Summary
该协议介绍了常用的细胞毒性测定（阿拉马尔蓝 [AB]、CFDA-AM、中性红和 MTT 测定），适用于评估斑马鱼胚胎 （ZEM2S） 和肝脏 （ZFL） 细胞系的细胞毒性 96 孔板。
Abstract
鱼细胞系越来越多地用于生态毒性研究，细胞毒性测定已被提出作为预测鱼类急性毒性的方法。因此，该协议提出了修改的细胞毒性测定，以评估斑马鱼（Danio rerio）胚胎（ZEM2S）和肝脏（ZFL）细胞系中的细胞活力，该板在96孔板中。评估的细胞毒性终点是线粒体完整性（Alamar Blue [AB] 和 MTT 测定）、通过酯酶活性 的 膜完整性（CFDA-AM 测定）和溶酶体膜完整性（中性红 [NR] 测定）。在96孔板中暴露测试物质后，进行细胞毒性测定;在这里，AB和CFDA-AM同时进行，然后在同一板上进行NR，而MTT测定在单独的板上进行。这些测定的读数通过AB和CFDA-AM的荧光以及MTT和NR的吸光度获取。用这些鱼细胞系进行的细胞毒性测定可用于研究化学物质对鱼的急性毒性。
Introduction
需要对化学物质进行人体健康和环境安全性测试。监管机构和/或立法（例如，REACH、OECD、US EPA）在安全性评估中越来越多地考虑分子和细胞生物标志物来预测对生物体的影响1，2，因为它们可以先于体内不良结果（例如，内分泌干扰、免疫反应、急性毒性、光毒性）3，4，5，6，7.在这种情况下，细胞毒性已被作为预测鱼类急性毒性的测量方法5，8;然而，它可以在生态毒性研究中有许多其他应用，例如定义化学物质的亚细胞毒性浓度，以研究它们对鱼类最多样化的影响（例如，内分泌干扰效应）。
在细胞培养系统（体外 系统）中，化学物质的细胞毒性可以通过终点类型的不同方法确定。例如，一种细胞毒性方法可以基于与细胞死亡过程中观察到的特定形态相关的终点，而另一种方法可以通过测量细胞死亡、活力和功能、形态、能量代谢以及细胞附着和增殖来确定细胞毒性。化学物质可以通过不同的机制影响细胞活力，因此覆盖不同细胞活力终点的细胞毒性评估对于预测化学效应是必要的9。
MTT和Alamar Blue（AB）是根据细胞代谢活性确定对细胞活力影响的测定。MTT测定评估线粒体酶琥珀酸脱氢酶10的活性。淡黄色的3-[4，5-二甲基噻唑-2基]-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）还原为甲臜蓝仅发生在活细胞中，其光密度与活细胞的数量成正比10。AB测定是一种灵敏的氧化还原指示剂，由线粒体酶介导，线粒体酶在活细胞将刃天青还原为试卤灵时发出荧光并改变颜色11;然而，胞质和微粒体酶也有助于减少AB和MTT12。这些酶可能包括几种还原酶，例如醇和醛氧化还原酶、NAD（P）H：醌氧化还原酶、黄素还原酶、NADH脱氢酶和细胞色素11。
中性红（NR）测定是基于将该染料掺入活细胞的溶酶体中的细胞活力测定13。NR的摄取取决于细胞维持pH梯度的能力。溶酶体内的质子梯度保持低于细胞质的pH值。在正常的生理pH值下，NR呈现的净电荷约为零，这使其能够穿透细胞膜。因此，染料带电并保留在溶酶体内。因此，保留NR的量越大，活细胞的数量就越多14。破坏细胞表面或溶酶体膜的化学物质会损害这种染料的摄取。
CFDA-AM测定是基于保留5-羧基荧光素二乙酸乙酰氧基甲酯（CFDA-AM）的荧光细胞活力测定15。5-CFDA-AM是一种酯酶底物，被转化为羧基荧光素，羧基荧光素是一种极性且不可被活细胞膜渗透的荧光物质15;因此，它保留在完整细胞膜的内侧，表明活细胞。
最近，三种细胞毒性测定（CFDA-AM、NR 和 AB 测定）在经过验证的 ISO（国际标准化组织）指南 （ISO 21115：2019）16 和 OECD（经济合作与发展组织）测试方法 （OECD TG 249） 中合并，以使用 RTgill-W1 细胞系（虹鳟鱼 [Oncorhynchus mykiss] 鳃的永久性细胞系）在 24 孔板中评估鱼类急性毒性17.虽然有一种现有的基于细胞的方法来预测鱼类的急性毒性，但已经投入了努力开发与其他鱼类物种类似的方法，并提高该方法的通量。一些例子包括用特定毒性途径18，19的报告基因转染的ZFL细胞系的开发，RTgill-W1细胞系20中的光毒性测试，以及使用ZFL和ZF4细胞系（来自1天龄胚胎的斑马鱼成纤维细胞）通过几种细胞毒性测定来评估毒性21。
Danio rerio（斑马鱼）是水生毒性研究中使用的主要鱼类之一;因此，使用斑马鱼细胞系进行基于细胞的鱼类毒性测试方法可能非常有用。ZFL细胞系是一种斑马鱼上皮肝细胞系，具有肝实质细胞的主要特征，可代谢异生素7，22，23，24，25。同时，ZEM2S细胞系是源自胚泡阶段的胚胎斑马鱼成纤维细胞系，可用于研究对鱼类26，27的发育影响。因此，该协议描述了四种细胞毒性测定（MTT，AB，NR和CFDA-AM测定），并在96孔板中使用ZFL和ZEM2S细胞系进行修饰。
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Protocol
注意：有关本协议中使用的材料列表，请参阅 材料 表，有关本协议中使用的溶液和介质的组成，请参阅 表1 。
1. 制备ZFL和ZEM2S细胞
- 从具有80%汇合度的ZFL或ZEM2S细胞的T75烧瓶开始，在28°C的相应完全培养基中培养，不含CO2。
- 从烧瓶中取出培养基，并通过加入 10 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （0.01 M） 洗涤细胞。向培养瓶中加入 3 mL 1x 胰蛋白酶（0.05% v/v;0.5 mM 胰蛋白酶-EDTA）。在28°C孵育3分钟。
- 轻轻敲击烧瓶以释放细胞，然后通过向烧瓶中加入 3 mL 完全培养基来停止胰蛋白酶消化。
- 将细胞悬液转移到 15 mL 锥形离心管中，并以 100 × g 离心 5 分钟。
- 离心后，小心地除去上清液，加入1mL完全培养基用于ZFL或ZEM2S细胞，并使用微量移液器重悬沉淀。
2. 台盼蓝染料排阻细胞计数
- 向微管中加入 10 μL 细胞悬液和 10 μL 台盼蓝染料，以计数细胞并评估其活力。使用移液管混合细胞悬液和染料。
- 然后，将 10 μL 该混合物（细胞悬液 + 台盼蓝）转移到 Neubauer 腔室中，并计数放置在腔室角落的四个大方块（象限 Q）中的细胞，认为活细胞是不吸收台盼蓝的细胞。使用公式（1）确定活细胞的数量：
（1） - 通过使用公式（1）确定的细胞数乘以2（由于使用台盼蓝引起的稀释因子）来计算细胞悬液中的最终细胞数。
注意：或者，可以使用自动细胞计数系统（例如， 具有细胞计数和活力功能的细胞器）。
（1）3. 96孔板中的细胞镀层
- 计算获得进行细胞毒性测定所需的细胞数量所需的细胞悬浮体积。每个细胞系的活细胞数量如下所示：
- 每孔板60，000个活的 ZEM2S细胞 ;因此，对于整个板，在 20 mL 完全培养基（200 μL/孔，96 孔板）中使用 600 万个细胞。
- 每孔板40，000个活 的ZFL细胞 ;因此，对于整个板，在 20 mL 完全培养基（200 μL/孔，96 孔板）中使用 400 万个细胞。
- 之后，将相应体积的细胞悬液转移到试剂储液器（无菌）中，并用ZFL或ZEM2S的完整培养基填充至20mL。使用多通道移液器，轻轻上下混合溶液。
注意：注意不要形成泡沫或气泡。 - 使用多通道微量移液器将 200 μL 细胞悬液添加到透明聚苯乙烯 96 孔板的每个孔中。将板在28°C孵育24小时。
注意：板必须至少有三个没有空白对照池的孔，并且只应将完整的培养基添加到这些孔中。边缘效应（由边缘孔中的较高蒸发引起）通常发生在96孔板测定中，并且会影响板28边缘孔中细胞的活力。这种效果可以更高或更低，具体取决于96孔板品牌和设计28。虽然我们没有注意到边缘孔中ZFL和ZEM2S的任何细胞生长/活力干扰，但我们建议用封口膜或粘合剂密封箔密封板以防止这种影响，或者仅在60个内部孔中培养细胞并用PBS填充边缘孔。
4. 细胞暴露于测试化学品
- 使用多通道微量移液器小心地从孔中丢弃用过的培养基。
- 暴露细胞以测试不同浓度的化学物质。在没有胎牛血清（FBS）（暴露培养基）的情况下，为ZFL或ZEM2S制备培养基中测试化学浓度的溶液。然后，每孔加入 100 μL 这些溶液，一式三份（即三个孔/测试化学浓度）。
- 对于对照，将对照组与测试化学品在同一板上，一式三份（三个孔/对照组）。因此，对于空白对照 （B），在无细胞孔中加入 100 μL 暴露培养基，对于阴性对照 （NC），向有细胞的孔中加入 100 μL 暴露培养基，对于阳性对照 （PC），将细胞暴露于暴露培养基中制备的 1% Triton X-100 溶液中。在某些情况下，应将溶剂对照（SC）包含在平板中，考虑明确无细胞毒性的浓度作为最终溶剂浓度。
注意：建议使用0.5%DMSO作为溶剂;DMSO在这些细胞系中可用作高达1%的溶剂，而不会超过与阴性对照相关的10%的细胞毒性阈值。 - 将板在28°C孵育24小时。用封口膜或粘合剂密封箔密封板，以防止培养基蒸发。
注意：某些化学物质可能具有固有的背景吸光度或荧光，可能会干扰指示染料的吸光度或荧光（例如，具有颜色的化合物可能会影响吸光度，血清白蛋白29和干扰还原酶的化合物30，31）。在这种情况下，板必须包括一个额外的对照，方法是在没有细胞的孔中添加测试化学溶液。这是为了验证化学自动吸光度/自发荧光对染料的可能干扰。如果检测到干扰，应评估是否可以排除干扰，以获得正确的细胞毒性预测。
5. 细胞毒性测定
注意：根据 表1制备所有溶液。下面描述的所有步骤（图1）均在无菌条件下进行。不建议使用移液器丢弃暴露介质，因为化学处理后细胞很容易从孔中分离。
- AB 和 CFDA-AM 检测
- 在测试化学品暴露24小时后，通过将内容物倒入收集盘中，小心地丢弃暴露介质。
- 用 200 μL PBS 清洗板。通过将PBS倒入收集托盘中来小心地将其取出，以避免丢失细胞。
- 每孔加入 100 μL AB/CFDA-AM 溶液。将板在28°C的黑暗中孵育30分钟。
- 在荧光板读数器中测量 AB 的 530 nm（激发）和 595 nm（发射）以及 CFDA-AM 的 493 nm（激发）和 541 nm（发射）的荧光。
- NR 检测
注意：NR测定的步骤在AB和CFDA-AM测定后立即进行（图1）。- 将NR工作溶液（40μg/ mL）以600× g 离心10分钟。
注意：管中NR的沉淀不得转移到板上。因此，在离心NR工作溶液后，使用移液管收集上清液而不吸出NR沉淀物。将上清液转移到试剂储液槽中。 - 通过将内容物倒入收集托盘中，小心地取出 AB/CFDA-AM 溶液。
- 使用多通道微量移液器每孔加入 100 μL NR 工作溶液。将板在28°C孵育3小时。
注意：孵育3小时后，使用显微镜观察平板中是否发生NR沉淀。NR沉淀物可能会干扰细胞活力的定量，因此它们不应该存在。 - 通过将内容物倒入收集盘中，小心地取出NR溶液。通过每孔添加 150 μL PBS 来洗涤孔。
- 每孔加入 150 μL NR 提取溶液，并将板在摇床上孵育 10 分钟以轻轻摇动。在读板器中测量540nm处的吸光度。
注意：应在690nm处进行第二次读数，以排除板中的任何背景指纹吸光度。
- 将NR工作溶液（40μg/ mL）以600× g 离心10分钟。
- MTT 测定
注意：MTT测定必须与上述测定分开进行（在新板中）（图2）。- 通过将内容物倒入收集托盘中，小心地取出曝光介质。
- 使用多通道微量移液器每孔加入 100 μL MTT 工作溶液。将板在28°C孵育4小时。
- 通过将内容物倒入收集托盘来丢弃 MTT 溶液。
- 每孔加入 100 μL DMSO 以提取甲臜晶体，将板在平板振荡器上孵育 10 分钟。使用读板器测量570nm处的吸光度。
注意：应在690nm处进行第二次读数，以排除板中的任何背景指纹吸光度。需要注意的是，测试化学品可能会干扰MTT，必须对其进行评估以确保生成数据的质量32。为此，应暴露含有测试浓度和MTT（0.5mg / mL）的无细胞孔，然后孵育以观察孔中可能增加吸光度并导致假活力结果的任何颜色变化。在此测试中必须避免与MTT相互作用的化学物质。
6. 计算细胞活力/细胞毒性
注意：获得的原始吸光度或荧光用于计算与阴性对照（对于直接在暴露介质中制备的测试化学品）或溶剂对照（对于使用溶剂（例如DMSO）制备的测试化学品）相关的百分比。在确定细胞活力百分比之前，必须通过空白对照对原始数据进行归一化。
- 计算每个测试化学浓度和对照组（三个孔/处理）的平均吸光度或荧光。
- 要确定相对于对照（阴性或溶剂）的细胞活力百分比，请使用公式（2）：
（二）
注意：吸光度（abs）或荧光（fluo）单位表示每个浓度在三个孔中测量的吸光度或荧光的平均值;空白表示没有单元格的孔。
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Representative Results
图3显示了AB，CFDA-AM，NR和MTT测定的板。对于AB测定（图3A），空白孔和没有或减少活细胞数量的孔显示蓝色和低荧光，而具有大量活细胞的孔呈粉红色并呈现高荧光值，因为刃天青（AB）转化为试卤灵（粉红色物质）被活细胞。对于CFDA-AM测定，板上孔的颜色没有明显差异;然而，由于CFDA-AM的保留并随后转化为羧基荧光素（荧光物质），含有活细胞的孔中的荧光更高。
对于NR测定（图3B），空白孔必须是透明的，吸光度值非常低，因为没有细胞可以保留NR染料。在某些情况下，空白孔不透明，表明板上出现NR沉淀;在这种情况下，这不应被视为有效的实验。测试化学品和PC的高细胞毒性浓度是透明的或呈现非常浅的粉红色，吸光度值低，而含有活细胞的孔保留NR染料并呈现深粉红色和高吸光度值。
对于MTT测定（图3C），空白孔必须是透明的，并且吸光度非常低，因为没有细胞可以将MTT转化为甲胺赞。测试化学物质和PC的高细胞毒性浓度是透明的或呈现非常浅的紫色，吸光度值低，而含有活细胞的孔将MTT（黄色）转化为甲臜（紫色物质），呈现具有高吸光度值的深紫色。
图4A 显示了计算后细胞活力的代表性图形，使用每组荧光或吸光度值的平均值。可以使用数据分析软件输入活性百分比值来绘制图形，该值由协议第6节中提供的可行性计算公式计算得出。暴露于SC的细胞的活力不应比NC17低10%。根据其溶解度计算与NC或SC相关的测试化学品的细胞活力百分比。在这种情况下，不同浓度的DMSO用作测试物质，细胞活力与NC有关，NC定义为100%活力。
细胞活力数据可用于通过对数变换计算测试化学物质的一半最大抑制浓度（IC50），并在适当的重复33，34，35后通过非线性回归插值标准曲线。图4B显示了根据图4A所示的生存百分比计算的IC50。IC50 在 AB 测定中使用标称浓度至少通过三次技术重复和三次实验重复获得。使用五种不同浓度的测试物质进行分析;但是，根据实验类型，可能需要更高的浓度。例如，建议将八种测试浓度用于测距测试，该测试通常用于确定实验中化学物质的最终测试浓度。由于活力测定具有不同的细胞毒性终点，我们建议单独计算每个测定的IC50，以确定由化学物质的不同作用机制或细胞系之间的灵敏度差异引起的灵敏度差异。不同细胞系中测试化学品的IC50值的差异也可能因所用培养基的类型而异，因为与蛋白质和脂质相关的组成差异会影响化学生物利用度36。此外，许多化学物质的细胞毒性可以通过这些测定进行评估。在ZFL和ZEM2S细胞系中评估的其他化学物质的IC50如图4B-H所示。
图 1：在同一 96 孔板中进行的 AB、CFDA-AM 和 NR 测定的示意图方案。 缩写：AB = 阿拉马尔蓝;CFDA-AM = 5-羧基荧光素二乙酸乙酰氧基甲酯;NR = 中性红色;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：在 96 孔板中进行的 MTT 测定的示意图方案。 缩写：MTT = 3-[4，5-二甲基噻唑-2基]-2，5-二苯基四唑溴化物。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：AB、CFDA-AM、NR 和 MTT 测定的代表性结果。 这些图像显示了（A）AB和CFDA-AM，（B）NR和（C）MTT测定中对照和测试浓度的孔中的颜色差异。缩写：AB = 阿拉马尔蓝;CFDA-AM = 5-羧基荧光素二乙酸乙酰氧基甲酯;NR = 中性红色;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;B = 空白孔（无细胞孔）;SC = 溶剂控制（0.5% DMSO）;NC = 阴性对照（培养基中的细胞）;PC = 阳性对照（1% Triton X-100）。 请点击此处查看此图的大图。
图4：不同测试化学品的细胞活力和活力数据的计算。使用读出数据计算细胞活力可以表示为与NC或SC（A）相关的细胞活力的百分比（%）。可以通过使用活性数据通过不同测试化学品（B-H）的非线性回归插值标准曲线来评估化学品的细胞毒性。数据表示为三个技术重复和三个实验重复（AB测定）的细胞活力（点）和标准偏差（条）的平均值。请点击此处查看此图的大图。
图5：在存在（10%）和不存在（0%，完全FBS剥夺）的情况下培养的ZFL和ZEM2S细胞中进行的MTT测定24小时。 （A）通过Kruskall-Wallis试验，0%和10%FBS的ZFL细胞在细胞活力方面没有显着差异（p = 0.2286）。（B）0%和10%FBS的ZEM2S细胞通过曼-惠特尼试验显示细胞活力无显著差异（p = 0.3429）。考虑的显著性水平为 p < 0.05。数据表示为三个技术重复的中位数和四分位数间距。缩写：n.s. = 无显著差异;FBS = 胎牛血清;MTT = 3-[4，5-二甲基噻唑-2基]-2，5-二苯基四唑溴化物。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：在用 DMSO 处理（24 小时）的 ZFL 和 ZEM2S 细胞中以不同浓度（0.1%、0.5% 和 1%）和阴性对照进行的 MTT 和 NR 测定。 通过（A）MTT测定（p = 0.074）和（B）NR测定（p = 0.216），在任何测试浓度下DMSO处理的ZFL细胞均未显示与NC相关的细胞活力显着差异。DMSO处理的ZEM2S细胞通过（C）MTT测定（p = 0.422）和（D）NR测定（p = 0.287）未显示出与NC相关的细胞活力的显着差异。考虑克鲁斯卡尔-瓦利斯检验中的显著性水平为 p < 0.05。数据表示为三个技术重复的中位数和四分位数间距。缩写：n.s. = 无显著差异;NC = 阴性对照;MTT = 3-[4，5-二甲基噻唑-2基]-2，5-二苯基四唑溴化物;NR = 中性红色。 请点击此处查看此图的大图。
表1：本协议中使用的溶液和培养基。请按此下载此表格。
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Discussion
细胞毒性测定广泛用于体外毒性评估，本协议文章介绍了四种常用的细胞毒性测定，修改后可在斑马鱼细胞系中进行（即，96孔板的细胞密度，MTT测定中的孵育时间，化学暴露条件下的FBS耗竭和SC的最大可接受浓度）。由于这些测定通过不同的细胞活力终点（代谢功能、溶酶体膜完整性和细胞膜完整性）量化细胞毒性，因此它们的组合提供了斑马鱼细胞系中化学细胞毒性的准确评估。该协议还建议在无CO2条件下培养ZFL和ZEM2S细胞系，因为它们的培养基组成可以充分缓冲培养系统，将pH保持在7.4（生理pH）。该协议中提出的两种细胞系的培养基组成和无CO2环境在文献中广泛报道。ZFL细胞系通常在L-15和RPMI培养基中培养，添加或不添加碳酸氢钠，不添加CO237，38，39，40，41，42，43。同时，根据生物资源中心的说明培养ZEM2S细胞系，其培养基配制用于无CO2培养;因此，当使用这种类型的培养基时，CO2和空气混合物可能对细胞有害44。
根据已发表的研究，在不添加FBS的情况下在培养基中进行化学暴露，表明化学物质在 体外 测定中的生物利用度受到其与血清蛋白结合的显着影响。例如，Chen等人45 表明，RTgill-W1测定中血清蛋白的存在可以将阳离子表面活性剂（C12-苯扎氯铵）的生物利用度降低多达三倍半。在培养基45中，与FBS结合的化学物质通常在47%至90%之间。因此，为了避免这个问题，我们使用MTT测定法评估了ZFL和ZEM2S细胞在完全剥夺FBS24小时的培养物中的细胞活力。结果显示，具有（10%）和不含（0%）FBS的ZFL或ZEM2S培养物的细胞活力没有显着差异，表明这些斑马鱼细胞系可以在不含FBS的培养基中进行化学处理（图5）。重要的是要强调，减少FBS的量可能会对化学生物利用度造成其他后果。例如，亲脂性化学品对塑料实验室器具和平板的吸附性更高，降低了化学生物利用度36。然而，由于血清成分与塑料竞争与化学品的结合，培养基中FBS的存在会降低塑料结合46。与FBS补充百分比或其完全剥夺有关的最佳决定可能取决于测试化学品的类型。例如，Pomponio等人46 报道，尽管在没有FBS的情况下，化学胺碘酮与塑料具有更高的结合力，但在使用10%FBS时，其生物利用度甚至更低。对于单-N-去乙基胺碘酮，几乎相同的量与血清培养基和壁结合46。
通常建议在体外测定中使用高达0.5%的有机溶剂（例如DMSO）。然而，这种低浓度会损害测试较高浓度的劣水溶性化学品。为了防止这个问题，我们评估了更高浓度的DMSO是否适用于不超过10%细胞毒性阈值的ZFL和ZEM2S细胞系。为此，处理未处理的细胞（NC）和用不同浓度的DMSO（0.1%，0.5%和1%）处理的细胞（24小时）以进行MTT和NR测定。结果显示，与NC相比，治疗组的细胞活力没有显着差异（图6），表明在这些特定条件下，可以使用高达1%的DMSO浓度。其他鱼类细胞系也支持高于0.5%的DMSO浓度，这不是ZFL和ZEM2S细胞系的特殊性。例如，最大溶剂浓度高达2%的DMSO（未观察到细胞毒性作用）已应用于使用CHSE-214（来源于Oncorhynchus tshawytscha胚胎的细胞系）47，RTG-2（Oncorhynchus mykiss性腺细胞系）48，49，50和PLHC-1（Poeciliopsis lucida hepatocelloma细胞系）48的细胞毒性测定。 细胞。1% DMSO的最大溶剂浓度也已用于使用RTL-W1（Oncorhynchus mykiss性腺细胞系）51和CCO（Ictalurus punctatus卵巢细胞系）52细胞的细胞毒性测定。根据Mori和Wakabayashi47，鱼细胞系对DMSO的敏感性可能低于哺乳动物细胞系。然而，需要强调的是，1% DMSO的最大可接受浓度专门针对细胞毒性进行定义，应仔细评估ZFL和ZEM2S细胞系中的其他终点（例如遗传毒性、表观遗传学、蛋白质编码基因表达分析）。
MTT和AB测定基于代谢活性来确定细胞活力。尽管MTT测定是最常用的活力测定，但与AB测定相比，它的灵敏度可能略低，在某些情况下高估了细胞活力53。AB测定的较高灵敏度可能与测量方法有关，因为荧光测量比比色测量更灵敏15。尽管如此，AB和MTT测定都是鉴定细胞毒性化学物质的高质量测定，其生成的数据已用于根据其内在细胞毒性潜力对危险化学物质进行分类53。
在同一板中进行 AB、CFDA-AM 和 NR 测定的想法基于 OECD TG 249（RTgill-W1 测定）17;然而，进行了修改以在96孔板中进行这些测定，并适用于斑马鱼细胞系。在 96 孔板而不是 24 孔板中进行检测对于鱼细胞系的高通量细胞毒性测试是有利的。此外，RTgill-W1测定仅使用L-15培养基，而ZFL和ZEM2S细胞系在含有D-葡萄糖的培养基中培养。培养基使得在这些细胞系中进行MTT测定成为可能，因为在无葡萄糖培养基（例如，仅L-15）中培养的细胞系可能会立即降低细胞中的MTT减少并损害该测定的性能54。该协议允许在两个斑马鱼细胞系中轻松进行四种不同的活力测定。
该协议可用于通过使用 体外 模型研究化学物质对鱼类的影响。不同的细胞系可能具有不同的灵敏度来估计化学效应，即使它们来自同一组脊椎动物，如鱼类。例如，将ZFL和ZF4细胞系与鱼胚胎进行比较，Langu-Mitea等人21 证明，与鱼胚胎毒性测试相比，ZFL能够产生类似的结果。Tanneberger等人5表明， 与 体内 （成年鱼）相比，永久性鱼细胞系GSF，PLHC，RTG-2，RTgill-W1和R1在预测化学鱼毒性方面具有不同的敏感性。尽管RTgill-W1（永久性鱼鳃细胞系）最近被验证为预测鱼类急性毒性的替代方法，但应研究其他细胞系在生态毒性研究中的适用性。使用来自不同鱼类和组织起源以及发育阶段的细胞系（ZEM2S：胚胎;ZFL：成年肝脏）可能对生态毒性研究有重大贡献，因为它可以解决与鱼类发育的特定阶段和靶器官有关的影响。因此，应使用反映鱼类中不同靶位点（例如肝脏，性腺，鳃，大脑）的不同细胞培养物来研究化学效应，而不仅仅是在单个细胞系中55。
这些方案在生态毒性研究中可以有不同的应用，它们的使用不一定仅限于预测鱼类的急性毒性。例如，它们可用于确定亚细胞毒性浓度，以执行其他体外鱼类毒性测试，例如评估内分泌对鱼类的干扰作用。此外，体外细胞毒性数据还可以帮助开发和改进基于生理学的毒代动力学（PBTK）建模。由于PBTK专注于考虑不同器官（如鳃，肝脏或肠道）的化学物质在生物体中的分布56，因此使用来自不同鱼类和组织来源的细胞系可能是该模型的有用信息来源。体外生物测定（例如，细胞毒性测定）的结果提供了代表PBTK模型中生物过程的输入数据，并有助于体外到体内外推21，56。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
为了纪念这部作品的合著者Márcio Lorencini博士，他是化妆品领域的优秀研究人员，致力于促进巴西的化妆品研究。作者感谢生理学系（UFPR）的多用户实验室提供设备，并感谢高等教育人员改进协调（CAPES，巴西）（财务代码001）和Grupo Boticario的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
| Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | Powder |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Powder |
| Neutral red | Sigma-Aldrich | N4638 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Powder |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder, bioreagent for molecular biology |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
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