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क्रिस्टलीय सिलिका धूल के बार-बार साँस लेने से स्थापित एक सिलिकोसिस माउस मॉडल

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64862
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4, 1,3,4, 1,4, 1,4, 1,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Key Laboratory of Industrial Dust Control and Occupational Health of the Ministry of Education, Anhui University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University of Science and Technology, 3Anhui Province Engineering Laboratory of Occupational Health and Safety, 4School of Medicine, Department of Medical Frontier Experimental Center, Anhui University of Science and Technology
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल नाक ड्रिप के माध्यम से सिलिका निलंबन के बार-बार संपर्क के माध्यम से सिलिकोसिस के माउस मॉडल को स्थापित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यह मॉडल कुशलतापूर्वक, आसानी से और लचीले ढंग से उच्च पुनरावृत्ति और अर्थव्यवस्था के साथ मानव सिलिकोसिस की रोग प्रक्रिया की नकल कर सकता है।

Abstract

सिलिकोसिस एक औद्योगिक वातावरण में श्वसन क्रिस्टलीय सिलिका धूल (सीएसडी) के संपर्क में आने के कारण हो सकता है। मनुष्यों में सिलिकोसिस के पैथोफिज़ियोलॉजी, स्क्रीनिंग और उपचार सभी माउस सिलिकोसिस मॉडल का उपयोग करके बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। चूहों को बार-बार अपने फेफड़ों में सीएसडी लेने के द्वारा, चूहे मानव सिलिकोसिस के नैदानिक लक्षणों की नकल कर सकते हैं। यह पद्धति समय और आउटपुट के संदर्भ में व्यावहारिक और कुशल है और सर्जरी के कारण ऊपरी श्वसन पथ को यांत्रिक चोट नहीं पहुंचाती है। इसके अलावा, यह मॉडल सिलिकोसिस की तीव्र / पुरानी परिवर्तन प्रक्रिया की सफलतापूर्वक नकल कर सकता है। मुख्य प्रक्रियाएं इस प्रकार थीं। निष्फल 1-5 μm CSD पाउडर को पूरी तरह से पीसा गया था, खारा में निलंबित कर दिया गया था, और 30 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान में फैलाया गया था। आइसोफ्लुरेन-प्रेरित संज्ञाहरण के तहत चूहों ने लगभग 2 सेकंड के लिए उथले तेजी से सांस लेने से गहरी, धीमी आकांक्षा में बदल दिया। माउस को एक हाथ की हथेली में रखा गया था, और अंगूठे की नोक ने वायुमार्ग को सीधा करने के लिए माउस के जबड़े के होंठ के किनारे को धीरे से छुआ। प्रत्येक साँस छोड़ने के बाद, चूहों ने सिलिका निलंबन में एक नथुने के माध्यम से बूंद-बूंद सांस ली, प्रक्रिया को 4-8 सेकंड के भीतर पूरा किया। चूहों की सांस स्थिर होने के बाद, उनकी छाती को स्ट्रोक किया गया और सीएसडी को खांसने से रोकने के लिए सहलाया गया। चूहों को फिर पिंजरे में वापस कर दिया गया। निष्कर्ष में, यह मॉडल ऊपरी श्वसन पथ से टर्मिनल ब्रोंकिओल्स और एल्वियोली तक फेफड़ों में छोटे कणों के विशिष्ट शारीरिक मार्ग के साथ सीएसडी की मात्रा निर्धारित कर सकता है। यह काम के कारण कर्मचारियों के आवर्तक जोखिम को भी दोहरा सकता है। मॉडल एक व्यक्ति द्वारा किया जा सकता है और महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। यह आसानी से और प्रभावी ढंग से उच्च पुनरावृत्ति के साथ मानव सिलिकोसिस की रोग विशेषताओं का अनुकरण करता है।

Introduction

श्रमिकों को अनिवार्य रूप से अनियमित क्रिस्टलीय सिलिका धूल (सीएसडी) के संपर्क में लाया जाता है, जिसे साँस लिया जा सकता है और खनन, मिट्टी के बर्तन, कांच, क्वार्ट्ज प्रसंस्करण और कंक्रीट 1,2 सहित कई व्यावसायिक संदर्भों में अधिक विषाक्त है। सिलिकोसिस के रूप में जानी जाने वाली एक पुरानी धूल साँस लेना की स्थिति प्रगतिशील फेफड़ों के फाइब्रोसिसका कारण बनती है। महामारी विज्ञान के आंकड़ों के अनुसार, पिछले कुछ दशकों में सिलिकोसिस की घटनाओं में वैश्विक स्तर पर गिरावट आई है, लेकिन हाल के वर्षों में, यह बढ़ रहा है औरयुवा लोगों को प्रभावित कर रहा है। सिलिकोसिस का अंतर्निहित तंत्र अपनी घातक शुरुआत और लंबी इनक्यूबेशन अवधि के कारण वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत करता है। यह अभी भी अज्ञात है कि सिलिकोसिस कैसे विकसित होता है। इसके अलावा, कोई भी वर्तमान दवाएं सिलिकोसिस और रिवर्स पल्मोनरी फाइब्रोसिस की प्रगति को रोक नहीं सकती हैं।

सिलिकोसिस के लिए वर्तमान माउस मॉडल में सीएसडी के मिश्रित निलंबन का श्वासनली अंतर्ग्रहण शामिल है। उदाहरण के लिए, एनेस्थीसिया के बाद सर्वाइकल ट्रेकिआ आघात को अपनाकर फेफड़ों में सीएसडी का प्रशासन डाई डस्ट7 के बार-बार मानव संपर्क का अनुपालन नहीं करता है। व्यक्तियों पर परिवेशी धूल के संपर्क के प्रभाव का अध्ययन एरोसोल के रूप में सीएसडी को उजागर करके किया जा सकता है, जो इसजहरीले पदार्थ की पर्यावरणीय सांद्रता को अधिक सटीक रूप से दर्शाता है। हालांकि, माउस नाक9 की अनूठी शारीरिक संरचना के कारण पर्यावरणीय सीएसडी को सीधे फेफड़ों में नहीं डाला जा सकता है। इसके अलावा, इस तकनीक से जुड़े उपकरण महंगे हैं, जिसके कारण शोधकर्ताओं ने माउस सिलिकोसिस मॉडल10 का पुनर्मूल्यांकन किया है। 2 सप्ताह के भीतर पांच बार नाक ड्रिप के माध्यम से सीएसडी निलंबन को साँस लेने से, सिलिकोसिस का एक गतिशील मॉडल बनाना संभव था। यह मॉडल उपयोग करने में आसान होने के दौरान सुसंगत और सुरक्षित है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह अध्ययन चूहों में सीएसडी के बार-बार साँस लेने की अनुमति देता है। इस प्रक्रिया के माध्यम से बनाया गया माउस सिलिकोसिस मॉडल अनुसंधान आवश्यकताओं के लिए अधिक फायदेमंद होने की उम्मीद है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं ने प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की मार्गदर्शिका (एनआईएच प्रकाशन संख्या 8023, संशोधित 1978) के दिशानिर्देशों का पालन किया और अनहुई यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी के मेडिकल स्कूल में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. चूहों का प्रबंधन और खिलाना

  1. 20 स्वस्थ C57BL/6 नर चूहों को 1: 1 अनुपात में प्रयोगात्मक या वाहन समूहों में असाइन करें। चूहों को 1 सप्ताह के लिए नए वातावरण में अनुकूलित करें।
  2. प्रति दिन 12 घंटे का निरंतर प्रकाश समय प्रदान करें। सटीक समय के लिए एक समय नियंत्रण स्विच का उपयोग करें।

2. सीएसडी निलंबन तैयार करना

  1. नाक टपकने से कम से कम 1 दिन पहले, सिलिका को एगेट मोर्टार में 0.5 घंटे के लिए पीस लें।
  2. क्रिस्टल कणों के आकार और आकार का निरीक्षण करें। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करके प्रतिनिधि तस्वीरें लें।
    1. एसईएम के लिए नमूना तैयार करने के लिए कणों को बांधने के लिए प्रवाहकीय टेप का उपयोग करें। सिलिकॉन कणों को धीरे से उड़ाने के लिए हेयर ड्रायर का उपयोग करें जो मजबूती से बंधे नहीं हैं।
    2. नमूना कक्ष को खाली करें, उच्च दबाव चालू करें, और छवि को कैप्चर करें।
      नोट: लेंस और नमूने के बीच कामकाजी दूरी (डब्ल्यूडी) 5.9 मिमी है, त्वरित वोल्टेज 2.0 केवी है, और सिग्नल ए डिटेक्टर का उपयोग करके आवर्धन (मैग) 100,000 x है। कण अनियमित क्रिस्टलीकरण के साथ फैले हुए हैं, और लगभग 80% का व्यास 1-5 μm है (चित्रा 1 ए)।
  3. 20 मिलीग्राम / एमएल बाँझ सीएसडी निलंबन बनाएं। बाँझ खारा का उपयोग करके सीएसडी को पतला करें और इसे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर अल्ट्रासोनिक शेकर (40 किलोहर्ट्ज, 80 डब्ल्यू) के साथ मिलाएं।
  4. नाक की ड्रिप लगाने से पहले सीएसडी सस्पेंशन को 10 सेकंड के लिए भंवर मिक्सर पर अच्छी तरह से मिलाएं।

3. माउस को नाक ड्रिप देना

  1. एनेस्थीसिया मशीन (चित्रा 1 बी, बाएं पैनल) में 3.6 एमएल / घंटा की खुराक पर 2% आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को तेजी से एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: तकनीशियन द्वारा एनेस्थेटिक की साँस लेने से बचने के लिए एनेस्थीसिया को फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए। चूहों में तेजी से और अनियमित श्वास से धीमी और स्थिर अवस्था में परिवर्तन को देखकर संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करें।
  2. 4-8 सेकंड के भीतर सीएसडी के 50 μL को नाक से टपकाएं (चित्रा 1 बी, दाएं)।
    1. नाक की ड्रिप के लिए, माउस के सिर को शोधकर्ता के मेटाकार्पोफालांगल जोड़ पर इंडेक्स उंगली की नोक के साथ रखें।
    2. माउस को एक प्रवण स्थिति में रखें, जिसमें चार उंगलियां थोड़ी लचीली हों और अंगूठे की नोक हल्के से वायुमार्ग को सीधा करने के लिए माउस के निचले होंठ को स्पर्श करें। गैग रिफ्लेक्स को प्राप्त करने के लिए ग्रसनी को छूने से बचें।
    3. 200 μl पिपेट का उपयोग करके 50 μl तरल का उपयोग करें। माउस की श्वसन दर के आधार पर तीन से चार विभाजित खुराक में माउस की नाक गुहा में तरल गिराएं। प्रत्येक इंजेक्शन में 15 से 20 μl तरल शामिल होना चाहिए। ड्रिप को हर 3 दिन में एक बार, 12 दिन में 5 गुना करें। नियंत्रण माउस को समान मात्रा में खारा के साथ इलाज करें।
  3. माउस 5x-10x के हृदय क्षेत्र को 5 सेकंड के लिए धीरे से मालिश करें।
    1. माउस के शरीर को हथेली से पकड़ें, अंगूठे और तर्जनी उंगली से गर्दन के पीछे की त्वचा को चुटकी दें, और माउस के पिछले अंगों को अन्य उंगलियों से ठीक करें। फिर, धीरे से माउस के दिल की धड़कन वाले क्षेत्र को दूसरे हाथ की तर्जनी उंगली से 5 सेकंड की अवधि में 5-10 बार दबाएं।
  4. जब माउस की श्वास स्थिर हो जाती है, तो इसे हीटिंग पैड के साथ एक रिकवरी पिंजरे में रखें और एनेस्थीसिया से ठीक होने तक निरीक्षण करें, फिर माउस को उसके घर के पिंजरे में वापस कर दें। 31 दिनों में माउस की बलि दें।

4. फेफड़ों के ऊतकों को इकट्ठा करना और एक पैराफिन अनुभाग तैयार करना

  1. 10% क्लोरल हाइड्रेट इंट्रापरिटोनियल रूप से 0.18 एमएल इंजेक्ट करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि चूहे पैर की अंगुली या पूंछ उत्तेजना का जवाब नहीं देते हैं (टूथेड फोर्सप्स का उपयोग करके किया जाता है)। फिर, अगले चरण पर आगे बढ़ें।
  2. फोम टेस्ट बोर्ड पर माउस अंगों को ठीक करें और फर को कम करने के लिए 75% अल्कोहल के साथ स्प्रे करें। क्लैविकल की मध्य रेखा पर अधिकांश वक्ष पसलियों को हटा दें और हृदय और फेफड़ों को उजागर करने के लिए चूहों के वक्ष गुहा को खोलें।
  3. तुरंत नेत्र शल्य चिकित्सा कैंची के साथ दाएं आलिंद को काटें और धीरे-धीरे पूरे रक्त को बहने की अनुमति देने के लिए सबसे बड़े आयाम के साथ बाएं एट्रियल बीट पर हृदय की नोक से 20 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर (पीबीएस) इंजेक्ट करें। इसके बाद, दाहिने फेफड़े के निचले लोब को हटा दें और इसे पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. पीबीएस इंजेक्शन के बाद एक ही साइट में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 10 एमएल को डालें। शेष फेफड़े को इकट्ठा करें और पैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए 4% पीएफए के 30 एमएल में नमूने को संरक्षित करें।
  5. निर्धारण के 72 घंटे के बाद, पैराफिन में नमूने एम्बेड करें।
    1. आरटी पर 1 घंटे के लिए विआयनीकृत पानी (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) में इथेनॉल (ईटीओएच) की एक श्रेणीबद्ध श्रृंखला के माध्यम से ऊतकों को निर्जलित करें।
    2. 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके पिघले हुए पैराफिन मोम के साथ नमूने में घुसपैठ करें। इस प्रक्रिया को दूसरे सिलेंडर में दोहराएं। मोम के सांचे को 1 घंटे के लिए ऊतकों के साथ ठंडा करें ताकि कठोर हो सके।
    3. मोम सख्त हो जाने के बाद और ऊतक एम्बेडेड हो जाने के बाद, ऊतक को 5 μm पर स्लाइस करने के लिए पैराफिन सेक्शनिंग मशीन का उपयोग करें। सटीक सेक्शनिंग और स्लाइड माउंटिंग चरणों को पहले11 वर्णित किया गया था।
      नोट: 4% पीएफए के 10 एमएल प्राप्त करने के बाद मांसपेशियों के हिलने और पूंछ को "एस" आकार या फ्लेक्सन में विकसित करके पर्याप्त ऊतक छिड़काव का संकेत दिया जाता है।

5. हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एचई) धुंधला प्रदर्शन करना

  1. पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों को गर्म प्लेट (60 डिग्री सेल्सियस) पर 4 घंटे से अधिक समय तक गर्म करें ताकि स्लाइड्स में आसंजन और बेहतर डिपैराफिनेशन की अनुमति मिल सके।
  2. डीवैक्स और हाइड्रेट पैराफिन अनुभाग। हर बार 30 मिनट के लिए जाइलीन 2x में नमूने के साथ स्लाइड भिगोएँ। इसके बाद, उन्हें निर्जल इथेनॉल, फिर 95%, 85%, 75% अल्कोहल और विआयनीकृत पानी में क्रमशः 5 मिनट के लिए डुबोएं।
  3. हेमटोक्सीलिन और इओसिन धुंधला करें। ऊतकों को 10 मिनट के लिए हेमटोक्सीलिन धुंधला बाल्टी में दाग दें। उन्हें 5 मिनट के लिए धीरे से बहते पानी से धो लें। फिर, स्लाइड को 10 सेकंड के लिए ईओसिन धुंधला बाल्टी में डुबोएं।
  4. 75%, 85%, 95%, और निर्जल इथेनॉल में प्रत्येक 5 मिनट के लिए नमूने निर्जलित करें। ऊतक वर्गों को 5 मिनट के लिए जाइलीन में डुबोकर साफ करें। तटस्थ राल बूंदों के लगभग 60 μL के साथ अनुभाग को सील करें। कवर स्लाइड को अनुभाग पर रखें और हवा के बुलबुले से बचने के लिए इसे ध्यान से नीचे करें।

6. मैसन स्टेनिंग का प्रदर्शन

  1. पैराफिन नमूनों को डीवैक्स और हाइड्रेट करें, जैसा कि चरण 5.2 में बताया गया है। फिर, 10 मिनट के लिए 50% वीगर्ट के हेमटोक्सीलिन के साथ सेल नाभिक को दाग दें। ऊतक को अम्लीय इथेनॉल द्रवीकरण में 10 सेकंड के लिए भिगोएं और नाभिक को ब्लुइंग के लिए बहते पानी के साथ धीरे से कुल्ला करें।
    नोट: उपयोग से तुरंत पहले वीगर के हेमटोक्सीलिन धुंधला समाधान तैयार करें।
  2. 7 मिनट के लिए लिचुन लाल धुंधला घोल (प्रत्येक ऊतक स्लाइड के लिए 40 μL) की बूंदों के साथ नमूने को दाग दें और अनबाउंड लिचुन लाल डाई को हटाने के लिए उन्हें 1 मिनट के लिए कमजोर एसिड वर्किंग सॉल्यूशन (30% हाइड्रोक्लोरिक एसिड) से धो लें।
  3. उन्हें 20 सेकंड के लिए 95% अल्कोहल में डुबोएं और उन्हें 1-3 सेकंड के लिए निर्जल इथेनॉल के साथ 2 गुना निर्जलित करें। उसके बाद, जाइलीन के साथ ऊतकों को साफ करें और उन्हें 60 μL तटस्थ राल बूंदों के साथ सील करें, जैसा कि चरण 5.4 में बताया गया है।

7. सिरियस लाल धुंधला प्रदर्शन करना

  1. चरण 5.2 में उल्लिखित डीवैक्स और हाइड्रेट पैराफिन अनुभाग।
  2. सिरियस लाल धुंधला समाधान के साथ 1 घंटे के लिए अनुभागों में घुसपैठ करें।
  3. मेयर हेमटोक्सीलिन धुंधला घोल के साथ 8-10 मिनट के लिए नमूने के सेल नाभिक को दाग दें। उन्हें 10 मिनट के लिए बहते पानी से धीरे से धो लें। फिर, ऊतक स्लाइड को निर्जलित और साफ़ करें। चरण 5.4 में उल्लिखित के रूप में उन्हें सील करें।

8. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन

  1. चरण 5.2 में वर्णित पैराफिन नमूनों को डीवैक्स और हाइड्रेट करें।
  2. लगभग 30 एमएल के 3 मिलीग्राम / एमएल ईडीटीए एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान के साथ नमूनों में घुसपैठ करें। 20-30 मिनट के लिए उबालें। विआयनीकृत पानी के साथ ऊतकों को धोएं, और फिर उन्हें 5 मिनट के लिए 0.5% ट्वीन -20 (पीबीएसटी) युक्त फॉस्फेट-बफर समाधान में इनक्यूबेट करें।
  3. नमूनों में अंतर्जात पेरोक्सीडेज को निष्क्रिय करने के लिए 0.3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के साथ 15 मिनट के लिए नमूने भिगोएं। हर बार 5 मिनट के लिए उन्हें पीबीएसटी के साथ 3 x धो लें।
    नोट: 0.3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान को प्रकाश-प्रूफ वातावरण में ताजा बनाया जाना चाहिए।
  4. 0.3% ट्राइटन -100 घोल के साथ 15 मिनट के लिए नमूनों की झिल्ली को परमेबिलाइज़ करें। फिर, 1 घंटे के लिए 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 30-40 μL के साथ ब्लॉक करें।
  5. ब्लॉकिंग समाधान निकालें। पतला प्राथमिक एंटीबॉडी एनएफ-20बी (कमजोर 1: 200) और सीडी 68 (कमजोर 1: 1,000) जोड़ें और वाष्पीकरण और प्रकाश को रोकने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड आईएचसी वेट बॉक्स में 2-8 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को रात भर इनक्यूबेट करें।
  6. अगले दिन, उन्हें 1 घंटे के लिए आरटी में स्थानांतरित करें। फिर, उन्हें 5 मिनट के लिए PBST 3x के साथ धो लें।
  7. आरटी पर खरगोश एंटी-माउस हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी (कमजोर अनुपात 1: 500) में 1 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें और उन्हें 5 मिनट के लिए पीबीएसटी 3 एक्स के साथ धो लें।
    नोट: प्राथमिक और द्वितीयक दोनों एंटीबॉडी को 5% बीएसए के साथ पतला किया गया था।
  8. 5-20 मिनट के लिए एंजाइम-लेबल एंटीबॉडी के अनुरूप 3,3'-डायमिनोबेंज़िडीन (डीएबी) सब्सट्रेट के साथ नमूने इनक्यूबेट करें। विआयनीकृत पानी के साथ प्रतिक्रिया को रोकें जब इष्टतम धुंधला तीव्रता तक पहुंच जाए।
    नोट: डीएबी समाधान को ताजा तैयार करने और प्रकाश से संरक्षित करने की आवश्यकता है। रंग विकास प्रतिक्रिया को माइक्रोस्कोप के तहत वास्तविक समय में देखा जाना चाहिए ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि धुंधला होने से कब रोकना है। सकारात्मक नमूने तीव्र धुंधलापन प्रदर्शित करते हैं, जबकि नकारात्मक नमूने रंग विकसित नहीं करते हैं।
  9. वीगर्ट हेमटोक्सिलिन के साथ 30 सेकंड के लिए नमूने को काउंटरस्टेन करें। इसके बाद, 1 मिनट के लिए बहते पानी के नीचे ऊतकों को धो लें। फिर, चरण 5.4 में उल्लिखित ऊतक स्लाइड को निर्जलित, स्पष्ट और सील करें।

9. पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण करना।

  1. प्रोटीन निकालने के लिए फेफड़ों के ऊतकों को अलग करें। फेफड़ों के ऊतकों के 20 मिलीग्राम में आरआईपीए कामकाजी समाधान के 200 μL जोड़ें।
  2. एक हैंडहेल्ड इलेक्ट्रिक ग्राइंडर का उपयोग करके 5 मिनट के लिए बर्फ पर ऊतक को समरूप करें और कोमल झटकों के साथ बर्फ पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। बाद में, 14,800 x g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर होमोजेनेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें और बीसीए प्रोटीन परख किट के साथ प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें। 6 μg / μL प्रोटीन पर RIPA के साथ प्रोटीन भंडारण समाधान बनाएं। प्रोटीन लाइसेट के 80 μL में 5x लोडिंग बफर के 20 μL जोड़ें। 20 मिनट के लिए धातु स्नान (100 डिग्री सेल्सियस) में प्रोटीन युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को गर्म करके द्वितीयक प्रोटीन संरचना को बाधित करें।
  4. ठंडा होने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में प्रोटीन भंडारण समाधान के 100 μL को एलिकोट करें और नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें। वैद्युतकणसंचलन से पहले 1x लोडिंग बफर के साथ प्रोटीन एकाग्रता को 2-3 μg / μL तक पतला करें।
    नोट: प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रिया बर्फ पर किया जाना चाहिए। आरआईपीए कार्यशील समाधान के लिए, फॉस्फोराइलेटेड प्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए आरआईपीए के 99 μL में 100 mM phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) का 1 μL जोड़ें।  1: 4 के अनुपात में आरआईपीए के साथ 5 x लोडिंग बफर को पतला करके 1x लोडिंग बफर तैयार करें।
  5. प्रत्येक कुएं में 20 μg नमूने जोड़ें और जेल चलाएं। 5% केंद्रित जैल के लिए, प्रोटीन को उसी प्रारंभिक बिंदु से नीचे रखने के लिए 20 मिनट के लिए 80 वी का उपयोग करें। 10% पृथक जैल के लिए, 1 घंटे के लिए 100 वी पर चलाएं ताकि विभिन्न आणविक भार के प्रोटीन को यथासंभव अलग किया जा सके।
  6. 20 सेकंड के लिए मेथनॉल के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को पूर्व-सक्रिय करें। 1-2 घंटे के लिए 400 एमए करंट के साथ गीली हस्तांतरण विधि का उपयोग करके प्रोटीन को पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि वैद्युतकणसंचलन टैंक और इलेक्ट्रोट्रांसफर टैंक क्षैतिज हैं। पूरे टैंक को बर्फ से ठंडा करें, क्योंकि झिल्ली हस्तांतरण प्रक्रिया बहुत गर्मी उत्पन्न करती है।
  7. हर बार 5 मिनट के लिए टीबीएसटी घोल के साथ झिल्ली को धो लें, 5x। फिर, 1 घंटे के लिए 5% बीएसए या 5% स्किम दूध के साथ ब्लॉक करें। 5% बीएसए के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी एनएफ-1,000 (1: 1,000) और β-एक्टिन (1: 1,000) को पतला करें। एंटीबॉडी समाधान में स्ट्रिप्स को डुबोएं और स्ट्रिप्स को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर रात भर धीरे से हिलाएं।
  8. स्ट्रिप्स को पीबीएसटी से धो लें। इसके बाद, हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) -संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 10,000) को पतला करें और उन्हें कोमल झटकों के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए पतला द्वितीयक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट करें।
  9. एक एन्हांस्ड केमिल्यूमिनेसेंस (ईसीएल) डेवलपर तैयार करें, इसे पट्टी पर छोड़ दें, और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. स्ट्रिप को 20 सेकंड के लिए जेल इमेजर में उजागर करें। सिस्टम सॉफ्टवेयर द्वारा प्रोटीन स्तर का आकलन करने के लिए पट्टी के ग्रे मूल्य को मापें। आंतरिक नियंत्रण के रूप में β-एक्टिन का उपयोग करें।

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Representative Results

प्रस्तावित विधि का उपयोग करके चूहों में सिलिकोसिस के संभावित रोगजनन की जांच की गई थी। हमने पाया कि प्रयोगात्मक समूह में चूहों के शरीर का वजन नियंत्रण समूह के सापेक्ष काफी कम हो गया और यह कि जोखिम की समाप्ति के बाद शरीर का वजन धीरे-धीरे ठीक हो गया। यहां उपयोग की जाने वाली अनुकूलित खुराक के कारण, इस प्रयोग में सिलिका-उजागर चूहों में कोई मृत्यु दर नहीं देखी गई। सीएसडी के लिए बार-बार नाक ड्रिप का तकनीकी रोडमैप (चित्रा 1) में दिखाया गया है। पहले वर्णित प्रक्रियाओं में सीएसडी निलंबन तैयारी, आइसोफ्लुरेन-प्रेरित संज्ञाहरण, नाक ड्रिप और थोरेसिक मालिश12 शामिल थे। हमने स्थिर भोजन12 के 4 सप्ताह के बाद कोलेजन जमाव और मायोफाइब्रोब्लास्ट भेदभाव का प्रदर्शन किया। हमने कोयले की धूल के कारण फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस धूल जोखिम विधि का उपयोग किया है। मैक्रोफेज के नए उपसमुच्चय और विटामिन डी के हस्तक्षेप प्रभाव को एकल-कोशिका प्रतिलेख प्रौद्योगिकी13 के माध्यम से पाया गया था। इस अध्ययन में, सीएसडी के संपर्क में आने से चूहों में फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस की प्रगति काफी तेज हो गई थी, जिससे ब्रोन्कियल परिधीय लोचदार फाइबर (चित्रा 2 और चित्रा 3) को नुकसान हुआ। सिलिकोसिस नोड्यूल मैक्रोफेज से बने होते हैं जिनमें सीएसडी होता है। फाइब्रोसिस नोडुलर कई सीएसडी से समृद्ध है, और सीडी 68-पॉजिटिव मैक्रोफेज सक्रिय रूप से इन कणों को घेरते हैं। ये जमा सीएसडी रेशेदार फॉसी के गठन को बढ़ावा देते हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, 4 सप्ताह के लिए सीएसडी के संपर्क में आने के बाद, चूहों ने स्पष्ट घावों का अधिग्रहण किया, जैसे कि सिलिकॉन फेफड़ों के नोड्यूल में कोलेजन जमाव और फेफड़ों के ऊतक संरचना को नुकसान। ब्रोंची12 के आसपास के ऊतक की मामूली चोट भी थी। सीएसडी के कारण ईआर तनाव की जैविक प्रक्रिया एनएफ-ओबी से संबंधित है, जो भड़काऊ प्रतिक्रिया में शामिल है ( चित्रा 4 देखें)। कुल मिलाकर, इन निष्कर्षों से पता चलता है कि प्रस्तावित दृष्टिकोण माउस सिलिकोसिस के विकास को प्रभावी ढंग से अनुकरण कर सकता है।

Figure 1
चित्र 1: नाक ड्रिप के लिए पांच माइक्रोन से नीचे क्रिस्टलीय सिलिका धूल (सीएसडी) कणों का उपयोग किया गया था। (ए) सीएसडी की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) से पता चला कि कण अनियमित आकार के थे। (बी) सीएसडी निलंबन का उपयोग नाक ड्रिप द्वारा माउस सिलिकोसिस मॉडल तैयार करने के लिए किया गया था। बाईं ओर की मशीन का उपयोग आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण के लिए किया जाता है, और दायां पैनल उन प्रमुख बिंदुओं को रेखांकित करता है जो नाक ड्रिप के काम करने की ओर ले जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सिरियस रेड स्टेनिंग ने 1 महीने के लिए नाक ड्रिप सीएसडी द्वारा माउस फेफड़ों में फाइब्रोसिस दिखाया । (ए) सीएसडी या खारा उपचार (फलक में बाएं ऊपरी और बाएं नीचे) के बाद फेफड़ों के ऊतकों में कोलेजन जमाव को मापने के लिए सीरियस रेड स्टेनिंग किया गया था। ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी ने तीन अलग-अलग प्रकार के कोलेजन फाइबर (लाल, पीले और हरे) का खुलासा किया, जिनमें से लाल रंग में दिखाए गए टाइप 1 कोलेजन फाइबर सिलिकोसिस के लिए एक जोखिम कारक हैं। हालांकि, वाहन समूह (दाएं ऊपर और कम पैनल) में कोई महत्वपूर्ण फाइब्रोसिस नहीं पाया गया। (बी) फाइब्रोसिस स्कोर (एफएस) एक अर्ध-मात्रात्मक मूल्यांकन सूचकांक है जो सीरियस रेड स्टेनिंग12 पर आधारित है जो नियंत्रण (**पी < 0.0001) से काफी भिन्न है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सिलिकोटिक नोड्यूल बनाने में मैक्रोफेज की भूमिका की निगरानी के लिए सीएसडी-उपचारित माउस फेफड़े में सीडी 68 का इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला होना। एक विशिष्ट सिलिका नोड्यूल को केंद्र में सीएसडी के फागोसाइटोसिस के बाद तरलीकृत परिगलन की विशेषता है, जो परिधि में मैक्रोफेज (एचई धुंधला) से घिरा हुआ है। इसके अलावा, सीएसडी को फाइब्रोसिस (मैसन धुंधला) के साथ नोड्यूल्स में समृद्ध किया गया था। सीडी 68 के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला होने से पता चला कि मैक्रोफेज फेफड़ों के ऊतकों में व्यापक रूप से मौजूद थे। इसके अलावा, इन मैक्रोफेज ने सीएसडी (ध्रुवीकृत प्रकाश माइक्रोस्कोपी, दाएं पैनल के तहत देखा गया) का सेवन किया था, जिससे फेफड़ों की गंभीर चोट लगी थी। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सीएसडी-उपचारित माउस फेफड़े में एनएफ-3बी अभिव्यक्ति । (ए) फेफड़ों के ऊतकों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला किया गया था। दाएं फलक पर सीएसडी-उपचारित चूहों के फेफड़ों ने बाईं ओर वाहन समूह की तुलना में उच्च एनएफ-3बी धुंधला पन दिखाया। स्केल बार = 50 μm. (B) प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा से पता चला कि CSD-उपचारित चूहों के फेफड़ों में NF-κB अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है। ताजा फेफड़ों के ऊतक लाइसिस को पश्चिमी सोख्ता के अधीन किया गया था। (सी) एसआईएल और वेह समूहों के बीच एनएफ-3बी अंतर महत्वपूर्ण था (** पी < 0.01)। बैंड की तीव्रता छवि जे का उपयोग करके मापा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सिलिकोसिस माउस मॉडल सिलिकोसिस के रोगजनन और उपचार का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह प्रोटोकॉल बार-बार नाक के संपर्क के माध्यम से चूहों में सिलिकोसिस का एक मॉडल तैयार करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यह विधि विभिन्न जोखिम समय से प्रेरित सिलिकोसिस की रोग संबंधी विशेषताओं के अध्ययन की अनुमति देती है। चूहों को वेंटिलेटर पर एनेस्थेटाइज किया गया था, और उनकी श्वसन दर की निगरानी की गई थी। प्रारंभिक छोटी, तेज श्वास दर धीरे-धीरे धीमी हो गई और समय के साथ गहरी हो गई। संज्ञाहरण ने चूहों की मांसपेशियों को आराम करने का कारण बना, जिससे गहरी सांस ली गई और उन्हें धीमी, गहरी सांस लेने की समय खिड़की के दौरान सीएसडी को साँस लेने की अनुमति मिली। इस प्रक्रिया के दौरान, ऑपरेटर अपने अंगूठे से माउस के जबड़े को पकड़ता है और तरल को पाचन तंत्र में प्रवेश करने से रोकने के लिए अपनी गर्दन को सीधा करता है, श्वसन योग्य धूल जोखिम की एक विधि जो दर्द का कारण नहीं बनती है और गैर-आक्रामक है। यह विधि धूल जोखिम का अध्ययन करने के लिए बार-बार कार्यान्वयन की व्यक्तिगत आवश्यकताओं को पूरा कर सकती है। 2017 में काटो एट अल ने फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस को मॉडल करने के लिए एक ऑरोफरीन्जियल ड्रिप के माध्यम से एक बड़ी खुराक (125 मिलीग्राम / एमएल, 40 μL) का उपयोग किया, और हम नाक गुहा14 के माध्यम से कई छोटी खुराक द्वारा प्रेरित फुफ्फुसीय परिवर्तनों का पता लगाने की कोशिश करने के लिए इस एकाग्रता का उल्लेख करते हैं।

तकनीकी दृष्टिकोण से पोस्ट-एनेस्थीसिया नाक ड्रिप से जुड़ी कई चुनौतियां हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, ऑपरेटर अपनी गर्दन को सीधा करने और तरल को पाचन तंत्र में प्रवेश करने से रोकने के लिए अपने अंगूठे से माउस के जबड़े को पकड़ता है। यदि चूहे गहरी संज्ञाहरण प्राप्त नहीं करते हैं या ऑपरेटर कुशल नहीं है और धीमी गहरी सांस लेने के लिए समय खिड़की से चूक जाता है, तो नाक ड्रिप का प्रभाव और मॉडल की रोग संबंधी विशेषताएं अपेक्षित नहीं होंगी। इसलिए, ओवर-एनेस्थेटाइज्ड मौत और अंडर-एनेस्थेटाइज्ड मॉडलिंग विफलता से बचने के लिए, जो लोग आइसोफ्लुरेन-एनेस्थेटाइज्ड चूहों के साथ काम करते हैं, उन्हें पर्याप्त रूप से प्रशिक्षित किया जाना चाहिए और नाक ड्रिप करने से पहले आइसोफ्लुरेन-एनेस्थेटाइज्ड चूहों की महत्वपूर्ण विशेषताओं में महारत हासिल करनी चाहिए। इसके अलावा, नाक की ड्रिप के बाद चूहों की छाती को दबाना, जिसे आमतौर पर मालिश कहा जाता है, टर्मिनल ब्रोंची और यहां तक कि फेफड़ों की वायुकोशीय दीवारों तक पहुंचने के लिए सीएसडी की यात्रा को बढ़ावा देता है। गहरे स्तर तक एनेस्थेटाइज्ड चूहों को नाक की ड्रिप की उच्च खुराक मिलने पर श्वासावरोध का खतरा था। हालांकि, अगर उनकी छाती तेजी से संकुचित हो गई थी, तो जीवित रहने की दर बढ़ गई। अंतिम लेकिन कम से कम, सिलिकोसिस मॉडल के निर्माण के लिए चूहों को एक ठोस शारीरिक आधार की आवश्यकता होती है, और कुछ अध्ययनों से पता चला है कि 10-12 सप्ताह से अधिक उम्र के चूहों में खराब सहनशीलता होती है और सीएसडी के बार-बार संपर्क में आने के बाद मृत्यु दर में वृद्धि होती है। इसके फायदे के बावजूद, इस मॉडल के कई नुकसान हैं। एक नुकसान यह है कि माउस सीधे एयरफ्लो के माध्यम से धूल के कणों को साँस नहीं लेता है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, हमने एक ही सांस में साँस लेने वाले सीएसडी निलंबन की मात्रा और सीएसडी के बार-बार प्रशासन की आवृत्ति को सीमित कर दिया है। इसके अलावा, हमने वाहन समूह स्थापित किए हैं। डेटा से पता चलता है कि तरल की थोड़ी मात्रा में सांस लेने से केवल अस्थायी रूप से वेंटिलेशन बाधित होता है,जो चूहों के फेफड़ों को नुकसान नहीं पहुंचाएगा। वाहन नियंत्रण चूहे चूहों के फेफड़ों के कार्य, शरीर के वजन या बेसल गतिविधि को प्रभावित किए बिना साँस के खारे तरल को जल्दी से अवशोषित करेंगे। इसके विपरीत, नाक साँस लेने के माध्यम से सीएसडी के बार-बार संपर्क में आनेसे चूहों में सिलिकोसिस का वांछित गतिशील मॉडल बन सकता है। क्योंकि विभिन्न एक्सपोजर आवृत्तियों बार-बार एक्सपोज़र वाले मॉडल में फाइब्रोसिस प्रक्रिया को प्रभावित करती हैं, हमारे पास स्पष्ट समय बिंदु नहीं है। आमतौर पर, सिलिका धूल के एक बार के संपर्क में, दिन 7 अभी भी सिलिकोसिस के शुरुआती चरण में है। दिन 7-14 भड़काऊ गतिविधि चरण के अनुरूप हैं, दिन 14-28 फाइब्रोसिस परिवर्तन चरण से मेल खाते हैं, और दिन 28 के बाद का समय फाइब्रोसिस गठन चरण12,15 से मेल खाता है। हालांकि, इन समय बिंदुओं पर पैथोलॉजी खुराक के आधार पर भिन्न हो सकती है।

नाक ड्रिप विधि में पारंपरिक एंडोट्राचेल ड्रिप या शल्य चिकित्सा से उजागर ट्रेकियोस्टोमी दृष्टिकोण16,17 पर कई फायदे हैं, जैसे कि ट्रेकोटॉमी से संबंधित संक्रमण को कम करना और पोस्टऑपरेटिव देखभाल। यह दृष्टिकोण एक प्रयोग के दौरान बार-बार सीएसडी एक्सपोजर की आवश्यकता को भी पूरा कर सकता है और महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, नाक ड्रिप विधि धूल के जोखिम का एक अधिक यथार्थवादी प्रतिनिधित्व है, क्योंकि छोटे कण ऊपरी श्वसन पथ से फेफड़ों में प्रवेश करते हैं और टर्मिनल ब्रोंकिओल्स और एल्वियोली की यात्रा करते हैं। चूंकि हम सिलिका ड्रिप की कई छोटी खुराक का उपयोग करते हैं, इसलिए सिलिका धूल की खुराक अधिकतम सीमा तक फेफड़ों में प्रवेश कर सकती है और जीव को लगातार उत्तेजित कर सकती है। इस प्रकार, यह मॉडलिंग दृष्टिकोण अपने काम के माहौल में सीएस के लिए कर्मचारियों के आवर्तक जोखिम का अनुकरण करने और सिलिकोसिस की रोग प्रक्रिया का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है।

सीएसडी के नाक के संपर्क के माध्यम से सिलिकोसिस के माउस मॉडल बनाना बार-बार एक्सपोज़र पर लागू किया जा सकता है। इसलिए, इस पशु मॉडल का उपयोग सिलिकोसिस प्रगति और सिलिकोसिस की गतिशील रोग संबंधी विशेषताओं और तंत्र पर एक्सपोजर आवृत्ति और खुराक के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, अन्य पदार्थों या दवाओं के साथ संयुक्त जोखिम भी बहुत संभव है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को अनहुई प्रांत के यूनिवर्सिटी सिनर्जी इनोवेशन प्रोग्राम (जीएक्सएक्सटी-2021-077) और अनहुई यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी ग्रेजुएट इनोवेशन फंड (2021सीएक्स 2120) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL tube Biosharp BS-05-M
10% formalin neutral fixative Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. NA
Adobe Illustrator Adobe  NA
Alcohol disinfectant Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. NA
CD68 Abcam ab125212
Citrate antigen retrieval solution biosharp life science BL619A
DAB chromogenic kit NJJCBio W026-1-1
Dimethyl benzene West Asia Chemical Technology (Shandong) Co NA
Enhanced BCA protein assay kit Beyotime Biotechnology P0009
Hematoxylin and Eosin (H&E) Beyotime Biotechnology C0105S
HRP substrate Millipore Corporation P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Proteintech Sa00001-2
Iceacetic acid West Asia Chemical Technology (Shandong) Co NA
ImageJ NIH NA
Isoflurane RWD Life Science R510-22
Masson's Trichrome stain kit Solarbio G1340
Methanol Macklin NA
Microtubes Millipore AXYMCT150CS
NF-κB p65 Cell Signaling Technology 8242S
Oscillatory thermostatic metal bath Abson NA
Paraffin embedding machine Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. PBM-A
Paraffin Slicer Jinhua Kratai Instruments Co. NA
Phosphate buffer (PBS)  Biosharp BL601A
Physiological saline  The First People's Hospital of Huainan City NA
Pipettes Eppendorf NA
PMSF Beyotime Biotechnological ST505
Polarized light microscope Olympus BX51
Precision balance Acculab ALC-110.4
Prism7.0 GraphPad  Version 7.0
PVDF membranes Millipore 3010040001
RIPA lysis buffer Beyotime Biotechnology P0013B
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system RSJ RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker Scilogex NA
SDS-PAGE gel preparation kit Beyotime Biotechnology P0012A
Silicon dioxid Sigma #BCBV6865
Sirius red staining Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. 181012
Small animal anesthesia machine Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. ZL-04A
Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) KIRGEN KG1011
Universal Pipette Tips (100–1000 µL) KIRGEN KG1313
Universal Pipette Tips (1–200 µL) KIRGEN KG1212
Vortex mixer  VWR NA
ZEISS GeminiSEM 500 Zeiss Germany SEM 500
β-actin Bioss bs-0061R

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References

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