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ज़ेब्राफिश सेल लाइनों के साथ साइटोटॉक्सिसिटी परख

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64860
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 3
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

यह प्रोटोकॉल आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले साइटोटॉक्सिसिटी परख (अलामर ब्लू [एबी], सीएफडीए-एएम, न्यूट्रल रेड और एमटीटी परख) को प्रस्तुत करता है जो 96-वेल प्लेटों में जेब्राफिश भ्रूण (जेडईएम 2 एस) और यकृत (जेडएफएल) सेल लाइनों में साइटोटॉक्सिसिटी के आकलन के लिए अनुकूलित है।

Abstract

इकोटॉक्सिसिटी अध्ययनों में मछली सेल लाइनों का तेजी से उपयोग किया गया है, और साइटोटॉक्सिसिटी परख को मछली तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के तरीकों के रूप में प्रस्तावित किया गया है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल 96-वेल प्लेटों में ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) भ्रूण (जेडईएम 2 एस) और यकृत (जेडएफएल) सेल लाइनों में सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए संशोधित साइटोटॉक्सिसिटी परख प्रस्तुत करता है। मूल्यांकन किए गए साइटोटॉक्सिसिटी समापन बिंदु माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता (अलामार ब्लू [एबी] और एमटीटी परख), एस्टेरेज गतिविधि (सीएफडीए-एएम परख) के माध्यम से झिल्ली अखंडता, और लाइसोसोमल झिल्ली अखंडता (तटस्थ लाल [एनआर] परख) हैं। 96-वेल प्लेट में परीक्षण पदार्थों के संपर्क में आने के बाद, साइटोटॉक्सिसिटी परख का प्रदर्शन किया जाता है; यहां, एबी और सीएफडीए-एएम एक साथ किए जाते हैं, इसके बाद एक ही प्लेट पर एनआर होता है, जबकि एमटीटी परख एक अलग प्लेट पर किया जाता है। इन परखों के लिए रीडआउट एबी और सीएफडीए-एएम के लिए प्रतिदीप्ति द्वारा लिया जाता है, और एमटीटी और एनआर के लिए अवशोषण किया जाता है। इन मछली सेल लाइनों के साथ किए गए साइटोटॉक्सिसिटी परख का उपयोग मछली पर रासायनिक पदार्थों की तीव्र विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

रासायनिक पदार्थों को मानव स्वास्थ्य और पर्यावरण के लिए उनकी सुरक्षा के बारे में परीक्षण करने की आवश्यकता है। नियामक एजेंसियों और / या कानूनों (जैसे, रीच, ओईसीडी, यूएस ईपीए) 1,2 द्वारा जीवित जीवों पर प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए सुरक्षा आकलन में आणविक और सेलुलर बायोमाकर्स पर तेजी से विचार किया गया है, क्योंकि वे विवो प्रतिकूल परिणाम (जैसे, अंतःस्रावी व्यवधान, प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रिया, तीव्र विषाक्तता, फोटोटॉक्सिसिटी) 3,4,5,6,7 से पहले हो सकते हैं। . इस संदर्भ में, साइटोटॉक्सिसिटी को मछली तीव्र विषाक्तता 5,8 की भविष्यवाणी करने के लिए एक माप के रूप में लिया गया है; हालांकि, इकोटॉक्सिसिटी अध्ययनों में इसके कई अन्य अनुप्रयोग हो सकते हैं, जैसे कि मछली पर प्रभावों के अपने सबसे विविध सेट का अध्ययन करने के लिए रासायनिक पदार्थों की उप-साइटोटोक्सिक सांद्रता को परिभाषित करना (जैसे, अंतःस्रावी-विघटनकारी प्रभाव)।

सेल कल्चर सिस्टम (इन विट्रो सिस्टम) में, रासायनिक पदार्थों की साइटोटॉक्सिसिटी को समापन बिंदुओं के प्रकारों में भिन्न तरीकों से निर्धारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक साइटोटॉक्सिसिटी विधि कोशिका मृत्यु प्रक्रिया के दौरान देखी गई विशिष्ट आकृति विज्ञान से संबंधित समापन बिंदु पर आधारित हो सकती है, जबकि दूसरा कोशिका मृत्यु, व्यवहार्यता और कार्यक्षमता, आकृति विज्ञान, ऊर्जा चयापचय और कोशिका लगाव और प्रसार के माप द्वारा साइटोटॉक्सिसिटी निर्धारित कर सकता है। रासायनिक पदार्थ विभिन्न तंत्रों के माध्यम से सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं, इस प्रकाररासायनिक प्रभावों की भविष्यवाणी करने के लिए विभिन्न सेल व्यवहार्यता समापन बिंदुओं को कवर करने वाला साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन आवश्यक है।

एमटीटी और अलामार ब्लू (एबी) परख हैं जो सेल चयापचय गतिविधि के आधार पर सेल व्यवहार्यता पर प्रभाव निर्धारित करते हैं। एमटीटी परख माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइम सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज10 की गतिविधि का मूल्यांकन करता है। पीले रंग के 3-[4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2इल]-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) की फॉर्माज़ान ब्लू में कमी केवल व्यवहार्य कोशिकाओं में होती है, और इसका ऑप्टिकल घनत्व व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या10 के सीधे आनुपातिक होता है। एबी परख एक संवेदनशील ऑक्सीकरण-कमी संकेतक है, जो माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइमों द्वारा मध्यस्थ है जो जीवित कोशिकाओं द्वारा रेसाज़ुरिन को रेसोरुफिन में कम करने पर रंग बदलताहै। हालांकि, साइटोसोलिक और माइक्रोसोमल एंजाइम भी एबी और एमटीटी12 की कमी में योगदान करते हैं। इन एंजाइमों में कई रिडक्टेस शामिल हो सकते हैं, जैसे कि अल्कोहल और एल्डिहाइड ऑक्सीडोरडक्टेस, एनएडी (पी) एच: क्विनोन ऑक्सीडोरडक्टेस, फ्लेविन रिडक्टेस, एनएडीएच डिहाइड्रोजनेज और साइटोक्रोम11।

न्यूट्रल रेड (एनआर) परख एक सेल व्यवहार्यता परख है जो व्यवहार्य कोशिकाओं के लाइसोसोम में इस डाई को शामिल करने पर आधारितहै। एनआर का उत्थान पीएच ग्रेडिएंट बनाए रखने के लिए कोशिकाओं की क्षमता पर निर्भर करता है। लाइसोसोम के अंदर प्रोटॉन ढाल साइटोप्लाज्म की तुलना में कम पीएच बनाए रखता है। सामान्य शारीरिक पीएच पर, एनआर लगभग शून्य का शुद्ध चार्ज प्रस्तुत करता है, जो इसे कोशिका झिल्ली में प्रवेश करने में सक्षम बनाता है। इस प्रकार, डाई चार्ज हो जाती है और लाइसोसोम के अंदर बनी रहती है। नतीजतन, बनाए गए एनआर की मात्रा जितनी अधिक होगी, व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्याउतनी ही अधिक होगी। रासायनिक पदार्थ जो कोशिका की सतह या लाइसोसोमल झिल्ली को नुकसान पहुंचाते हैं, इस डाई के उत्थान को बाधित करते हैं।

सीएफडीए-एएम परख एक फ्लोरोमेट्रिक सेल व्यवहार्यता परख है जो 5-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन डायसेटेट एसिटॉक्सीमिथाइल एस्टर (सीएफडीए-एएम) 15 के प्रतिधारण पर आधारित है। 5-सीएफडीए-एएम, एक एस्टरेज़ सब्सट्रेट, कार्बोक्सीफ्लोरेसिन में परिवर्तित हो जाता है, एक फ्लोरोसेंट पदार्थ जो जीवित कोशिकाओं के झिल्ली द्वारा ध्रुवीय और गैर-पारगम्य है15; इस प्रकार, यह एक बरकरार कोशिका झिल्ली के आंतरिक पक्ष में बरकरार रखा जाता है, जो व्यवहार्य कोशिकाओं का संकेत देता है।

हाल ही में, तीन साइटोटॉक्सिसिटी परख (सीएफडीए-एएम, एनआर, और एबी परख) को एक मान्य आईएसओ (मानकीकरण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संगठन) दिशानिर्देश (आईएसओ 21115: 2019)16 और ओईसीडी (आर्थिक सहयोग और विकास संगठन) परीक्षण विधि (ओईसीडी टीजी 249) में संयुक्त किया गया था ताकि 24-वेल प्लेटों में आरटीगिल-डब्ल्यू 1 सेल लाइन (रेनबो ट्राउट [ऑन्कोरिन्चस मायकिस] गिल से स्थायी सेल लाइन) का उपयोग करके मछली तीव्र विषाक्तता का मूल्यांकनकिया जा सके। . यद्यपि मछली तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए एक मौजूदा सेल-आधारित विधि है, अन्य मछली प्रजातियों के साथ समान तरीकों को विकसित करने और विधि के थ्रूपुट को बढ़ाने में प्रयास किए गए हैं। कुछ उदाहरणों में विशिष्ट विषाक्ततामार्गों 18,19 के लिए रिपोर्टर जीन के साथ स्थानांतरित जेडएफएल सेललाइनों का विकास, आरटीगिल-डब्ल्यू 1 सेल लाइन20 में फोटोटॉक्सिसिटी परीक्षण, और जेडएफएल और जेडएफ 4 सेल लाइनों (1 दिन पुराने भ्रूण से प्राप्त ज़ेब्राफिश फाइब्रोब्लास्टिक) का उपयोग शामिल है।

डेनियो रेरियो (ज़ेबराफिश) जलीय विषाक्तता अध्ययन में उपयोग की जाने वाली मुख्य मछली प्रजातियों में से एक है; इस प्रकार, मछली विषाक्तता परीक्षण के लिए ज़ेब्राफिश सेल लाइनों के साथ सेल-आधारित तरीके बेहद उपयोगी हो सकते हैं। जेडएफएल सेल लाइन एक ज़ेब्राफिश उपकला हेपेटोसाइट सेल लाइन है जो यकृत पैरेन्काइमल कोशिकाओं की मुख्य विशेषताओं को प्रस्तुत करती है और ज़ेनोबायोटिक्स 7,22,23,24,25 को चयापचय कर सकती है। इस बीच, जेडईएम 2 एस सेल लाइन ब्लास्टुला चरण से प्राप्त एक भ्रूण जेब्राफिश फाइब्रोब्लास्टिक सेल लाइन है जिसका उपयोग मछली26,27 पर विकासात्मक प्रभावों की जांच के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल चार साइटोटॉक्सिसिटी परख (एमटीटी, एबी, एनआर, और सीएफडीए-एएम परख) का वर्णन करता है, जिसमें 96-वेल प्लेटों में जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों के साथ किए जाने वाले संशोधन शामिल हैं।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों की सूची के लिए सामग्री की तालिका और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधान और मीडिया की संरचना के लिए तालिका 1 देखें।

1. ZFL और ZEM2S कोशिकाओं की तैयारी

  1. 80% संगम के साथ ZFL या ZEM2S कोशिकाओं के T75 फ्लास्क से शुरू करें, जो CO2 के बिना 28 डिग्री सेल्सियस पर संबंधित पूर्ण माध्यम में संवर्धित होते हैं।
  2. फ्लास्क से कल्चर माध्यम को हटा दें और 10 एमएल 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (0.01 एम) जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। कल्चर फ्लास्क में 3 एमएल 1x ट्रिप्सिन (0.05% v/v; 0.5 mM ट्रिप्सिन-EDTA) जोड़ें। 3 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. कोशिकाओं को छोड़ने के लिए फ्लास्क को धीरे से टैप करें, और फिर फ्लास्क में 3 एमएल पूर्ण संस्कृति माध्यम जोड़कर ट्रिप्सिन पाचन को रोकें।
  4. सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें, जेडएफएल या जेडईएम 2 एस कोशिकाओं के लिए पूर्ण माध्यम का 1 एमएल जोड़ें, और माइक्रोपिपेट का उपयोग करके गोली को फिर से निलंबित करें।

2. ट्रिपैन ब्लू डाई बहिष्करण द्वारा सेल गिनती

  1. कोशिकाओं की गणना करने और उनकी व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए माइक्रोट्यूब में सेल निलंबन के 10 μL और ट्रिपैन ब्लू डाई के 10 μL जोड़ें। एक पिपेट का उपयोग करके सेल सस्पेंशन और डाई मिलाएं।
  2. फिर, इस मिश्रण के 10 μL (सेल सस्पेंशन + ट्रिपैन ब्लू) को एक न्यूबॉयर कक्ष में स्थानांतरित करें और कक्ष के कोनों पर रखे गए चार बड़े वर्गों (क्वाड्रेंट्स क्यू) में कोशिकाओं की गणना करें, व्यवहार्य कोशिकाओं को उन लोगों के रूप में मानते हुए जो ट्रिपैन ब्लू नहीं लेते हैं। समीकरण (1) का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें:
    Equation 1 (1)
  3. समीकरण (1) का उपयोग करके निर्धारित सेल संख्या को दो (ट्रिपैन ब्लू के उपयोग के कारण कमजोर पड़ने वाला कारक) से गुणा करके सेल निलंबन में अंतिम सेल संख्या की गणना करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक स्वचालित सेल गिनती प्रणाली (जैसे, सेल गिनती और व्यवहार्यता फ़ंक्शन के साथ एक साइटोमर) का उपयोग किया जा सकता है।

3. 96-वेल प्लेटों में सेल चढ़ाना

  1. साइटोटॉक्सिसिटी परख करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यक सेल निलंबन मात्रा की गणना करें। प्रत्येक सेल लाइन के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या नीचे इंगित की गई है:
    1. प्लेट 60,000 व्यवहार्य जेडईएम 2 एस कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से; इस प्रकार, पूरी प्लेट के लिए, पूर्ण माध्यम के 20 एमएल (200 μL / वेल, 96-वेल प्लेट) में छह मिलियन कोशिकाओं का उपयोग करें।
    2. प्लेट 40,000 व्यवहार्य जेडएफएल कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से; इस प्रकार, पूरी प्लेट के लिए, पूर्ण माध्यम के 20 एमएल (200 μL / वेल, 96-वेल प्लेट) में चार मिलियन कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. उसके बाद, सेल निलंबन की संबंधित मात्रा को एक अभिकर्मक जलाशय (बाँझ) में स्थानांतरित करें और जेडएफएल या जेडईएम 2 एस के लिए पूर्ण संस्कृति माध्यम से 20 एमएल तक भरें। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, घोल को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे मिलाएं।
    नोट: फोम या बुलबुले न बनाने का ध्यान रखें।
  3. मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके पारदर्शी पॉलीस्टाइनिन 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल सस्पेंशन का 200 μL जोड़ें। प्लेटों को 28 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्लेट में रिक्त नियंत्रण के लिए कोशिकाओं के बिना कम से कम तीन कुएं होने चाहिए, और इन कुओं में केवल पूर्ण मीडिया जोड़ा जाना चाहिए। किनारे का प्रभाव (किनारे के कुओं में उच्च वाष्पीकरण के कारण) आमतौर पर 96-वेल प्लेट परख में होता है और प्लेट28 के किनारे के कुओं में कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है। यह प्रभाव 96-वेल प्लेट ब्रांड और डिजाइन28 के आधार पर अधिक या कम हो सकता है। यद्यपि हमने किनारे के कुओं में जेडएफएल और जेडईएम 2 एस के लिए कोई सेल वृद्धि / व्यवहार्यता गड़बड़ी नहीं देखी, हम इस प्रभाव को रोकने के लिए प्लेट को पैराफिल्म या चिपकने वाली सीलिंग पन्नी के साथ सील करने का सुझाव देते हैं, या कोशिकाओं को केवल 60 अंदर के कुओं में खेती करते हैं और पीबीएस के साथ किनारे के कुओं को भरते हैं।

4. रसायन का परीक्षण करने के लिए कोशिकाओं का जोखिम

  1. मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके कुओं से खर्च किए गए मीडिया को सावधानीपूर्वक छोड़ दें।
  2. विभिन्न सांद्रता में रसायनों का परीक्षण करने के लिए कोशिकाओं को उजागर करें। भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (एक्सपोजर मीडिया) के बिना जेडएफएल या जेडईएम 2 एस के लिए संस्कृति मीडिया में परीक्षण रासायनिक सांद्रता के समाधान तैयार करें। फिर, तकनीकी तीन प्रतियों (यानी, तीन कुओं / परीक्षण रासायनिक एकाग्रता) में इन समाधानों में से 100 μL प्रति कुएं जोड़ें।
  3. नियंत्रण के लिए, नियंत्रण समूहों को तकनीकी तीन प्रतियों (तीन कुओं / नियंत्रण समूह) में परीक्षण रसायन के समान प्लेट पर रखें। इस प्रकार, रिक्त नियंत्रण (बी) के लिए, सेल-मुक्त कुओं में एक्सपोजर मीडिया के 100 μL जोड़ें, नकारात्मक नियंत्रण (NC) के लिए, कोशिकाओं के साथ कुओं में एक्सपोजर मीडिया के 100 μL जोड़ें, और सकारात्मक नियंत्रण (पीसी) के लिए, कोशिकाओं को एक्सपोज़र मीडिया में तैयार 1% ट्राइटन एक्स -100 के समाधान के लिए उजागर करें। कुछ मामलों में, एक विलायक नियंत्रण (एससी) को प्लेट में शामिल किया जाना चाहिए, स्पष्ट रूप से गैर-साइटोटोक्सिक एकाग्रता को अंतिम विलायक एकाग्रता के रूप में माना जाना चाहिए।
    नोट: विलायक के रूप में 0.5% डीएमएसओ का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है; डीएमएसओ का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण से संबंधित 10% की साइटोटॉक्सिसिटी सीमा को पार किए बिना इन सेल लाइनों में विलायक के रूप में 1% तक किया जा सकता है।
  4. प्लेटों को 28 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। संस्कृति माध्यम वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लेटों को पैराफिल्म या चिपकने वाली सीलिंग पन्नी के साथ सील करें।
    नोट: कुछ रसायनों में आंतरिक पृष्ठभूमि अवशोषण या प्रतिदीप्ति हो सकती है जो संकेतक डाई (ओं) के अवशोषण या प्रतिदीप्ति में हस्तक्षेप कर सकती है (उदाहरण के लिए, रंग वाले यौगिक अवशोषण, सीरम एल्बुमिन29, और कमी एंजाइम30,31 में हस्तक्षेप करने वाले यौगिकों को प्रभावित कर सकते हैं)। इस मामले में, प्लेट को कोशिकाओं के बिना कुओं में परीक्षण रासायनिक समाधान जोड़कर एक अतिरिक्त नियंत्रण शामिल करना चाहिए। यह रंगों के साथ रासायनिक ऑटो-अवशोषण / ऑटोफ्लोरेसेंस के संभावित हस्तक्षेप को सत्यापित करने के लिए है। यदि हस्तक्षेप का पता लगाया जाता है, तो किसी को यह मूल्यांकन करना चाहिए कि साइटोटॉक्सिसिटी की सही भविष्यवाणी प्राप्त करने के लिए इसे बाहर रखा जा सकता है या नहीं।

5. साइटोटॉक्सिसिटी परख

नोट: तालिका 1 के अनुसार सभी समाधान तैयार करें। नीचे वर्णित सभी चरण (चित्रा 1) बाँझ परिस्थितियों में किए जाते हैं। एक्सपोजर मीडिया को त्यागने के लिए पिपेट के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि रासायनिक उपचार के बाद कोशिकाएं आसानी से कुओं से अलग हो सकती हैं।

  1. एबी और सीएफडीए-एएम परीक्षण
    1. परीक्षण रासायनिक एक्सपोजर के 24 घंटे के बाद, सामग्री को संग्रह ट्रे में डालकर एक्सपोजर मीडिया को सावधानीपूर्वक छोड़ दें।
    2. प्लेट को 200 μL PBS से धो लें। कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए पीबीएस को एक संग्रह ट्रे में डालकर सावधानीपूर्वक हटा दें।
    3. CFDA-AM समाधान के प्रति अच्छी तरह से 100 μL जोड़ें। प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. एबी के लिए 530 एनएम (उत्तेजना) और 595 एनएम (उत्सर्जन) पर फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर में फ्लोरेसेंस को मापें, और सीएफडीए-एएम के लिए 493 एनएम (उत्तेजना) और 541 एनएम (उत्सर्जन) पर।
  2. एनआर परख
    नोट: एनआर परख के लिए कदम एबी और सीएफडीए-एएम परख (चित्रा 1) के तुरंत बाद किए जाते हैं।
    1. एनआर वर्किंग सॉल्यूशन (40 μg / mL) को 10 मिनट के लिए 600 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: ट्यूब में एनआर की वर्षा को प्लेटों में स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए। इस प्रकार, एनआर वर्किंग सॉल्यूशन के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एनआर अवक्षेप को एस्पिरेटेड किए बिना पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाला एकत्र करें। सतह पर तैरने वाले को अभिकर्मक जलाशय में स्थानांतरित करें।
    2. सामग्री को संग्रह ट्रे में डालकर एबी / सीएफडीए-एएम समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    3. मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एनआर वर्किंग सॉल्यूशन के प्रति वेल 100 μL जोड़ें। प्लेट को 3 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: 3 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, देखें कि माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्लेटों में एनआर वर्षा हुई है या नहीं। एनआर अवक्षेप सेल व्यवहार्यता की मात्रा में हस्तक्षेप कर सकते हैं, इस प्रकार, उन्हें मौजूद नहीं होना चाहिए।
    4. सामग्री को संग्रह ट्रे में डालकर एनआर समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें। कुओं को प्रति कुएं 150 μL PBS जोड़कर धोएं।
    5. एनआर निष्कर्षण समाधान के प्रति कुएं में 150 μL जोड़ें और प्लेट को धीरे से हिलाने के लिए 10 मिनट के लिए प्लेट शेकर पर इनक्यूबेट करें। एक प्लेट रीडर में 540 एनएम पर अवशोषण मापें।
      नोट: प्लेट में किसी भी पृष्ठभूमि फिंगरप्रिंट अवशोषण को बाहर करने के लिए 690 एनएम पर एक दूसरा रीडआउट किया जाना चाहिए।
  3. एमटीटी परख
    नोट: एमटीटी परख को ऊपर वर्णित परख (एक नई प्लेट में) से अलग किया जाना चाहिए (चित्रा 2)।
    1. सामग्री को संग्रह ट्रे में डालकर एक्सपोज़र मीडिया को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    2. मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके प्रति अच्छी तरह से एमटीटी वर्किंग सॉल्यूशन के 100 μL जोड़ें। प्लेट को 4 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. सामग्री को संग्रह ट्रे में डालकर एमटीटी समाधान को छोड़ दें।
    4. फॉर्माज़ान क्रिस्टल निकालने के लिए डीएमएसओ के प्रति कुएं में 100 μL जोड़ें, प्लेट को 10 मिनट के लिए प्लेट शेकर पर इनक्यूबेट करें। प्लेट रीडर का उपयोग करके 570 एनएम पर अवशोषण को मापें।
      नोट: प्लेट में किसी भी पृष्ठभूमि फिंगरप्रिंट अवशोषण को बाहर करने के लिए 690 एनएम पर एक दूसरा रीडआउट किया जाना चाहिए। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि परीक्षण रसायन एमटीटी के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जिसका मूल्यांकन उत्पन्न डेटाकी गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए। इसके लिए, परीक्षण सांद्रता और एमटीटी (0.5 मिलीग्राम / एमएल) वाले सेल-मुक्त कुओं को उजागर किया जाना चाहिए, इसके बाद कुओं में किसी भी रंग परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए इनक्यूबेशन किया जाना चाहिए जो अवशोषण को बढ़ा सकता है और गलत व्यवहार्यता परिणाम पैदा कर सकता है। इस परीक्षण में एमटीटी के साथ बातचीत करने वाले रसायनों से बचना चाहिए।

6. सेल व्यवहार्यता / साइटोटॉक्सिसिटी की गणना

नोट: कच्चे अवशोषण या प्रतिदीप्ति अधिग्रहित का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण (एक्सपोजर मीडिया में सीधे तैयार किए गए परीक्षण रसायनों के लिए) या विलायक नियंत्रण (डीएमएसओ जैसे सॉल्वैंट्स का उपयोग करके तैयार परीक्षण रसायनों के लिए) से संबंधित प्रतिशत के रूप में सेल व्यवहार्यता की गणना करने के लिए किया जाता है। सेल व्यवहार्यता प्रतिशत निर्धारित करने से पहले, कच्चे डेटा को रिक्त नियंत्रण द्वारा सामान्यीकृत किया जाना चाहिए।

  1. प्रत्येक परीक्षण रासायनिक एकाग्रता और नियंत्रण समूह (तीन कुओं / उपचार) के लिए औसत अवशोषण या प्रतिदीप्ति की गणना करें।
  2. नियंत्रण (नकारात्मक या विलायक) के सापेक्ष सेल व्यवहार्यता प्रतिशत निर्धारित करने के लिए, समीकरण (2) का उपयोग करें:
    Equation 2 (2)
    नोट: अवशोषण (एबीएस) या प्रतिदीप्ति (फ्लूओ) इकाइयां प्रति एकाग्रता तीन कुओं में मापा गया अवशोषण या प्रतिदीप्ति के औसत का प्रतिनिधित्व करती हैं; रिक्त कोशिकाओं के बिना कुओं का प्रतिनिधित्व करता है।

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Representative Results

चित्रा 3 एबी, सीएफडीए-एएम, एनआर और एमटीटी परख की प्लेटों को दर्शाता है। एबी परख (चित्रा 3 ए) के लिए, खाली कुएं और कुएं जिनमें व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या कम या कम नहीं होती है, नीले रंग और कम प्रतिदीप्ति दिखाते हैं, जबकि उच्च संख्या में व्यवहार्य कोशिकाओं वाले कुएं गुलाबी होते हैं और व्यवहार्य कोशिकाओं द्वारा रेसाज़ुरिन (एबी) के रेसोरुफिन (गुलाबी पदार्थ) में परिवर्तन के कारण उच्च प्रतिदीप्ति मान प्रस्तुत करते हैं। सीएफडीए-एएम परख के लिए, प्लेट पर कुओं के रंग में कोई स्पष्ट अंतर नहीं है; हालांकि, सीएफडीए-एएम के प्रतिधारण और बाद में कार्बोक्सीफ्लोरेसिन (फ्लोरोसेंट पदार्थ) में रूपांतरण के कारण व्यवहार्य कोशिकाओं वाले कुओं में प्रतिदीप्ति अधिक है।

एनआर परख (चित्रा 3 बी) के लिए, खाली कुओं को बहुत कम अवशोषण मूल्यों के साथ पारदर्शी होना चाहिए क्योंकि एनआर डाई को बनाए रखने के लिए कोई कोशिकाएं नहीं हैं। कुछ मामलों में, खाली कुएं पारदर्शी नहीं होते हैं, जो प्लेट पर एनआर वर्षा की घटना का संकेत देते हैं; इस उदाहरण में, इसे एक वैध प्रयोग नहीं माना जाना चाहिए। परीक्षण रसायनों और पीसी की अत्यधिक साइटोटोक्सिक सांद्रता पारदर्शी होती है या कम अवशोषण मूल्यों के साथ बहुत हल्का गुलाबी रंग पेश करती है, जबकि व्यवहार्य कोशिकाओं वाले कुएं एनआर डाई को बनाए रखते हैं और गहरे गुलाबी रंग और उच्च अवशोषण मूल्यों को प्रस्तुत करते हैं।

एमटीटी परख (चित्रा 3 सी) के लिए, खाली कुएं पारदर्शी और बहुत कम अवशोषण के साथ होने चाहिए क्योंकि एमटीटी को फॉर्माज़ान में परिवर्तित करने के लिए कोई कोशिकाएं नहीं हैं। परीक्षण रसायनों और पीसी की अत्यधिक साइटोटोक्सिक सांद्रता पारदर्शी होती है या कम अवशोषण मूल्यों के साथ एक बहुत ही हल्का बैंगनी रंग पेश करती है, जबकि व्यवहार्य कोशिकाओं वाले कुएं एमटीटी (पीले) को फॉर्माज़ान (बैंगनी पदार्थ) में बदल देते हैं, उच्च अवशोषण मूल्यों के साथ एक गहरा बैंगनी रंग प्रस्तुत करते हैं।

चित्रा 4 ए प्रति समूह प्रतिदीप्ति या अवशोषण मूल्यों के औसत का उपयोग करके गणना के बाद सेल व्यवहार्यता का एक प्रतिनिधि ग्राफिक दिखाता है। ग्राफिक को व्यवहार्यता प्रतिशत मूल्यों के इनपुट के साथ प्लॉट किया जा सकता है, जिसकी गणना डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोटोकॉल अनुभाग 6 में प्रस्तुत व्यवहार्यता गणना सूत्र द्वारा की जाती है। एससी के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं की व्यवहार्यता एनसी 17 की तुलना में10% कम नहीं होनी चाहिए। परीक्षण रसायनों के लिए सेल व्यवहार्यता प्रतिशत की गणना एनसी या एससी से संबंधित की जाती है, जो उनकी घुलनशीलता पर निर्भर करता है। इस मामले में, डीएमएसओ की विभिन्न सांद्रता का उपयोग परीक्षण पदार्थ के रूप में किया जाता है और सेल व्यवहार्यता एनसी से संबंधित है, जिसे 100% व्यवहार्यता के रूप में परिभाषित किया गया है।

सेल व्यवहार्यता डेटा का उपयोग लघुगणकीय परिवर्तन द्वारा परीक्षण रसायनों की आधी अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी50) की गणना करने के लिए किया जा सकता है, और उपयुक्त प्रतिकृति33,34,35 के बाद नॉनलाइनियर प्रतिगमन द्वारा इंटरपोलेट मानक वक्र। चित्रा 4 बी आईसी50 को दर्शाता है, जिसकी गणना चित्रा 4 ए में दिखाए गए व्यवहार्यता प्रतिशत से की जाती है। आईसी50 को एबी परख में नाममात्र सांद्रता का उपयोग करके कम से कम तीन तकनीकी प्रतिकृति और तीन प्रयोगात्मक प्रतिकृति के साथ प्राप्त किया गया था। विश्लेषण परीक्षण पदार्थों की पांच अलग-अलग सांद्रता के साथ किया गया था; हालांकि, प्रयोग के प्रकार के आधार पर अधिक सांद्रता की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, रेंज-फाइंडिंग टेस्ट के लिए आठ परीक्षण सांद्रता की सिफारिश की जाती है, जो आमतौर पर एक प्रयोग के लिए रासायनिक पदार्थ की अंतिम परीक्षण सांद्रता निर्धारित करने के लिए की जाती है। चूंकि व्यवहार्यता परख में अलग-अलग साइटोटॉक्सिसिटी समापन बिंदु होते हैं, इसलिए हम रासायनिक पदार्थों की कार्रवाई के विभिन्न तंत्रों या सेल लाइनों के बीच संवेदनशीलता में अंतर के कारण संवेदनशीलता में अंतर की पहचान करने के लिए अलग-अलग किए गए प्रत्येक परख के लिए आईसी50 की गणना करने की सलाह देते हैं। विभिन्न सेल लाइनों में परीक्षण किए गए रसायनों के आईसी50 मूल्यों में अंतर भी उपयोग किए जाने वाले संस्कृति माध्यम के प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकता है, क्योंकि प्रोटीन और लिपिड से संबंधित संरचना में अंतर रासायनिक जैव उपलब्धता को प्रभावित कर सकताहै। इसके अलावा, इन परखों के माध्यम से कई रसायनों की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन किया जा सकता है। जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों में मूल्यांकन किए गए अन्य रसायनों के आईसी50 को चित्रा 4 बी-एच में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: एबी, सीएफडीए-एएम और एनआर परख के योजनाबद्ध प्रोटोकॉल एक ही 96-वेल प्लेट में किए गए। संक्षिप्तरूप: एबी = अलामार ब्लू; सीएफडीए-एएम = 5-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन डायसेटेट एसिटॉक्सीमिथाइल एस्टर; एनआर = तटस्थ लाल; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एमटीटी परख का योजनाबद्ध प्रोटोकॉल 96-वेल प्लेट में किया गया। संक्षिप्त नाम: एमटीटी = 3-[4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2िल]-2,5-डिफेनिलल्टेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एबी, सीएफडीए-एएम, एनआर और एमटीटी परख के प्रतिनिधि परिणाम। चित्र (ए) एबी और सीएफडीए-एएम, (बी) एनआर, और (सी) एमटीटी परख में नियंत्रण और परीक्षण सांद्रता के लिए कुओं में रंग अंतर दिखाते हैं। संक्षिप्तरूप: एबी = अलामार ब्लू; सीएफडीए-एएम = 5-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन डायसेटेट एसिटॉक्सीमिथाइल एस्टर; एनआर = तटस्थ लाल; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा; बी = खाली कुएं (सेल मुक्त कुएं); एससी = विलायक नियंत्रण (0.5% डीएमएसओ); एनसी = नकारात्मक नियंत्रण (संस्कृति माध्यम में कोशिकाएं); पीसी = सकारात्मक नियंत्रण (1% ट्राइटन एक्स -100)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न परीक्षण रसायनों के लिए सेल व्यवहार्यता और व्यवहार्यता डेटा की गणना। रीडआउट डेटा का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की गणना को एनसी या एससी (ए) से संबंधित सेल व्यवहार्यता के प्रतिशत (%) के रूप में व्यक्त किया जा सकता है। विभिन्न परीक्षण रसायनों (बी-एच) के लिए नॉनलाइनर प्रतिगमन द्वारा एक मानक वक्र को इंटरपोलेट करने के लिए व्यवहार्यता डेटा का उपयोग करके एक रसायन की साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन किया जा सकता है। डेटा को तीन तकनीकी प्रतिकृतियों और तीन प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों (एबी परख) के सेल व्यवहार्यता (डॉट्स) और मानक विचलन (सलाखों) के औसत के रूप में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: 24 घंटे के लिए एफबीएस की उपस्थिति (10%) और अनुपस्थिति (0%),, पूरी तरह से एफबीएस-वंचित) में संवर्धित जेडएफएल और जेडईएम 2 एस कोशिकाओं में किए गए एमटीटी परख। (ए) 0% और 10% एफबीएस पर जेडएफएल कोशिकाएं क्रुस्कल-वालिस परीक्षण (पी = 0.2286) द्वारा सेल व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाती हैं। (बी) 0% और 10% एफबीएस पर जेडईएम 2 एस कोशिकाएं मैन-व्हिटनी परीक्षण (पी = 0.3429) द्वारा सेल व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाती हैं। पी < 0.05 के महत्व स्तर पर विचार किया गया था। डेटा को तीन तकनीकी प्रतिकृतियों की औसत और इंटरक्वार्टाइल रेंज के रूप में व्यक्त किया जाता है। संक्षेप: एनएस = कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम; एमटीटी = 3-[4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2इल]-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: जेडएफएल और जेडईएम 2 एस कोशिकाओं में किए गए एमटीटी और एनआर परीक्षण (24 घंटे) को डीएमएसओ के साथ अलग-अलग सांद्रता (0.1%, 0.5%, और 1%) और नकारात्मक नियंत्रण पर इलाज किया गया। किसी भी परीक्षण एकाग्रता पर डीएमएसओ-उपचारित जेडएफएल कोशिकाओं ने (ए) एमटीटी परख (पी = 0.074) और (बी) एनआर परख (पी = 0.216) द्वारा एनसी से संबंधित सेल व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। डीएमएसओ-उपचारित जेडईएम 2 एस कोशिकाओं ने (सी) एमटीटी परख (पी = 0.422) और (डी) एनआर परख (पी = 0.287) द्वारा एनसी से संबंधित सेल व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। क्रुस्कल-वालिस परीक्षण में पी < 0.05 के महत्व स्तर पर विचार किया गया था। डेटा को तीन तकनीकी प्रतिकृतियों की औसत और इंटरक्वार्टाइल रेंज के रूप में व्यक्त किया जाता है। संक्षेप: एनएस = कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं; एनसी = नकारात्मक नियंत्रण; एमटीटी = 3-[4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2इल]-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड; NR = तटस्थ लाल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधान और मीडिया। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

साइटोटॉक्सिसिटी परख का व्यापक रूप से इन विट्रो विषाक्तता मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जाता है, और यह प्रोटोकॉल लेख जेब्राफिश सेल लाइनों (यानी, 96-वेल प्लेट के लिए सेल घनत्व, एमटीटी परख में इनक्यूबेशन समय, रासायनिक जोखिम की स्थिति के दौरान एफबीएस की कमी, और एससी के लिए अधिकतम स्वीकार्य एकाग्रता) में प्रदर्शन करने के लिए संशोधित चार सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले साइटोटॉक्सिसिटी परख प्रस्तुत करता है। चूंकि ये परख विभिन्न सेल व्यवहार्यता समापन बिंदुओं (चयापचय कार्य, लाइसोसोमल झिल्ली अखंडता और कोशिका झिल्ली अखंडता) द्वारा साइटोटॉक्सिसिटी की मात्रा निर्धारित करते हैं, इसका संयोजन जेब्राफिश सेल लाइनों में रासायनिक साइटोटॉक्सिसिटी का सटीक मूल्यांकन प्रदान करता है। यहप्रोटोकॉल सीओ 2-मुक्त स्थिति में जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों की संस्कृति की भी सिफारिश करता है, उनकी संस्कृति मीडिया संरचना के कारण जो संस्कृति प्रणाली को पर्याप्त रूप से बफर कर सकता है, पीएच को 7.4 (शारीरिक पीएच) पर बनाए रख सकता है। दोनों सेल लाइनों के लिए इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित संस्कृति मीडिया संरचना और सीओ2-मुक्त वातावरण साहित्य में व्यापक रूप से रिपोर्ट किए गए हैं। जेडएफएल सेल लाइन आमतौर पर एल -15 और आरपीएमआई मीडिया में सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ या बिना और सीओ237,38,39,40,41,42,43 के बिना सुसंस्कृत होती है। इस बीच, ZEM2S सेल लाइन को बायोरिसोर्स सेंटर के निर्देशों के अनुसार सुसंस्कृत किया जाता है, और इसकी संस्कृति मीडियाCO2-मुक्त संस्कृतियों के लिए तैयार की जाती है; इस प्रकार, सीओ2 और वायु मिश्रण इस प्रकार के संस्कृति मीडिया44 का उपयोग करते समय कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकते हैं।

एफबीएस को जोड़े बिना एक संस्कृति माध्यम में रासायनिक जोखिम प्रकाशित अध्ययनों के आधार पर किया गया था, जिसमें दिखाया गया था कि इन विट्रो परख में रासायनिक पदार्थों की जैव उपलब्धता सीरम प्रोटीन के साथ उनके बंधन से काफी प्रभावित होती है। उदाहरण के लिए, चेन एट अल .45 ने दिखाया कि आरटीगिल-डब्ल्यू 1 परख में सीरम प्रोटीन की उपस्थिति एक धनिक सर्फेक्टेंट (सी 12-बेंजाल्कोनियम) की जैव उपलब्धता को साढ़े तीन गुना तक कम कर सकती है। एफबीएस से बंधे रसायन आम तौर पर संस्कृति माध्यम45 में 47% से 90% तक थे। इस प्रकार, इस मुद्दे से बचने के लिए, हमने एमटीटी परख का उपयोग करके 24 घंटे के लिए एफबीएस से पूरी तरह से वंचित संस्कृतियों में जेडएफएल और जेडईएम 2 एस कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया। परिणामों ने जेडएफएल या जेडईएम 2 एस संस्कृतियों से (10%) और (0%) एफबीएस के बिना सेल व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया, यह दर्शाता है कि ये ज़ेब्राफिश सेल लाइनें एफबीएस से वंचित संस्कृति मीडिया में रासायनिक उपचार के अधीन हो सकती हैं (चित्रा 5)। यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि एफबीएस की मात्रा कम करने से रासायनिक जैव उपलब्धता में अन्य परिणाम हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, लिपोफिलिक रसायनों में प्लास्टिक लैबवेयर और प्लेटों में अधिक अवशोषण होता है, जिससे रासायनिक जैव उपलब्धता कम होजाती है। हालांकि, कल्चर माध्यम में एफबीएस की उपस्थिति रसायनों को बांधने के लिए प्लास्टिक के साथ प्रतिस्पर्धा करने वाले सीरम घटकों के कारण प्लास्टिक बाइंडिंग को कम कर सकतीहै। एफबीएस पूरकता के प्रतिशत या इसके पूर्ण अभाव से संबंधित सबसे अच्छा निर्णय परीक्षण रसायन के प्रकार पर निर्भर हो सकता है। उदाहरण के लिए, पोम्पोनियो एट अल .46 ने बताया कि हालांकि एफबीएस की अनुपस्थिति में रासायनिक एमियोडेरोन में प्लास्टिक के लिए उच्च बंधन होता है, लेकिन 10% एफबीएस का उपयोग करते समय इसकी जैव उपलब्धता और भी कम होती है। मोनो-एन-डेसेथिलामियोडेरोन के लिए, लगभग समान मात्रा सीरम माध्यम और दीवारों46 से बंधी होती है।

कार्बनिक सॉल्वैंट्स (जैसे, डीएमएसओ) को आम तौर पर इन विट्रो परख में 0.5% तक उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, यह कम सांद्रता खराब पानी में घुलनशील रसायनों की उच्च सांद्रता के परीक्षण को बाधित कर सकती है। इस मुद्दे को रोकने के लिए, हमने मूल्यांकन किया कि क्या डीएमएसओ की उच्च सांद्रता जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों के लिए उपयुक्त थी, जो 10% की साइटोटॉक्सिसिटी सीमा से अधिक नहीं थी। इसके लिए, गैर-उपचारित कोशिकाओं (एनसी) और डीएमएसओ (0.1%, 0.5%, और 1%) की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज की गई कोशिकाओं (24 घंटे) को एमटीटी और एनआर परख के लिए संसाधित किया गया था। परिणामों ने एनसी (चित्रा 6) की तुलना में उपचार समूह से सेल व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया, यह दर्शाता है कि, इन विशेष परिस्थितियों में, डीएमएसओ की सांद्रता का उपयोग 1% तक किया जा सकता है। अन्य मछली सेल लाइनें भी 0.5% से अधिक डीएमएसओ सांद्रता का समर्थन करती हैं, जो जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों की विशिष्टता नहीं है। उदाहरण के लिए, 2% तक डीएमएसओ (बिना साइटोटोक्सिक प्रभाव के) की अधिकतम विलायक सांद्रता को सीएचएसई -214 (ऑन्कोरिनचस त्शॉइत्शा भ्रूण से प्राप्त सेल लाइन) 47, आरटीजी -2 (ऑन्कोरिनचस माइकिस गोनाडल सेल लाइन) 48,49,50, और पीएलएचसी -1 (पोसिलियोप्सिस ल्यूसिडा हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइन) 48 का उपयोग करके साइटोटॉक्सिसिटी परख में लागू किया गया है। कोशिकाएँ। 1% डीएमएसओ की अधिकतम विलायक सांद्रता का उपयोग आरटीएल-डब्ल्यू 1 (ऑन्कोरिनचस माइकिस गोनाडल सेल लाइन) 51 और सीसीओ (आईसीटीलुरस पंक्टस अंडाशय सेल लाइन) 52 कोशिकाओं का उपयोग करके साइटोटॉक्सिसिटी परख में भी किया गया है। मोरी और वाकाबायाशी47 के अनुसार, मछली सेल लाइनों में स्तनधारी सेल लाइनों की तुलना में डीएमएसओ के प्रति कम संवेदनशीलता हो सकती है। हालांकि, यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि 1% डीएमएसओ की अधिकतम स्वीकार्य एकाग्रता को विशेष रूप से साइटोटॉक्सिसिटी के लिए परिभाषित किया गया था, और इसे जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों में अन्य समापन बिंदुओं (जैसे, जीनोटॉक्सिसिटी, एपिजेनेटिक्स, प्रोटीन-कोडिंग जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण) के लिए सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

एमटीटी और एबी परख सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए चयापचय गतिविधि पर आधारित हैं। यद्यपि एमटीटी परख सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली व्यवहार्यता परख है, एबी परख की तुलना में यह थोड़ा कम संवेदनशील हो सकता है, कुछ मामलों में सेल व्यवहार्यता को अधिक महत्व देताहै। एबी परख की उच्च संवेदनशीलता माप विधि से संबंधित हो सकती है, क्योंकि प्रतिदीप्ति माप वर्णमिति माप15 की तुलना में अधिक संवेदनशील है। बहरहाल, एबी और एमटीटी परख दोनों साइटोटोक्सिक रासायनिक पदार्थों की पहचान करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले परख हैं, और उनके उत्पन्न डेटा का उपयोग खतरनाक रासायनिक पदार्थों को उनके आंतरिक साइटोटोक्सिक क्षमता53 के अनुसार वर्गीकृत करने के लिए किया गया है।

एक ही प्लेट में एबी, सीएफडीए-एएम और एनआर परख करने का विचार ओईसीडी टीजी 249 (आरटीगिल-डब्ल्यू 1 परख) 17 पर आधारित था; हालांकि, 96-वेल प्लेटों में इन परखों को करने के लिए संशोधन किए गए थे, साथ ही साथ ज़ेब्राफिश सेल लाइनों के लिए उपयुक्त होने के लिए भी। 24-वेल प्लेटों के बजाय 96-वेल प्लेटों में परख, मछली सेल लाइनों में उच्च-थ्रूपुट साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण के लिए फायदेमंद हो सकती है। इसके अलावा, RTgill-W1 परख केवल L-15 संस्कृति माध्यम का उपयोग करती है, जबकि ZFL और ZEM2S सेल लाइनों को डी-ग्लूकोज युक्त माध्यम में संवर्धित किया जाता है। संस्कृति माध्यम इन सेल लाइनों में एमटीटी परख करना संभव बनाता है, क्योंकि ग्लूकोज-मुक्त माध्यम (जैसे, केवल एल -15) में संवर्धित सेल लाइनें कोशिकाओं में एमटीटी कमी को तुरंत कम कर सकती हैं और इस परख54 के प्रदर्शन को खराब कर सकती हैं। यह प्रोटोकॉल दो ज़ेब्राफिश सेल लाइनों में चार अलग-अलग व्यवहार्यता परखों को आसानी से करने की अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके मछली पर रासायनिक पदार्थों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है । रासायनिक प्रभावों का अनुमान लगाने के लिए विभिन्न सेल लाइनों में अलग-अलग संवेदनशीलता हो सकती है, भले ही वे कशेरुक के एक ही समूह से हों, जैसे कि मछली। उदाहरण के लिए, मछली भ्रूण के साथ जेडएफएल और जेडएफ 4 सेल लाइनों की तुलना करते हुए, लैंगू-मिटिया एट अल .21 ने प्रदर्शित किया कि जेडएफएल मछली भ्रूण विषाक्तता परीक्षण की तुलना में समान परिणाम उत्पन्न करने में सक्षम है। टैनबर्गर एट अल.5 ने दिखाया कि स्थायी मछली सेल लाइनों जीएसएफ, पीएलएचसी, आरटीजी -2, आरटीगिल-डब्ल्यू 1, और आर 1 में विवो (वयस्क मछली) की तुलना में रासायनिक मछली विषाक्तता की भविष्यवाणी करने में अलग-अलग संवेदनशीलता है। यद्यपि RTgill-W1 (स्थायी मछली गिल सेल लाइन) को हाल ही में मछली तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में मान्य किया गया था, इकोटॉक्सिसिटी अध्ययन में अन्य सेल लाइनों की प्रयोज्यता की जांच की जानी चाहिए। विभिन्न मछली प्रजातियों और ऊतक उत्पत्ति के साथ-साथ विकास चरणों (जेडईएम 2 एस: भ्रूण) से सेल लाइनों का उपयोग करना; जेडएफएल: वयस्क यकृत) इकोटॉक्सिसिटी अध्ययन में महत्वपूर्ण योगदान दे सकता है, क्योंकि यह मछली के विकास और लक्षित अंगों के विशिष्ट चरणों से संबंधित प्रभावों को संबोधित कर सकता है। इस प्रकार, मछली (जैसे, यकृत, गोनैड्स, गिल, मस्तिष्क) में विभिन्न लक्ष्य साइटों को प्रतिबिंबित करने वाली विभिन्न सेल संस्कृतियों का उपयोग करके रासायनिक प्रभावों की जांच की जानी चाहिए, और न केवल एक सेल लाइन55 में।

इन प्रोटोकॉल के इकोटॉक्सिसिटी अध्ययन में अलग-अलग अनुप्रयोग हो सकते हैं, और उनका उपयोग आवश्यक रूप से मछली तीव्र विषाक्तता की भविष्यवाणी करने तक सीमित नहीं है। उदाहरण के लिए, उन्हें अन्य इन विट्रो मछली विषाक्तता परीक्षण करने के लिए उप-साइटोटोक्सिक सांद्रता को परिभाषित करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि मछली पर अंतःस्रावी-विघटनकारी प्रभावों का मूल्यांकन करना। इसके अलावा, इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी डेटा शारीरिक रूप से आधारित टॉक्सिकोकाइनेटिक (पीबीटीके) मॉडलिंग को विकसित करने और सुधारने में भी मदद कर सकता है। चूंकि पीबीटीके विभिन्न अंगों (जैसे गिल, यकृत, या आंत) पर विचार करते हुए एक जीव में एक रसायन के वितरण पर केंद्रित है, विभिन्न मछली प्रजातियों और ऊतक उत्पत्ति से सेल लाइनों का उपयोग करना इस मॉडल के लिए जानकारी का एक उपयोगी स्रोत हो सकता है। इन विट्रो बायोएसे (जैसे, साइटोटॉक्सिसिटी परख) के परिणाम पीबीटीके मॉडल में जैविक प्रक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले इनपुट डेटा प्रदान करते हैं और विवो एक्सप्लवेशन 21,56 में इन विट्रो में योगदान करते हैं।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

मार्सियो लोरेनसिनी की याद में, इस काम के सह-लेखक, सौंदर्य प्रसाधन के क्षेत्र में एक उत्कृष्ट शोधकर्ता और ब्राजील में कॉस्मेटिक अनुसंधान को बढ़ावा देने के लिए समर्पित। लेखक उपकरणों की उपलब्धता के लिए फिजियोलॉजी विभाग (यूएफपीआर) में बहु-उपयोगकर्ता प्रयोगशाला के लिए और उच्च शिक्षा कर्मियों के सुधार के लिए समन्वय (सीएपीएस, ब्राजील) (वित्त कोड 001) और ग्रुपो बोटिकारियो के वित्तीय समर्थन के लिए आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256

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References

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