Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Cytotoksisitetsanalyser med sebrafiskcellelinjer

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64860
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 3
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Denne protokollen presenterer ofte brukte cytotoksisitetsanalyser (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red og MTT assays) tilpasset for vurdering av cytotoksisitet i sebrafiskembryo (ZEM2S) og lever (ZFL) cellelinjer i 96-brønnplater.

Abstract

Fiskecellelinjer har blitt stadig mer brukt i økotoksisitetsstudier, og cytotoksisitetsanalyser har blitt foreslått som metoder for å forutsi akutt toksisitet hos fisk. Dermed presenterer denne protokollen cytotoksisitetsanalyser modifisert for å evaluere cellelevedyktighet i sebrafisk (Danio rerio) embryo (ZEM2S) og lever (ZFL) cellelinjer i 96-brønnsplater. De evaluerte cytotoksisitetsendepunktene er mitokondriell integritet (Alamar Blue [AB] og MTT-analyser), membranintegritet via esteraseaktivitet (CFDA-AM-analyse) og lysosomal membranintegritet (Neutral Red [NR] assay). Etter eksponering av teststoffene i en 96-brønnplate utføres cytotoksisitetsanalysene; Her utføres AB og CFDA-AM samtidig, etterfulgt av NR på samme plate, mens MTT-analysen utføres på en egen plate. Avlesningene for disse analysene tas ved fluorescens for AB og CFDA-AM, og absorbans for MTT og NR. Cytotoksisitetsanalysene utført med disse fiskecellelinjene kan brukes til å studere akutt giftighet av kjemiske stoffer på fisk.

Introduction

Kjemiske stoffer må testes med hensyn til sikkerhet for menneskers helse og miljøet. Molekylære og cellulære biomarkører har i økende grad blitt vurdert i sikkerhetsvurderinger for å forutsi effekter på levende organismer av reguleringsorganer og/eller lovgivning (f.eks. REACH, OECD, US EPA)1,2, siden de kan komme før in vivo bivirkningsutfall (f.eks. hormonforstyrrelser, immunologisk respons, akutt toksisitet, fototoksisitet)3,4,5,6,7 . I denne sammenheng er cytotoksisitet tatt som en måling for å forutsi fisk akutt toksisitet 5,8; Det kan imidlertid ha mange andre anvendelser i økotoksisitetsstudier, for eksempel å definere subcytotoksiske konsentrasjoner av kjemiske stoffer for å studere deres mest varierte sett med effekter på fisk (f.eks. Hormonforstyrrende effekter).

I cellekultursystemer (in vitro-systemer ) kan cytotoksisiteten til kjemiske stoffer bestemmes ved metoder som varierer i typer endepunkter. For eksempel kan en cytotoksisitetsmetode være basert på et endepunkt relatert til spesifikk morfologi observert under celledødsprosessen, mens en annen kan bestemme cytotoksisitet ved måling av celledød, levedyktighet og funksjonalitet, morfologi, energimetabolisme og cellevedlegg og proliferasjon. Kjemiske stoffer kan påvirke cellenes levedyktighet gjennom forskjellige mekanismer, og cytotoksisitetsvurdering som dekker forskjellige cellelevedyktighetsendepunkter er derfor nødvendig for å forutsi kjemiske effekter9.

MTT og Alamar Blue (AB) er analyser som bestemmer effekter på cellenes levedyktighet basert på cellemetabolsk aktivitet. MTT-analysen evaluerer aktiviteten til mitokondrieenzymet succinat dehydrogenase10. Reduksjonen av gulaktig 3-[4,5-dimetyltiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) til formazanblå forekommer bare i levedyktige celler, og dens optiske tetthet er direkte proporsjonal med antall levedyktige celler10. AB-analysen er en sensitiv oksidasjonsreduksjonsindikator, mediert av mitokondrielle enzymer som fluorescerer og endrer farge ved reduksjon av resazurin til resorufin av levende celler11; Imidlertid bidrar cytosoliske og mikrosomale enzymer også til reduksjon av AB og MTT12. Disse enzymene kan omfatte flere reduktaser, slik som alkohol og aldehydoksidoreduktaser, NAD (P) H: kinon oksidoreduktase, flavin reduktase, NADH dehydrogenase og cytokromer11.

Den nøytrale røde (NR) analysen er en celle levedyktighetsanalyse basert på inkorporering av dette fargestoffet i lysosomene til levedyktige celler13. Opptaket av NR avhenger av cellens kapasitet til å opprettholde pH-gradienter. Protongradienten inne i lysosomene opprettholder en pH lavere enn cytoplasma. Ved normal fysiologisk pH presenterer NR en nettoladning på omtrent null, noe som gjør det mulig å trenge inn i cellemembraner. Dermed blir fargestoffet ladet og beholdes inne i lysosomene. Følgelig, jo større mengde beholdt NR, jo større antall levedyktige celler14. Kjemiske stoffer som skader celleoverflaten eller lysosomale membraner, svekker opptaket av dette fargestoffet.

CFDA-AM-analysen er en fluorometrisk cellelevedyktighetsanalyse basert på retensjon av 5-karboksyfluoresceindiacetatacetoksymetylester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, et esterasesubstrat, omdannes til karboksyfluorescein, et fluorescerende stoff som er polært og ikke-permeabelt av membraner av levende celler15; Dermed beholdes den på innsiden av en intakt cellemembran, noe som indikerer levedyktige celler.

Nylig ble tre cytotoksisitetsanalyser (CFDA-AM-, NR- og AB-analyser) kombinert i en validert ISO (International Organization for Standardization) retningslinje (ISO 21115: 2019) 16 og OECD (Organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling) testmetode (OECD TG 249) for å evaluere fisk akutt toksisitet ved bruk av RTgill-W1 cellelinje (permanent cellelinje fra regnbueørret [Oncorhynchus mykiss] gill) i 24-brønns plater17 . Selv om det finnes en eksisterende cellebasert metode for å forutsi akutt giftighet hos fisk, er det lagt ned arbeid i å utvikle lignende metoder med andre fiskearter og øke gjennomstrømningen av metoden. Noen eksempler inkluderer utvikling av ZFL-cellelinjer transfeksjonert med reportergener for spesifikke toksisitetsveier18,19, fototoksisitetstester i RTgill-W1-cellelinjen 20, og bruk av ZFL- og ZF4-cellelinjer (sebrafiskfibroblastisk avledet fra 1 dag gamle embryoer) for å vurdere toksisitet ved flere cytotoksisitetsanalyser21.

Danio rerio (sebrafisk) er en av de viktigste fiskeartene som brukes i akvatiske toksisitetsstudier; Dermed kan cellebaserte metoder med sebrafiskcellelinjer for fisketoksisitetstesting være ekstremt nyttige. ZFL-cellelinjen er en sebrafiskepitelial hepatocyttcellelinje som presenterer de viktigste egenskapene til leverparenkymale celler og kan metabolisere xenobiotika 7,22,23,24,25. I mellomtiden er ZEM2S-cellelinjen en embryonal sebrafisk fibroblastisk cellelinje avledet fra blastulastadiet som kan brukes til å undersøke utviklingseffekter på fisk26,27. Dermed beskriver denne protokollen fire cytotoksisitetsanalyser (MTT-, AB-, NR- og CFDA-AM-analyser), med modifikasjoner som skal utføres med ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i 96-brønnsplater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for listen over materialer som brukes i denne protokollen og tabell 1 for sammensetningen av løsninger og medier som brukes i denne protokollen.

1. Klargjøre ZFL- og ZEM2S-celler

  1. Start med en T75-kolbe av ZFL- eller ZEM2S-celler med 80 % samløp, dyrket i det respektive komplette medium ved 28 °C uten CO2.
  2. Fjern dyrkningsmediet fra kolben og vask cellene ved å tilsette 10 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) (0,01 M). Tilsett 3 ml 1x trypsin (0,05% v / v; 0,5 mM trypsin-EDTA) til kulturkolber. Inkuber ved 28 °C i 3 minutter.
  3. Trykk forsiktig på kolben for å frigjøre cellene, og stopp deretter trypsinfordøyelsen ved å tilsette 3 ml komplett kulturmedium til kolben.
  4. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk sentrifugerør og sentrifuge ved 100 × g i 5 minutter.
  5. Etter sentrifugering fjernes supernatanten forsiktig, tilsett 1 ml komplett medium for ZFL- eller ZEM2S-celler, og resuspender pelleten ved hjelp av en mikropipette.

2. Celletelling ved trypan blå fargestoff ekskludering

  1. Tilsett 10 μL av cellesuspensjonen og 10 μL trypanblått fargestoff til et mikrorør for å telle cellene og evaluere deres levedyktighet. Bland cellesuspensjonen og fargestoffet ved hjelp av en pipette.
  2. Deretter overfører du 10 μL av denne blandingen (cellesuspensjon + trypanblå) til et Neubauer-kammer og teller cellene i de fire store firkantene (kvadranter Q) plassert i hjørnene av kammeret, og vurderer levedyktige celler som de som ikke tar opp trypanblått. Bestem antall levedyktige celler ved hjelp av ligning (1):
    Equation 1 (1)
  3. Beregn det endelige cellenummeret i cellesuspensjonen ved å multiplisere cellenummeret bestemt ved hjelp av ligning (1) med to (fortynningsfaktoren på grunn av bruk av trypanblått).
    MERK: Alternativt kan et automatisert celletellingssystem (f.eks. En cytomer med celletelling og levedyktighetsfunksjon) brukes.

3. Celleplettering i 96-brønnsplater

  1. Beregn cellesuspensjonsvolumet som er nødvendig for å oppnå antall celler som kreves for å utføre cytotoksisitetsanalysene. Antall levedyktige celler for hver cellelinje er angitt nedenfor:
    1. Plate 60.000 levedyktige ZEM2S-celler per brønn; For hele platen bruker du derfor seks millioner celler i 20 ml komplett medium (200 μL / brønn, 96-brønnplate).
    2. Plate 40.000 levedyktige ZFL-celler per brønn; For hele platen bruker du derfor fire millioner celler i 20 ml komplett medium (200 μL / brønn, 96-brønnplate).
  2. Deretter overføres det respektive volumet av cellesuspensjonen til et reagensreservoar (sterilt) og fylles opp med det komplette kulturmediet for ZFL eller ZEM2S til 20 ml. Bruk en flerkanalspitte til å blande løsningen forsiktig opp og ned.
    MERK: Pass på at det ikke dannes skum eller bobler.
  3. Tilsett 200 μL av cellesuspensjonen til hver brønn av en gjennomsiktig polystyren 96-brønnplate ved hjelp av flerkanals mikropipetten. Inkuber platene ved 28 °C i 24 timer.
    MERK: Platen må ha minst tre brønner uten celler for den tomme kontrollen, og bare komplette medier skal legges til disse brønnene. Kanteffekten (forårsaket av høyere fordampning i kantbrønnene) forekommer ofte i 96-brønns plateanalyser og kan påvirke levedyktigheten til cellene i kantbrønnene på platen28. Denne effekten kan være høyere eller lavere avhengig av 96-brønns platemerke og design28. Selv om vi ikke la merke til noen cellevekst/levedyktighetsforstyrrelse for ZFL og ZEM2S i kantbrønnene, foreslår vi å forsegle platen med parafilm eller selvklebende tetningsfolie for å forhindre denne effekten, eller dyrke cellene bare i de 60 innvendige brønnene og fylle kantbrønnene med PBS.

4. Eksponering av celler for å teste kjemikalier

  1. Kast forsiktig det brukte mediet fra brønnene ved hjelp av en flerkanals mikropipette.
  2. Utsett cellene for å teste kjemikalier i forskjellige konsentrasjoner. Forbered løsningene av testkjemiske konsentrasjoner i kulturmediet for ZFL eller ZEM2S uten føtalt bovint serum (FBS) (eksponeringsmedier). Deretter tilsettes 100 μL per brønn av disse løsningene i teknisk triplikat (dvs. tre brønner/test kjemisk konsentrasjon).
  3. For kontroller plasseres kontrollgruppene på samme plate som testkjemikaliet i tekniske triplikater (tre brønner/kontrollgruppe). For den tomme kontrollen (B), tilsett 100 μL av eksponeringsmediet i de cellefrie brønnene, for den negative kontrollen (NC), tilsett 100 μL av eksponeringsmediet til brønner med celler, og for den positive kontrollen (PC), utsett cellene for en løsning på 1% Triton X-100 fremstilt i eksponeringsmediet. I noen tilfeller bør en væskekontroll (SC) inkluderes i platen, med tanke på en klart ikke-cytotoksisk konsentrasjon som en endelig oppløsningsmiddelkonsentrasjon.
    MERK: Det anbefales å bruke 0,5% DMSO som løsningsmiddel; DMSO kan brukes opptil 1 % som løsningsmiddel i disse cellelinjene uten å overskride cytotoksisitetsterskelen på 10 % relatert til den negative kontrollen.
  4. Inkuber platene ved 28 °C i 24 timer. Forsegl platene med parafilm eller selvklebende tetningsfolie for å forhindre fordampning av kulturmedium.
    MERK: Visse kjemikalier kan ha egen bakgrunnsabsorbans eller fluorescens som kan forstyrre absorbansen eller fluorescensen til indikatorfargestoffet(e) (f.eks. forbindelser med farge kan påvirke absorbans, serumalbumin29 og forbindelser som forstyrrer reduksjonsenzymer30,31). I dette tilfellet må platen inkludere en ekstra kontroll ved å legge til kjemiske testløsninger i brønnene uten celler. Dette er for å verifisere mulig interferens av kjemisk autoabsorbans / autofluorescens med fargestoffene. Hvis interferens oppdages, bør man vurdere om det kan utelukkes for å få en korrekt prediksjon av cytotoksisitet.

5. Cytotoksisitetsanalyser

MERK: Forbered alle løsninger i henhold til tabell 1. Alle trinnene beskrevet nedenfor (figur 1) utføres under sterile forhold. Bruk av pipette for å kassere eksponeringsmediet anbefales ikke, fordi cellene lett kan løsne fra brønnene etter kjemisk behandling.

  1. AB- og CFDA-AM-analyser
    1. Etter 24 timers kjemisk eksponering skal eksponeringsmediet kastes forsiktig ved å helle innholdet i en oppsamlingsbrett.
    2. Vask platen med 200 μL PBS. Fjern PBS forsiktig ved å helle den i et oppsamlingsbrett for å unngå å miste celler.
    3. Tilsett 100 μL per brønn med AB/CFDA-AM-løsning. Inkuber platen i 30 minutter i mørket ved 28 °C.
    4. Mål fluorescensen i en fluorescensplateleser ved 530 nm (eksitasjon) og 595 nm (utslipp) for AB, og ved 493 nm (eksitasjon) og 541 nm (utslipp) for CFDA-AM.
  2. NR-analyse
    MERK: Trinnene for NR-analysen utføres umiddelbart etter AB- og CFDA-AM-analysene (figur 1).
    1. Sentrifuger NR-arbeidsløsningen (40 μg/ml) ved 600 × g i 10 minutter.
      MERK: Utfelling av NR i slangen må ikke overføres til platene. Etter sentrifugering av NR-arbeidsløsningen samles supernatanten ved hjelp av en pipette uten å aspirere NR-utfellingene. Overfør supernatanten til et reagensreservoar.
    2. Fjern AB/CFDA-AM-oppløsningen forsiktig ved å helle innholdet i en oppsamlingsskuff.
    3. Tilsett 100 μL per brønn av NR-arbeidsløsningen ved hjelp av en flerkanals mikropipette. Inkuber platen ved 28 °C i 3 timer.
      MERK: Etter 3 timers inkubasjon, observer om NR-nedbør oppstod i platene ved hjelp av et mikroskop. NR-utfellinger kan forstyrre kvantifiseringen av cellens levedyktighet, og de bør derfor ikke være til stede.
    4. Fjern NR-oppløsningen forsiktig ved å helle innholdet i en innsamlingsskuff. Vask brønnene ved å tilsette 150 μL PBS per brønn.
    5. Tilsett 150 μL per brønn av NR-ekstraksjonsløsningen og inkuber platen på en platerister i 10 minutter for forsiktig risting. Mål absorbansen ved 540 nm i en plateleser.
      MERK: En andre avlesning ved 690 nm bør utføres for å utelukke eventuell fingeravtrykkabsorbans i bakgrunnen i platen.
  3. MTT-analyse
    MERK: MTT-analysen må utføres separat fra analysene beskrevet ovenfor (i en ny plate) (figur 2).
    1. Fjern eksponeringsmediet forsiktig ved å helle innholdet i en innsamlingsskuff.
    2. Tilsett 100 μL MTT-arbeidsløsning per brønn ved hjelp av en flerkanals mikropipette. Inkuber platen ved 28 °C i 4 timer.
    3. Kast MTT-oppløsningen ved å helle innholdet i en innsamlingsskuff.
    4. Tilsett 100 μL per brønn DMSO for å trekke ut formazankrystallene, inkubere platen på en platerister i 10 minutter. Mål absorbansen ved 570 nm ved hjelp av en plateleser.
      MERK: En andre avlesning ved 690 nm bør utføres for å utelukke eventuell fingeravtrykkabsorbans i bakgrunnen i platen. Det er viktig å merke seg at testkjemikalier kan forstyrre MTT, som må evalueres for å sikre kvaliteten på de genererte dataene32. For dette bør cellefrie brønner som inneholder testkonsentrasjoner og MTT (0,5 mg/ml) eksponeres, etterfulgt av inkubasjon for å observere eventuelle fargeendringer i brønnene som kan øke absorbansen og føre til falske levedyktighetsresultater. Kjemikalier som samhandler med MTT må unngås i denne testen.

6. Beregning av cellenes levedyktighet/cytotoksisitet

MERK: Den ervervede råabsorbansen eller fluorescensen brukes til å beregne cellens levedyktighet som en prosentandel relatert til den negative kontrollen (for testkjemikalier fremstilt direkte i eksponeringsmedier) eller løsningsmiddelkontroll (for testkjemikalier fremstilt ved bruk av løsningsmidler, for eksempel DMSO). Før du bestemmer cellens levedyktighetsprosent, må rådataene normaliseres av den tomme kontrollen.

  1. Beregn gjennomsnittlig absorbans eller fluorescens for hver test kjemisk konsentrasjon og kontrollgruppe (tre brønner/behandling).
  2. For å bestemme cellens levedyktighetsprosent i forhold til kontroll (negativ eller løsningsmiddel), bruk ligning (2):
    Equation 2 (2)
    MERK: Absorbans (abs) eller fluorescens (fluo) enheter representerer gjennomsnittet av absorbans eller fluorescens målt i de tre brønnene per konsentrasjon; Blank representerer brønner uten celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 viser platene til AB-, CFDA-AM-, NR- og MTT-analysene. For AB-analysen (figur 3A) viser de blanke brønnene og brønnene med ingen eller et redusert antall levedyktige celler blå farge og lav fluorescens, mens brønnene med et høyt antall levedyktige celler er rosa og presenterer høye fluorescensverdier på grunn av transformasjonen av resazurin (AB) til resorufin (rosa substans) av levedyktige celler. For CFDA-AM-analysen er det ingen synlig forskjell i fargen på brønnene på platen; Imidlertid er fluorescensen høyere i brønner som inneholder levedyktige celler på grunn av retensjon av CFDA-AM og påfølgende omdannelse til karboksyfluorescein (fluorescerende substans).

For NR-analysen (figur 3B) må de blanke brønnene være gjennomsiktige med svært lave absorbansverdier, siden det ikke er celler til å beholde NR-fargestoffet. I noen tilfeller er de blanke brønnene ikke gjennomsiktige, noe som indikerer forekomsten av NR-nedbør på platen; I dette tilfellet bør dette ikke betraktes som et gyldig eksperiment. Svært cytotoksiske konsentrasjoner av testkjemikaliene og PC er gjennomsiktige eller presenterer en veldig lys rosa farge med lave absorbansverdier, mens brønner som inneholder levedyktige celler beholder NR-fargestoffet og presenterer en mørkrosa farge og høye absorbansverdier.

For MTT-analysen (figur 3C) må de blanke brønnene være gjennomsiktige og med svært lav absorbans, da det ikke er celler som konverterer MTT til formazan. Svært cytotoksiske konsentrasjoner av testkjemikaliene og PC er gjennomsiktige eller presenterer en veldig lys fiolett farge med lave absorbansverdier, mens brønner som inneholder levedyktige celler forvandler MTT (gul) til formazan (fiolett substans), og presenterer en mørkere fiolett farge med høye absorbansverdier.

Figur 4A viser en representativ grafikk av cellenes levedyktighet etter beregningen, ved bruk av gjennomsnittet av fluorescens- eller absorbansverdier per gruppe. Grafikken kan plottes med inngangen til levedyktighetsprosentverdier, beregnet av levedyktighetsberegningsformelen presentert i protokollseksjon 6, ved hjelp av dataanalyseprogramvare. Levedyktigheten til celler utsatt for SC bør ikke være 10% lavere enn i NC17. Cellens levedyktighetsprosent for testkjemikaliene beregnes relatert til NC eller SC, avhengig av deres løselighet. I dette tilfellet brukes forskjellige konsentrasjoner av DMSO som et teststoff, og cellens levedyktighet er relatert til NC, som er definert som 100% levedyktighet.

Cellens levedyktighetsdata kan brukes til å beregne testkjemikalienes halvmaksimale hemmende konsentrasjon (IC50) ved logaritmisk transformasjon, og interpolert standardkurve ved ikke-lineær regresjon etter passende replikasjoner33,34,35. Figur 4B viser IC50, beregnet ut fra levedyktighetsprosenten vist i figur 4A. IC50 ble oppnådd med minst tre tekniske replikater og tre eksperimentelle replikater ved bruk av nominelle konsentrasjoner i AB-analysen. Analysene ble utført med fem ulike konsentrasjoner av teststoffene; Imidlertid kan det være nødvendig med et høyere antall konsentrasjoner, avhengig av typen eksperiment. For eksempel anbefales åtte testkonsentrasjoner for rekkeviddeprøvetesten, som vanligvis utføres for å bestemme endelige testkonsentrasjoner av et kjemisk stoff for et eksperiment. Siden levedyktighetsanalysene har forskjellige cytotoksisitetsendepunkter, anbefaler vi å beregne IC50 for hver analyse utført separat for å identifisere forskjeller i følsomhet forårsaket av forskjellige virkningsmekanismer for de kjemiske stoffene eller forskjeller i følsomhet mellom cellelinjer. Forskjellene i IC50-verdier av testede kjemikalier i forskjellige cellelinjer kan også variere avhengig av hvilken type kulturmedium som brukes, siden forskjeller i sammensetning relatert til proteiner og lipider kan påvirke kjemisk biotilgjengelighet36. I tillegg kan cytotoksisiteten til mange kjemikalier evalueres gjennom disse analysene. IC50 av andre kjemikalier evaluert i ZFL- og ZEM2S-cellelinjer er vist i figur 4B-H.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk protokoll for AB-, CFDA-AM- og NR-analysene utført i samme 96-brønnsplate. Forkortelser: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-karboksyfluoresceindiacetatacetoksymetylester; NR = nøytral rød; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk protokoll for MTT-analysen utført i en 96-brønnsplate. Forkortelse: MTT = 3-[4,5-dimetyltiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative resultater av AB-, CFDA-AM-, NR- og MTT-analysene. Bildene viser fargeforskjellene i brønnene for kontroller og testkonsentrasjoner i (A) AB og CFDA-AM, (B) NR og (C) MTT-analyser. Forkortelser: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-karboksyfluoresceindiacetatacetoksymetylester; NR = nøytral rød; PBS = fosfatbufret saltvann; B = blanke brønner (cellefrie brønner); SC = løsemiddelkontroll (0,5% DMSO); NC = negativ kontroll (celler i kulturmedium); PC = positiv kontroll (1% Triton X-100). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Beregning av cellelevedyktighet og levedyktighetsdata for forskjellige testkjemikalier. Beregningen av celle levedyktighet ved hjelp av avlesningsdataene kan uttrykkes som prosentandelen (%) av celle levedyktighet relatert til NC eller SC (A). Cytotoksisiteten til et kjemikalie kan vurderes ved å bruke levedyktighetsdata til å interpolere en standardkurve ved ikke-lineær regresjon for forskjellige testkjemikalier (B-H). Data er representert som gjennomsnitt av cellelevedyktighet (prikker) og standardavvik (barer) av tre tekniske replikater og tre eksperimentelle replikater (AB-analyse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: MTT-analyse utført i ZFL- og ZEM2S-celler dyrket i nærvær (10%) og fravær (0%, helt FBS-berøvet) av FBS i 24 timer. (A) ZFL-celler ved 0% og 10% FBS viser ingen signifikant forskjell i cellelevedyktighet ved Kruskall-Wallis-test (p = 0,2286). (B) ZEM2S-celler ved 0 % og 10 % FBS viser ingen signifikant forskjell i cellelevedyktighet ved Mann-Whitney-test (p = 0,3429). Et signifikansnivå på p < 0,05 ble vurdert. Data uttrykkes som median og interkvartilbredde av tre tekniske replikater. Forkortelser: n.s. = ingen signifikant forskjell; FBS = føtalt bovint serum; MTT = 3-[4,5-dimetyltiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: MTT- og NR-analyser utført i ZFL- og ZEM2S-celler behandlet (24 timer) med DMSO i forskjellige konsentrasjoner (0,1 %, 0,5 % og 1 %) og negativ kontroll. DMSO-behandlede ZFL-celler ved enhver testet konsentrasjon viste ingen signifikant forskjell i cellelevedyktighet relatert til NC ved (A) MTT-analysen (p = 0,074) og (B) NR-analysen (p = 0,216). DMSO-behandlede ZEM2S-celler viste ingen signifikant forskjell i cellelevedyktighet relatert til NC ved (C) MTT-analysen (p = 0,422) og (D) NR-analysen (p = 0,287). Signifikansnivå p < 0,05 i Kruskall-Wallis-testen ble vurdert. Data uttrykkes som median og interkvartilbredde av tre tekniske replikater. Forkortelser: n.s. = ingen signifikant forskjell; NC = negativ kontroll; MTT = 3-[4,5-dimetyltiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid; NR = nøytral rød. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Løsninger og medier brukt i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cytotoksisitetsanalyser er mye brukt for in vitro toksisitetsevaluering, og denne protokollartikkelen presenterer fire vanlige cytotoksisitetsanalyser modifisert for å bli utført i sebrafiskcellelinjer (dvs. celletetthet for 96-brønnplate, inkubasjonstid i MTT-analysen, FBS-uttømming under kjemisk eksponeringstilstand og maksimal akseptabel konsentrasjon for SC). Da disse analysene kvantifiserer cytotoksisitet ved forskjellige cellelevedyktighetsendepunkter (metabolsk funksjon, lysosomal membranintegritet og cellemembranintegritet), gir kombinasjonen av dette en nøyaktig evaluering av kjemisk cytotoksisitet i sebrafiskcellelinjer. Denne protokollen anbefaler også kulturen av ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i en CO2-fri tilstand, på grunn av deres kulturmediesammensetning som tilstrekkelig kan bufre kultursystemet, opprettholde pH ved 7,4 (fysiologisk pH). Kulturmediesammensetningen og det CO2-frie miljøet foreslått i denne protokollen for begge cellelinjer er bredt rapportert i litteraturen. ZFL-cellelinjen dyrkes vanligvis i L-15- og RPMI-medier med eller uten tilsetning av natriumbikarbonat og uten CO2 37,38,39,40,41,42,43. I mellomtiden dyrkes ZEM2S-cellelinjen i henhold til instruksjonene fra bioressurssenteret, og dets kulturmedier er formulert for CO2-frie kulturer; Dermed kan CO2 og luftblanding være skadelig for celler ved bruk av denne typen kulturmedier44.

Den kjemiske eksponeringen i et kulturmedium uten å tilsette FBS ble utført basert på publiserte studier, som viste at de kjemiske stoffenes biotilgjengelighet i in vitro-analyser er signifikant påvirket av deres binding til serumproteiner. For eksempel viste Chen et al.45 at tilstedeværelsen av serumproteiner i RTgill-W1-analysen kunne redusere biotilgjengeligheten av et kationisk overflateaktivt middel (C12-benzalkonium) opptil tre og en halv gang. Kjemikaliet bundet til FBS varierte generelt fra 47% til 90% i kulturmediet45. For å unngå dette problemet evaluerte vi derfor cellelevedyktigheten til ZFL- og ZEM2S-celler i kulturer fullstendig fratatt FBS i 24 timer ved bruk av MTT-analysen. Resultatene viste ingen signifikant forskjell i cellelevedyktighet fra ZFL- eller ZEM2S-kulturer med (10%) og uten (0%) FBS, noe som indikerer at disse sebrafiskcellelinjene kan bli utsatt for kjemisk behandling i kulturmedier fratatt FBS (figur 5). Det er viktig å fremheve at å redusere mengden FBS kan forårsake andre konsekvenser i kjemisk biotilgjengelighet. For eksempel har lipofile kjemikalier høyere sorpsjon til plastlabware og plater, noe som reduserer kjemisk biotilgjengelighet36. Imidlertid kan tilstedeværelsen av FBS i kulturmedium redusere plastbindingen på grunn av serumbestanddeler som konkurrerer med plasten om binding til kjemikaliene46. Den beste avgjørelsen knyttet til prosentandelen av FBS-tilskudd eller fullstendig deprivasjon kan avhenge av typen testkjemikalie. For eksempel rapporterte Pomponio et al.46 at selv om den kjemiske amiodaronen har en høyere binding til plast i fravær av FBS, er biotilgjengeligheten enda lavere ved bruk av 10% FBS. For mono-N-desetylamiodaron er nesten samme mengde bundet til serummediet og til veggene46.

Organiske løsemidler (f.eks. DMSO) anbefales generelt å brukes opptil 0,5 % in vitro-analyser. Denne lave konsentrasjonen kan imidlertid svekke testingen av høyere konsentrasjoner av dårlige vannløselige kjemikalier. For å forhindre dette problemet evaluerte vi om høyere konsentrasjoner av DMSO var egnet for ZFL- og ZEM2S-cellelinjer som ikke oversteg cytotoksisitetsterskelen på 10 %. For dette ble ikke-behandlede celler (NC) og celler behandlet (24 timer) med forskjellige konsentrasjoner av DMSO (0,1%, 0,5% og 1%) behandlet for MTT- og NR-analysene. Resultatene viste ingen signifikant forskjell i cellelevedyktighet fra behandlingsgruppen sammenlignet med NCs (figur 6), noe som indikerer at under disse spesielle forholdene kan konsentrasjoner av DMSO opptil 1% brukes. Andre fiskecellelinjer støtter også DMSO-konsentrasjoner høyere enn 0,5%, noe som ikke er en særegenhet ved ZFL- og ZEM2S-cellelinjer. For eksempel har maksimale løsningsmiddelkonsentrasjoner på opptil 2 % DMSO (uten cytotoksisk effekt observert) blitt anvendt i cytotoksisitetsanalyser ved bruk av CHSE-214 (cellelinje avledet fra Oncorhynchus tshawytscha embryo)47, RTG-2 (Oncorhynchus mykiss gonadal cellelinje)48,49,50 og PLHC-1 (Poeciliopsis lucida hepatocellulært karsinomcellelinje)48 Celler. Maksimal løsningsmiddelkonsentrasjon på 1 % DMSO har også blitt brukt i cytotoksisitetsanalyser ved bruk av RTL-W1 (Oncorhynchus mykiss gonadal cell line)51 og CCO (Ictalurus punctatus ovariecellelinje)52 celler. Ifølge Mori og Wakabayashi47 kan fiskecellelinjer ha lavere følsomhet for DMSO enn pattedyrcellelinjer. Det er imidlertid viktig å fremheve at den maksimalt akseptable konsentrasjonen på 1 % DMSO utelukkende ble definert for cytotoksisitet, og dette bør evalueres nøye for andre endepunkter (f.eks. gentoksisitet, epigenetikk, proteinkodende genuttrykksanalyse) i ZFL- og ZEM2S-cellelinjer.

MTT- og AB-analysene er basert på metabolsk aktivitet for å bestemme cellens levedyktighet. Selv om MTT-analysen er den mest brukte levedyktighetsanalysen, kan den i forhold til AB-analysen være litt mindre følsom, og overvurdere cellenes levedyktighet i noen tilfeller53. Den høyere følsomheten til AB-analysen kan være relatert til målemetoden, da fluorescensmåling er mer følsom enn kolorimetrisk måling15. Ikke desto mindre er både AB- og MTT-analysene høykvalitetsanalyser for å identifisere cytotoksiske kjemiske stoffer, og deres genererte data har blitt brukt til å klassifisere farlige kjemiske stoffer i henhold til deres iboende cytotoksiske potensial53.

Ideen om å utføre AB-, CFDA-AM- og NR-analysen i samme plate var basert på OECD TG 249 (RTgill-W1-analysen)17; Imidlertid ble det gjort modifikasjoner for å utføre disse analysene i 96-brønnsplater, samt å være egnet for sebrafiskcellelinjer. Analyser i 96-brønnsplater, i stedet for 24-brønnsplater, kan være fordelaktige for cytotoksisitetstesting med høy gjennomstrømning i fiskecellelinjer. I tillegg bruker RTgill-W1-analysen bare L-15 kulturmedium, mens ZFL- og ZEM2S-cellelinjene dyrkes i et medium som inneholder D-glukose. Kulturmediet gjør det mulig å utføre MTT-analysen i disse cellelinjene, da cellelinjer dyrket i glukosefritt medium (f.eks. Bare L-15) umiddelbart kan redusere MTT-reduksjonen i celler og svekke ytelsen til denne analysen54. Denne protokollen gjør at fire forskjellige levedyktighetsanalyser enkelt kan utføres i to sebrafiskcellelinjer.

Denne protokollen kan brukes til å studere effekter av kjemiske stoffer på fisk ved bruk av in vitro-modeller . Ulike cellelinjer kan ha ulik følsomhet for å estimere kjemiske effekter, selv om de er fra samme gruppe virveldyr, som fisk. For eksempel, sammenligning av ZFL- og ZF4-cellelinjer med fiskeembryoer, viste Langu-Mitea et al.21 at ZFL er i stand til å generere lignende resultater sammenlignet med fiskeembryotoksisitetstesten. Tanneberger et al.5 viste at de permanente fiskecellelinjene GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 og R1 har forskjellig sensitivitet for å forutsi kjemisk fisketoksisitet sammenlignet med in vivo (voksen fisk). Selv om RTgill-W1 (permanent fiskegjellecellelinje) nylig ble validert som en alternativ metode for å forutsi akutt toksisitet hos fisk, bør anvendbarheten av andre cellelinjer i økotoksisitetsstudier undersøkes. Bruk av cellelinjer fra forskjellige fiskearter og vevs opprinnelse samt utviklingsstadier (ZEM2S: embryo; ZFL: voksenlever) kan i betydelig grad bidra til økotoksisitetsstudier, siden den kan adressere effekter relatert til spesifikke stadier av fiskens utvikling og målorganer. Derfor bør kjemiske effekter undersøkes ved hjelp av forskjellige cellekulturer som reflekterer forskjellige målsteder i fisk (f.eks. lever, gonader, gjell, hjerne), og ikke bare i en enkelt cellelinje55.

Disse protokollene kan ha forskjellige anvendelser i økotoksisitetsstudier, og bruken av dem er ikke nødvendigvis begrenset til å forutsi akutt toksisitet hos fisk. For eksempel kan de brukes til å definere subcytotoksiske konsentrasjoner for å utføre andre in vitro fisketoksisitetstesting, for eksempel evaluering av hormonforstyrrende effekter på fisk. I tillegg kan in vitro cytotoksisitetsdata også bidra til å utvikle og forbedre fysiologisk basert toksikokinetisk (PBTK) modellering. Siden PBTK fokuserer på fordelingen av et kjemikalie i en organisme med tanke på de forskjellige organene (som gjelle, lever eller tarm)56, kan bruk av cellelinjer fra forskjellige fiskearter og vevsopprinnelse være en nyttig informasjonskilde for denne modellen. Resultatene av in vitro bioassays (f.eks. cytotoksisitetsanalyser) gir inngangsdata som representerer biologiske prosesser i PBTK-modellen og bidrar til in vitro til in vivo ekstrapolering21,56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Til minne om Dr. Márcio Lorencini, en medforfatter av dette arbeidet, en utmerket forsker innen kosmetikk og viet til å fremme kosmetisk forskning i Brasil. Forfatterne er takknemlige for flerbrukerlaboratoriet i fysiologisk avdeling (UFPR) for tilgjengelighet av utstyr og for økonomisk støtte fra koordineringen for forbedring av høyere utdanningspersonell (CAPES, Brasil) (finanskode 001) og Grupo Boticario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).

Tags

Miljøvitenskap utgave 191
Cytotoksisitetsanalyser med sebrafiskcellelinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, … More

Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter