка и без включения ВАТ также могут быть применены, как это было установлено ранее31. - В разделе Режим 3D-рисования и функция Erode/Dilate выберите 2D и используйте появившийся интерфейс, чтобы указать имя и цвет для каждого ROI.
- Используйте инструмент Sphere paint ROI диаметром 8 пикселей, чтобы вручную нарисовать 2D-ROI.
- Выполните выборку, сегментировав 2D-ROI по областям интереса с помощью инструмента Перекрестие (Cross Hair ) в поперечной плоскости, как показано на рисунке 3A.
- Щелкните по выбранной точке в сагиттальной и корональной плоскостях, чтобы завершить сегментацию 2D ROI, как показано на рисунке 3B.
- Повторите процесс определения остальных ROI.
ПРИМЕЧАНИЕ: При отборе проб избегайте областей, граничных с органами, так как это может привести к появлению шума и повлиять на надежность рассчитанного значения единицы Хаунсфилда (HU) для каждого ROI. - Если вы удовлетворены сегментированными показателями рентабельности инвестиций, перейдите в раздел Навигация и выберите Показать таблицу, чтобы отобразить таблицу количественной оценки, содержащую рассчитанные значения HU для каждой рентабельности инвестиций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующие значения перечислены в столбце «Среднее», который содержит средние числовые значения вокселей (HU), содержащихся в ROI для интересующих органов. Запишите интересующие вас значения или сохраните всю таблицу, выбрав Экспортировать таблицу. - Рассчитайте средний HU для печени, селезенки и ВАТ и подставьте значения в приведенное выше уравнение, чтобы рассчитать процентное содержание жира в печени.
- Функциональный захват тканей / перенос липидов (хиломикрон) в печени
ПРИМЕЧАНИЕ: Функциональный захват тканей / перенос липидов (хиломикрон) анализируется по полученным снимкам через 45 мин и 48 ч после первой инфузии контрастного вещества на основе ранее опубликованного метода32. Контраст рассчитывается для различных тканей и моментов времени по следующему уравнению:
PV орган t i — среднее значение пикселя в органе в момент времени t i (в диапазоне от 0 ч до 48 ч), а PV орган t0 — среднее значение пикселя в органе на изображении без контраста.- Чтобы выполнить этот анализ, загрузите файл DICOM-сканирования eXIA и отрегулируйте полосу/контрастное вещество, чтобы четко видеть печень, селезенку и левый желудочек.
- Откройте оператор моделирования с помощью выпадающего меню инструмента на передней панели и выберите 3D ROI Tool.
- В разделе « Оператор 3D-окупаемости» выберите «Добавить рентабельность инвестиций», чтобы сегментировать несколько показателей рентабельности инвестиций для печени.
- В разделе « Режим 3D-рисования» и «Эрозия/расширение » используйте инструмент «Окупаемость инвестиций в краску сферы » диаметром 8 пикселей и эрозией −1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите несколько ROI на срезах, где каждый орган четко виден. Избегайте пограничных областей, так как это может привести к появлению шума и повлиять на надежность рассчитанного значения HU для каждого ROI. Это приведет к выборке нескольких 3D-ROI, которые соответствуют небольшим объемам органов. - Используйте появившийся интерфейс, чтобы указать имя и цвет для каждого ROI.
- После того, как вы будете удовлетворены спроектированными значениями рентабельности инвестиций, перейдите в раздел Навигация и выберите Показать таблицу , чтобы отобразить таблицу количественной оценки, содержащую рассчитанные значения HU для каждой рентабельности инвестиций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующие значения перечислены в столбце «Среднее», в котором отображаются средние числовые значения вокселей (HU), включенных в ROI. Среднее значение HU ROI каждого органа соответствует PV органа ti. Запишите интересующие вас значения или сохраните всю таблицу, выбрав Экспортировать таблицу. - Чтобы получить ФВ органа t0, повторите все вышеперечисленные шаги, используя DICOM-файл до контрастирования, чтобы рассчитать среднюю яркость печени, селезенки и левого желудочка перед введением контрастного вещества.
- Вставьте значения в приведенное выше уравнение, чтобы извлечь процентное контрастное значение, соответствующее функциональному поглощению тканей / переносу липидов (хиломикрон).
- Строение и плотность сосудистой сети печени
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ архитектуры и плотности сосудистой сети печени основан на ранее опубликованной методике33 и выполняется на сканировании печени, полученном через 10 мин ПИ второго контрастного вещества.- Чтобы выполнить этот анализ, загрузите файл ExiTron scan DICOM и отрегулируйте полосу/контраст, чтобы четко видеть сосудистую сеть печени.
- Откройте оператор моделирования с помощью выпадающего меню инструмента на передней панели и выберите 3D ROI Tool.
- В разделе « Оператор 3D-окупаемости» выберите « Добавить рентабельность инвестиций», чтобы создать 3D-окупаемость инвестиций для печени.
- В разделе « Режим 3D-рисования» и «Размытие/расширение» выберите «3D».
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инструмент Sphere paint ROI с эрозией −1 для определения слоев сегментации в корональной плоскости. Диаметр инструмента рисования ROI должен быть отрегулирован в соответствии с каждым слоем (для добавления/удаления любых желательных/нежелательных выделений вокселов). Рекомендуется, чтобы объем печени был первоначально определен в корональной плоскости, а затем поперечная и сагиттальная плоскости могут быть использованы для коррекции ROI. Этот процесс требует точности. Пользователь должен быть очень осторожен, чтобы не включать другие ткани, сосуды и кости при сегментации каждого слоя ROI, при этом гарантируя, что все области печени включены в определенный ROI. По этой причине ознакомление с анатомическими границами печени имеет решающее значение. - После того, как вы удовлетворены полученным ROI печени, выполните разрез, чтобы удалить из данных изображения все вокселы, которые не относятся к первоначально сегментированному ROI печени. Для этого выберите ROI печени в селекторе ROI и нажмите на значок Perform Cut . Эта операция убирает фон и оставляет ROI печени неизменным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что функции отмены/повтора применимы ко всем операциям, выполняемым с помощью инструмента 3D ROI, действие вырезания ROI не может быть отменено. Таким образом, перед этим действием пользователь может рассмотреть возможность сохранения первоначального ROI печени в формате DICOM. - Результирующая РОИ печени включает в себя сосудистую сеть и окружающие ткани, которые необходимо удалить. Для этого сбросьте ROI печени, нажав на кнопку Reset ROI broom.
- Используйте появившийся интерфейс, чтобы перенести все пиксели ROI печени на задний план.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этой операции ROI печени все еще будет существовать, но она больше не будет содержать никаких вокселей. - Чтобы пересегментировать ROI печени таким образом, чтобы он содержал только пиксели, связанные с сосудистой системой, перейдите в раздел Алгоритмы сегментации, обозначенные значком волшебной палочки, и выберите Подключенное пороговое значение.
- Определите ROI как Выходные данные и фон как Входные данные в раскрывающемся меню ввода, прежде чем применять пороговые значения.
- Установите пороговые значения, щелкнув значки Min и Max слева от каждого поля порога, чтобы заполнить максимальное и минимальное значения и получить сосудистую сеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только пиксели в выбранном диапазоне будут включены в результирующую рентабельность инвестиций. Регулировка пороговых значений у разных животных гарантирует, что одни и те же анатомические области будут учитываться в отношении точного количества контрастного вещества, вводимого каждому животному. Этот показатель постоянен для выбранных тканей, даже если числовые значения не идентичны. - С помощью инструмента « Перекрестие » щёлкните по точке, где сосудистая сеть кажется четкой, и щёлкните по кнопке «Применить », чтобы выполнить сегментацию.
- Активируйте средство просмотра проекции максимальной интенсивности (MIP).
- Оцените результирующую рентабельность инвестиций печени с точки зрения того, насколько четкой выглядит сосудистая сеть в представлении MIP.
- Если ткань остается в отдельных частях ROI печени, повторите шаги 4.3.5-4.3.11, регулируя пороговое значение Min до тех пор, пока сегментированный ROI печени четко не будет представлять сосудистую сеть.
- После того, как вы будете удовлетворены полученной рентабельностью инвестиций в печень, создайте таблицу количественной оценки, содержащую рассчитанный объем ROI печени в кубических миллиметрах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующие значения перечислены в столбце «мм3», который содержит числовое значение объема вокселей (HU), содержащихся в ROI печени. Запишите интересующие вас значения или сохраните всю таблицу, выбрав Экспортировать таблицу.
- Относительный объем крови в печени
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения относительного объема крови в печени (rBV), который значительно коррелирует с количеством новообразованных кровеносных сосудов во время прогрессирования фиброза, используют предконтрастное сканирование и сканирование через 4 ч после второй инъекции контрастного вещества. Анализ выполняют, как описано ранее34.- Чтобы выполнить этот анализ, загрузите файл ExiTron сканирования DICOM и отрегулируйте полосу/контрастность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отключите программу просмотра MIP: в разделе «Настройки» установите флажок, чтобы отключить программу просмотра MIP при загрузке. Для больших наборов данных это может повысить скорость загрузки. - Откройте оператор моделирования с помощью выпадающего меню инструмента на передней панели и выберите 3D ROI Tool. Этот инструмент предоставляет расширенные возможности для рисования, визуализации, сохранения и количественной оценки как 2D, так и 3D областей.
- В разделе 3D ROI Operator выберите Add ROI и сегментируйте два ROI: один для печени и один для крупного кровеносного сосуда.
- В разделе « Режим 3D-рисования» и «Размытие/расширение» выберите «2D».
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать инструмент Sphere paint ROI диаметром 8-10 пикселей для печени и 4-6 пикселей для кровеносного сосуда. Тем не менее, диаметр инструмента для рисования можно регулировать в зависимости от того, насколько мала выделенная область. - Используйте появившийся интерфейс, чтобы указать имя и цвет для каждого ROI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите от двух до пяти срезов центральных частей интересующих тканей и определите слои сегментации, чтобы получить 2D-ROI для каждой ткани. При выборе областей на каждом срезе избегайте областей границы органа, как показано на рисунке 4, так как это может привести к появлению шума и повлиять на надежность рассчитанного значения HU для каждого ROI. - После того, как вы будете удовлетворены спроектированными значениями рентабельности инвестиций, перейдите в раздел Навигация и выберите Показать таблицу , чтобы отобразить таблицу количественной оценки, содержащую рассчитанные значения HU для каждой рентабельности инвестиций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующие значения перечислены в столбце «Среднее», в котором отображаются средние числовые значения вокселей (HU), включенных в ROI. Запишите интересующие вас значения или сохраните всю таблицу, выбрав Экспортировать таблицу. - Повторите все шаги для DICOM-файла до введения контрастного вещества, чтобы получить среднюю яркость печени до введения контрастного вещества. Для этого выполните шаги 4.4.2-4.4.5 только для печени.
- Вычислите средние значения HU для каждой ткани в эквивалентные моменты времени и вставьте полученные значения в уравнение ниже:
ПРИМЕЧАНИЕ: Крупный кровеносный сосуд после введения контрастного вещества считается 100% рБВ, а печень до введения контрастного вещества считается 0% рБВ.
- Чтобы выполнить этот анализ, загрузите файл ExiTron сканирования DICOM и отрегулируйте полосу/контрастность.
- Диаметр воротной вены
ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения диаметра воротной вены анализируются те же сканы, которые используются для измерения рБВ печени, как описано ранее35.- Загрузите DICOM-файл сканирования ExiTron и отрегулируйте полосу/контрастность.
- Расположите поперечные плоскости трех-четырех срезов над местом соединения верхней брыжеечной и селезеночной вен (рис. 5).
- Используйте инструмент « Линейка », чтобы измерить точное расстояние между двумя точками (т. е. диаметр области круглой жилы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние извлекается на изображении, но можно также перейти в раздел Навигация и выбрать Показать таблицу, чтобы отобразить таблицу количественной оценки, содержащую рассчитанное расстояние, или выбрать Экспортировать таблицу, чтобы сохранить результат.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом репрезентативном исследовании микро-КТ без какого-либо контрастного вещества показала более высокий процент жира в печени у мышей с НАЖБП по сравнению с контрольной группой (табл. 2), что подтверждает патологию. С помощью контрастного вещества ExiTron и описанного выше анализа архитектуры и плотности печеночной сосудистой сети было обнаружено, что общая объемная плотность сосудистой сети печени была выше у мышей с НАЖБП по сравнению со здоровыми контрольными группами (рис. 6, таблица 2). Мыши с НАЖБП также имели больший диаметр воротной вены по сравнению с контрольными мышами (табл. 2), структурное изменение, связанное с портальной гипертензией при заболеваниях печени34,36,37. Аналогичным образом, было рассчитано, что рБВ печени животных с НАЖБП выше по сравнению со здоровыми контрольными группами (табл. 2).
Кроме того, анализ функционального поглощения тканей показал более высокое накопление и более медленный клиренс контрастного вещества eXIA у мышей с НАЖБП по сравнению со здоровыми контрольными группами (рис. 7). Эти результаты свидетельствуют о том, что стеатотические гепатоциты, вероятно, подвергаются высокому уровню клеточного эндоцитоза и распределения, хотя и сопровождаются снижением метаболического катаболизма или клиренса/секреции. В целом, этот результат согласуется с фенотипом снижения метаболической активности печени, как и ожидалось в случае жировой инфильтрации/НАЖБП38,39.
Рисунок 1: Схема, показывающая обзор протокола эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения, показывающие предлагаемые области, используемые для выполнения выборки для сегментации 2D-ROI для печени (красный), селезенки (зеленый) и WAT (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативный пример сегментации 2D ROI для расчета стеатоза . (A) Инструмент «Перекрестие » используется для выбора 2D-ROI на желаемой области печени в поперечной плоскости. (B) Процесс повторяется в сагиттальной и корональной плоскостях для завершения сегментации 2D-ROI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативный пример сегментационного слоя для генерации 2D-ROI печени. Центральные части органа выбираются вручную, избегая пограничных областей для устранения шума. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: 2D осевая площадь. Репрезентативные примеры 2D осевой площади различных срезов, выбранных для измерения диаметра воротной вены у мышей с НАЖБП и здоровой контрольной группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Архитектура сосудистой сети печени. Репрезентативные извлеченные изображения архитектуры сосудистой сети печени, показанные с помощью КТ-сегментации, полученные от контрольной мыши (176,9 мм3) и мыши с НАЖБП (390,3мм3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Средние значения контрастности. Сгруппированные данные, показывающие средние значения контраста, которые представляют поглощение ткани печени в течение 48 ч после инъекции eXIA у мышей с НАЖБП (n = 2) и здоровых (n = 2) контрольных групп. Все сгруппированные данные выражаются в виде среднего ± стандартного отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| ЭксиА | Экситрон | |||
| Момент времени | Сканирование всего тела | Сканирование печени | Сканирование всего тела | Сканирование печени |
| Предварительное контрастирование | X | X | X | X |
| 10 мин PI | - | - | - | X |
| 15 мин PI | O | O | - | - |
| 45 мин PI | X | X | - | - |
| 2 ч ПИ | O | O | - | - |
| 4 ч ПИ | - | - | X | X |
| 24 ч PI | O | O | - | - |
| 48 ч ПИ | X | X | - | - |
Таблица 1: Моменты времени проведения компьютерной томографии. Соответствующие временные точки сканирования всего тела и печени были получены до и после инъекции контрастных веществ. X обозначает обязательное сканирование, - указывает на отсутствие сканирования, а O указывает на необязательное (рекомендуемое, но не обязательное) сканирование.
| Контроль (n = 1–2) | НАЖБП (n = 1–2) | |
| % жира в печени | 2,4 ± 1,5% | 18,4 ± 3,1% |
| Объем сосудистой сети печени | 176,9 мм3 | 390,3 мм3 |
| Диаметр воротной вены | 1,1 мм | 1,4 мм |
| Относительный объем крови в печени | ~54% | ~79% |
Таблица 2: Репрезентативные результаты, указывающие на различия в процентном содержании жира в печени, объеме сосудистой сети печени, диаметре воротной вены и относительном объеме крови в печени между мышами с НАЖБП и здоровыми контрольными группами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящее время рекомендуемым методом диагностики и определения стадии НАЖБП у людей является биопсия печени, которая таит в себе риск осложнений кровотечения, а также неточностей отбора проб40. Напротив, на животных моделях такой диагноз ставится путем гистологического вскрытия, хотя протоколы биопсии печени для выживания в настоящее время доступны и рекомендуются, когда дизайнисследования позволяет. Использование посмертной гистологии означает, что для исследования прогрессирования этого заболевания требуется большое количество животных. Таким образом, исследование не может быть проведено на одном и том же животном, пока болезнь прогрессирует; Также ожидается, что вариабельность будет выше при сравнении образцов, полученных в разные моменты времени от разных животных. В этой статье мы предлагаем инновационный, неинвазивный метод микро-КТ in vivo , применяемый на экспериментальной модели НАЖБП на животных, который позволяет проводить длительную оценку прогрессирования заболевания путем количественной оценки функциональных параметров, а именно стеатоза печени и поглощения функциональной ткани, относительного объема крови, диаметра воротной вены и плотности сосудистой сети. у одного и того же животного.
Микрокомпьютерная томография в настоящее время является золотым стандартом неинвазивного метода визуализации для точного отображения анатомической информации в живом организме. Микро-КТ обладает способностью достигать высокого пространственного разрешения, что является ценным инструментом для изучения мельчайших деталей в широком спектре патологий. Кроме того, это быстрый и надежный инструмент для изучения прогрессирования заболевания с течением времени21,22,23,24 путем использования внутренних характеристик рентгеновских лучей без нарушения целостности изображенного образца. Одним из основных преимуществ этого метода в исследованиях на животных является возможность использовать комбинацию выбранных контрастных веществ, вводимых без каких-либо сложных препаратов (неинвазивно). Это позволяет извлекать несколько параметров из одного и того же животного, сканируемого в продольном направлении во время прогрессирования заболевания, обеспечивая максимальную производительность и соответствие рекомендациям ARRIVE и 3Rs26. Кроме того, микрокомпьютерные томографы обеспечивают получение изображений с высоким разрешением за очень короткое время получения (с продолжительностью сканирования всего несколько минут или меньше), при этом интерпретация результатов в 2D и 3D форматах относительно проста (особенно при использовании удобного программного обеспечения, как предлагается здесь).
Все сканирования, описанные в этом протоколе, выполнялись на небольшом компьютерном томографе грызунов (см. таблицу материалов). Система компьютерной томографии выполняет спиральное сканирование и может предоставлять изображения с разрешением 100 мкм. Он работает в диапазоне от 35-80 кВ до 10-500 мкА лампового тока. Сбор данных КТ длится 7-10 минут на одно сканирование и реконструируется с помощью алгоритма реконструкции пространства изображений (ISRA) с пространственным разрешением 100 мкм. Компьютерная томография выполняется с использованием следующих параметров: i) протокол высокого разрешения при 50 кВп для сканирования WB и ii) мультиротационное локальное сканирование с высоким разрешением при 50 кВ для локального сканирования печени. Все параметры настраиваются в программном обеспечении сканирующего устройства (см. Таблицу материалов), поставляемом вместе с системой, следуя инструкциям в пользовательском интерфейсе. Реконструкция выполняется с помощью алгоритма Фельдкампа, Дэвиса и Кресса (FDK) с размером воксела 0,1 мм. Артефакты КТ сводятся к минимуму за счет периодической калибровки детекторов и поддержания системы в хорошем состоянии с помощью соответствующих служб. При возникновении артефактов проблемный детектор, вызывающий кольцевой артефакт, может быть удаленно отменен и изображение скорректировано.
Описанный технический протокол был оптимизирован с использованием контрастных веществ eXIA и ExiTron, которые были подобраны с учетом их специальных составов и временной биокинетики в различных тканях. eXIA - это полностью биоразлагаемое контрастное вещество, содержащее йод 160 мг/мл в качестве ослабляющего рентгеновское излучение. После внутривенного введения это контрастное вещество показывает время пребывания в крови (с половиной клиренса >30 мин), а затем поглощается метаболически активными органами, такими как печень, селезенка, миокард и бурая жировая ткань. Таким образом, первое контрастное вещество подходит для неинвазивного выявления in vivo аномалий печени и селезенки, инфаркта миокарда и кардиомиопатии, а также для выявления и количественного определения активной бурой жировой ткани. ExiTron - это контрастное вещество на основе щелочноземельных металлов на основе наночастиц с неразбавленной плотностью ~12 000 HU42, специально разработанное для доклинической компьютерной томографии. При внутривенном введении второе контрастное вещество циркулирует в кровотоке и поглощается клетками ретикулоэндотелиальной системы43, включая макрофаги в печени.
Существуют определенные ограничения, связанные с предлагаемой методикой. Для того, чтобы этот протокол был успешным, сигнал КТ не должен быть обнаружен от первого контрастного вещества до введения второго контрастного вещества. Временные рамки, предложенные в этом протоколе, были выбраны после оптимизационных экспериментов (и на основе других исследований)44, которые показали, что первое контрастное вещество имеет медленный клиренс. Поскольку второе контрастное вещество имеет еще более медленную скорость клиренса45,46, его необходимо вводить вторым, после полного выведения первого контрастного вещества. Действительно, мы определили, что клиренс первого контрастного вещества является удовлетворительным через 12 дней после инъекции. В зависимости от продолжительности используемой животной модели, эта временная шкала может позволить сравнить две временные точки, в которых заболевание печени могло прогрессировать. Учитывая, что используемый здесь протокол кормления занимает 22 недели, не ожидается, что интервал в 12 дней вызовет существенные изменения в прогрессировании заболевания. Экспериментатор должен выполнить соответствующую проверку и оптимизацию, прежде чем вносить коррективы в предлагаемый протокол визуализации. Необходимо также оценить анализ затрат и выгод прогрессии и сигнала изображения, прежде чем изменять тип и концентрацию используемых контрастных веществ, а также временные рамки введения.
Кроме того, оба контрастных вещества могут переноситься только до определенного общего объема введения, прежде чем достигнут токсичный уровень для животного43. В связи с тем, что для обеспечения оптимального контраста требуется максимальный объем контрастного вещества, в сочетании с медленной скоростью клиренса агентов рекомендуется однократная инъекция для этого анализа. Повторное введение этих или других подходящих альтернативных контрастных веществ также может быть использовано для различных экспериментов, при условии, что общий объем контрастного вещества остается ниже рекомендуемого предела в любой момент времени. Еще одним требованием для успешной визуализации с использованием этого протокола микро-КТ является правильное введение контрастных веществ. Как указано в протоколе, экспериментатор должен обеспечить медленную инфузию средства в соответствующей дозировке непосредственно в кровоток через вену, без каких-либо пузырьков. Если этого не сделать, это повлияет на разрешение изображения и выходные данные. Таким образом, выбор оптимальной дозировки и соответствующих методов введения (инфузия и продолжительность между различными препаратами) снижает риск токсичности и связанных с этим ограничений при КТ-визуализации.
При сканировании в несколько временных точек следует обратить внимание на то, чтобы продолжительность анестезии была как можно короче. Поскольку компьютерная томография занимает всего несколько минут, анестезия может быть отменена между некоторыми сканированиями, чтобы свести к минимуму риск, связанный с длительной продолжительностью анестезии. Повторные индукции анестезии также сопряжены с риском. Тем не менее, помещение животных на грелку между сканированиями и обеспечение достаточной гидратации помогает в восстановлении и поддержании физиологии. Кроме того, воздействие ионизирующего излучения, испускаемого рентгеновскими лучами, адекватно влиянию на биологию органов и клеток, что делает его потенциально опасным для животных и, следовательно, приводит к предвзятым и вводящим в заблуждение экспериментальнымданным. Поскольку ожидаемая доза, которая будет подаваться за одно сканирование, составляет около 385 мГр, мыши, получившие несколько сканирований во время исследования, могут получить до 1,8 Гр и более. Это значительная доза облучения для мышей, которая может оказать потенциально вредное воздействие на биологию их тканей. Это особенно тревожно, поскольку требуется увеличение дозы при уменьшении расстояния между изотропными вокселами при сохранении того же качества изображения22.
С точки зрения постобработки изображений с помощью рекомендуемого программного обеспечения (см. Таблицу материалов), маски сегментации создаются с помощью комбинации инструментов увеличения и порогового значения, и это самый трудоемкий этап анализа. В некоторых случаях ручную модификацию полученных сегментаций следует проводить методом сглаживания. Для оптимизации свойств сохранения границ и шумоподавления желаемой сети рекомендуется использовать фильтр Гаусса со значением 0,3. Репрезентативные изображения такой сосудистой сети представлены на рисунке 6 (постобработка с помощью программы просмотра медицинских изображений DICOM с открытым доступом). Ключевым ограничением с точки зрения измерения сосудистой сети является то, что программное обеспечение не имеет возможности точно отделить выбранный определенный ROI (который представляет сосудистую сеть печени) от фона (который представляет окружающую ткань печени); Поэтому соответствующий порог должен быть выбран методом проб и ошибок. Изначально пользователь определяет нижнее пороговое значение 600 HU и максимальное значение 10 000 HU. Если удаленная сосудистая сеть и отделение от окружающих тканей неприемлемы, то более низкое значение корректируется методом проб и ошибок после ступенчатых изменений 50-100 HU. Процесс повторяется пользователем до тех пор, пока сосудистая сеть не будет достаточно отделена от ткани.
В заключение, понимание адаптаций сосудистой сети печени во время прогрессирования НАЖБП и соотнесение их с другими методами характеристики заболевания с использованием предложенного метода может проложить путь к созданию новых, более эффективных и воспроизводимых подходов к исследованию НАЖБП на мышах. Ожидается, что этот протокол также повысит ценность доклинических моделей на животных для исследования разработки новых методов лечения прогрессирования заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com. Эта работа была поддержана Греческим фондом исследований и инноваций (#3222 to A.C.). Анна Хаджихамби финансируется Институтом гепатологии Роджера Уильямса, Фондом исследований печени.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| eXIA160 | Binitio Biomedical, Inc. | https://www.binitio.com/?Page=Products | |
| High fat diet with 60% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12492 | |
| High-fructose corn syrup | Best flavors, CA | hfcs-1gallon | |
| Lacrinorm ophthalmic ointment | Bausch & Lomb | ||
| Normal diet with 10% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12450 | |
| Viscover ExiTron nano 12000 | Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-698 | |
| VivoQuant | Invicro | ||
| X-CUBE | Molecubes, Belgium | https://www.molecubes.com/systems/ |
References
- Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
- Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
- Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
- Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467 (2021).
- Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
- Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
- Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51 (2017).
- Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
- Koyama, Y., Brenner, D. A.
- Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511 (2022).
- Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
- Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
- Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
- Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
- Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis - current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
- Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
- Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
- Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181 (2010).
- Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
- Feng, J., et al.
- Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
- Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178 (2015).
- Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
- Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026 (2012).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410 (2020).
- Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
- Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991 (2015).
- Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
- Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
- Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085 (2016).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
- Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626 (2013).
- Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68 (2022).
- Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6 (2010).
- Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
- Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751 (2022).
- Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130 (2019).
- Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
- Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
