Summary
В этом протоколе описывается метод создания мышиной модели силикоза путем многократного воздействия кремнеземных суспензий через назальную капельницу. Данная модель позволяет эффективно, удобно и гибко имитировать патологический процесс силикоза человека с высокой повторяемостью и экономичностью.
Abstract
Силикоз может быть вызван воздействием респираторной кристаллической кварцевой пыли (CSD) в промышленной среде. Патофизиология, скрининг и лечение силикоза у людей были тщательно изучены с использованием модели силикоза у мышей. Многократно заставляя мышей вдыхать CSD в легкие, мыши могут имитировать клинические симптомы силикоза человека. Эта методика практична и эффективна с точки зрения времени и производительности и не вызывает механических травм верхних дыхательных путей из-за хирургического вмешательства. Кроме того, эта модель может успешно имитировать острый/хронический трансформационный процесс силикоза. Основные процедуры заключались в следующем. Стерилизованный порошок CSD размером 1-5 мкм полностью измельчали, суспендировали в физиологическом растворе и диспергировали на ультразвуковой водяной бане в течение 30 мин. Мыши под анестезией, индуцированной изофлураном, переключались с поверхностного быстрого дыхания на глубокую, медленную аспирацию примерно на 2 с. Мышь помещалась в ладонь, и кончик большого пальца осторожно касался края губы челюсти мыши, чтобы выпрямить дыхательные пути. После каждого выдоха мыши вдыхали кремнеземную суспензию капля за каплей через одну ноздрю, завершая процесс в течение 4-8 с. После того, как дыхание мышей стабилизировалось, их грудную клетку поглаживали и ласкали, чтобы предотвратить откашливание вдыхаемого CSD. Затем мышей вернули в клетку. В заключение, эта модель может количественно оценить БКД вдоль типичного физиологического прохождения крошечных частиц в легкие, от верхних дыхательных путей до терминальных бронхиол и альвеол. Он также может воспроизводить повторяющееся воздействие на сотрудников из-за работы. Модель может быть выполнена одним человеком и не нуждается в дорогостоящем оборудовании. Он удобно и эффективно моделирует особенности заболевания силикоза человека с высокой повторяемостью.
Introduction
Рабочие неизбежно подвергаются воздействию нерегулярной кристаллической кварцевой пыли (CSD), которая может вдыхаться и является более токсичной во многих профессиональных контекстах, включая горнодобывающую промышленность, гончарное производство, обработку стекла, кварца и бетона 1,2. Хроническое вдыхание пыли, известное как силикоз, вызывает прогрессирующий фиброз легких3. Согласно эпидемиологическим данным, заболеваемость силикозом снижается во всем мире на протяжении последних нескольких десятилетий, но в последние годы он растет и поражает молодых людей 4,5,6. Основной механизм силикоза представляет собой серьезную проблему для научных исследований из-за его коварного начала и длительного инкубационного периода. До сих пор неизвестно, как развивается силикоз. Кроме того, никакие современные лекарства не могут остановить прогрессирование силикоза и обратить вспять фиброз легких.
Современные мышиные модели силикоза предполагают проглатывание трахеей смешанной суспензии БСД. Например, введение CSD в легкие путем принятия травмы шейного отдела трахеи после анестезии не соответствует повторному воздействию на человека красящей пыли7. Влияние воздействия окружающей пыли на людей может быть изучено путем воздействия на них КСД в виде аэрозолей, что более точно отражает концентрации этого токсичного вещества в окружающей среде8. Тем не менее, КСД из окружающей среды не может быть просто вдыхаем непосредственно в легкие из-за уникальной физиологической структуры носа мыши9. Кроме того, оборудование, связанное с этой технологией, является дорогостоящим, что заставило исследователей пересмотреть модель силикозамышей 10. Вдыхая суспензию ЦСД через назальную капельницу пять раз в течение 2 недель, удалось построить динамическую модель силикоза. Эта модель стабильна и безопасна, а также проста в использовании. Важно отметить, что это исследование допускает повторное вдыхание КСД у мышей. Ожидается, что модель силикоза мыши, созданная с помощью этой процедуры, будет более полезна для исследовательских нужд.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры соответствовали рекомендациям Руководства Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (публикация NIH No 8023, пересмотренная в 1978 году) и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию при Медицинской школе Аньхойского университета науки и технологий.
1. Содержание и кормление мышей
- Распределите 20 здоровых самцов мышей C57BL/6 в экспериментальную или транспортную группы в соотношении 1:1. Акклиматизируйте мышей к новой среде в течение 1 недели.
- Обеспечьте постоянное световое время 12 ч в сутки. Используйте переключатель управления временем для точного расчета времени.
2. Подготовка суспензии CSD
- Не менее чем за 1 сутки до капель из носа растирают диоксид кремния в агатовой ступке в течение 0,5 ч.
- Обратите внимание на размер и форму кристаллических частиц. Сделайте репрезентативные фотографии с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).
- Используйте токопроводящую ленту для связывания частиц для подготовки образца для SEM. Используйте фен, чтобы аккуратно сдуть частицы кремния, которые не прочно связаны.
- Откачайте воду из камеры для образцов, включите высокое давление и сделайте снимок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочее расстояние (WD) между линзой и образцом составляет 5,9 мм, ускоряющее напряжение — 2,0 кВ, а увеличение (Mag) — 100 000x при использовании детектора SignalA. Частицы диспергированы с неравномерной кристаллизацией, и примерно 80% имеют диаметр 1-5 мкм (рис. 1А).
- Приготовьте стерильную суспензию CSD в концентрации 20 мг/мл. Разбавьте CSD стерильным физиологическим раствором и смешайте с помощью ультразвукового шейкера (40 кГц, 80 Вт) при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут.
- Тщательно перемешайте и перемешайте суспензию CSD на вихревом смесителе в течение 10 с, прежде чем вводить назальные капельницы.
3. Капельница из носа мыши
- Быстро обезболивайте мышь 2% изофлураном в дозе 3,6 мл/ч в наркозном аппарате (рис. 1B, левая панель).
ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезию следует проводить в вытяжном шкафу, чтобы избежать вдыхания анестетика техником. Обеспечьте достаточную глубину анестезии, наблюдая за переходом от учащенного и нерегулярного дыхания к медленному и устойчивому состоянию у мышей. - Закапать 50 мкл CSD назально в течение 4-8 с (рис. 1B, справа).
- Для капельницы из носа поместите голову мыши на пястно-фаланговый сустав исследователя кончиком указательного пальца.
- Держите мышь в положении лежа, слегка согнув четыре пальца и слегка касаясь кончиком большого пальца нижней губы мыши, чтобы выпрямить дыхательные пути. Избегайте прикосновений к глотке, чтобы вызвать рвотный рефлекс.
- Аспирируйте 50 мкл жидкости с помощью пипетки на 200 мкл. Капните жидкость в носовую полость мыши в три-четыре приема, в зависимости от частоты дыхания мыши. Каждая инстилляция должна состоять из 15-20 мкл жидкости. Ставьте капельницы один раз в 3 дня, 5 раз в течение 12 дней. Обработайте контрольную мышь равным количеством физиологического раствора.
- Нежно помассируйте область сердца мыши 5-10 раз в течение 5 с.
- Придерживайте тело мыши ладонью, большим и указательным пальцами зажимайте кожу на задней части шеи, а остальными пальцами фиксируйте задние конечности мыши. Затем осторожно надавите указательным пальцем другой руки на область сердцебиения мыши 5-10 раз в течение 5 с.
- Когда дыхание мыши стабилизируется, поместите ее в клетку для восстановления с грелкой и наблюдайте, пока она не оправится от анестезии, затем верните мышь в домашнюю клетку. Принесите в жертву мышь на 31 день.
4. Забор легочной ткани и подготовка парафинового среза
- Введите 0,18 мл 10% хлоралгидрата внутрибрюшинно, следя за тем, чтобы мыши не реагировали на стимуляцию пальцев ног или хвоста (выполняемую с помощью зубчатых щипцов). Затем переходите к следующему шагу.
- Зафиксируйте конечности мыши на поролоновой тестовой доске и сбрызните 75% спиртом, чтобы смочить шерсть. Удалите большую часть грудных ребер по средней линии ключицы и откройте грудную полость мышей, чтобы обнажить сердце и легкие.
- Немедленно разрежьте правое предсердие офтальмологическими хирургическими ножницами и медленно введите 20 мл фосфатного буфера (PBS) от кончика сердца в районе левого предсердия с наибольшей амплитудой, чтобы обеспечить поток цельной крови. Затем удалите нижнюю долю правого легкого и храните ее при температуре -80 °C для анализа методом вестерн-блоттинга.
- Продолжайте перфузию 10 мл 4% параформальдегида (PFA) в том же месте после инъекции PBS. Соберите оставшееся легкое и сохраните образец в 30 мл 4% PFA для патологоанатомического анализа.
- Через 72 ч после фиксации образцы закапывают в парафин.
- Обезвоживают ткани с помощью дифференцированных серий разбавлений этанола (EtOH) в деионизированной воде (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) в течение 1 ч каждое при RT. Очищают пробу в двух промывках ксилолом в течение 1 ч каждая.
- Пропитайте образцы расплавленным парафином, нагревая до 50 °С в течение 2 ч. Повторите этот процесс в другом цилиндре. Охладите восковые формы с салфетками в течение 1 ч для застывания.
- После того, как воск затвердеет и ткань будет вклеена, используйте парафиновую машину, чтобы нарезать ткань на 5 мкм. Точные этапы секционирования и монтажа направляющих были описаны ранее11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточная перфузия тканей показана при развитии мышечных подергиваний и скручивания хвоста в форме буквы «S» или сгибании после приема 10 мл 4% PFA.
5. Проведение окрашивания гематоксилином и эозином (ГЭ)
- Нагрейте залитые парафином ткани на горячей плите (60 °C) в течение более 4 часов, чтобы обеспечить адгезию к предметным стеклам и улучшить депарафинизацию.
- Депарафинизация и гидратация парафиновых срезов. Замочите предметные стекла с образцами в ксилоле 2 раза на 30 минут каждый раз. Затем опустите их в безводный этанол, затем 95%, 85%, 75% спирт и деионизированную воду на 5 минут соответственно.
- Выполняют окрашивание гематоксилином и эозином. Окрашивайте ткани в ведро для окрашивания гематоксилином в течение 10 минут. Промойте их слегка проточной водой в течение 5 минут. Затем опустите предметные стекла в ведро для окрашивания эозином на 10 с.
- Обезвоживают образцы в 75%, 85%, 95% и безводном этаноле в течение 5 мин каждый. Очистите участки ткани, погрузив их в ксилол на 5 минут. Запечатайте секцию примерно 60 мкл капель нейтральной смолы. Наденьте крышку на секцию и осторожно опустите ее, чтобы избежать пузырьков воздуха.
6. Выполнение окрашивания по Массону
- Депарафинизируйте и гидратируйте образцы парафина, как указано в шаге 5.2. Затем окрасьте ядра клеток 50% гематоксилином Вейгерта в течение 10 мин. Замочите ткань в кислом этиловом разжижении на 10 с и аккуратно промойте тканевые слайды проточной водой для воронения ядер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте раствор для окрашивания гематоксилином Weigert непосредственно перед использованием. - Образцы окрашивают каплями красного раствора Личунь красный (40 мкл на каждый предметный стеклянный предметной капли) в течение 7 мин и промывают слабым кислотным рабочим раствором (30% соляная кислота) в течение 1 мин для удаления несвязанного красного красителя Личунь.
- Опустите их в 95% спирт на 20 с и обезвоживайте 2 раза безводным этанолом в течение 1-3 секунд каждый. После этого очистите ткани ксилолом и запечатайте их 60 мкл капель нейтральной смолы, как указано в шаге 5.4.
7. Выполнение окрашивания Сириуса в красный цвет
- Удалите парафин и гидратируйте парафиновые срезы, как указано в шаге 5.2.
- Пропитайте срезы в течение 1 ч красящим раствором Sirius red.
- Окрашивают ядра клеток образцов в течение 8-10 мин раствором для окрашивания гематоксилином по Майеру. Аккуратно промойте их проточной водой в течение 10 минут. Затем обезвоживайте и очищайте тканевые предметные стекла. Запечатайте их, как указано в шаге 5.4.
8. Проведение иммуногистохимии
- Депарафинизируйте и гидратируйте образцы парафина, как описано в шаге 5.2.
- Инфильтрируйте образцы раствором для извлечения антигена ЭДТА в концентрации 3 мг/мл около 30 мл. Кипятить 20-30 мин. Промывают ткани деионизированной водой, а затем инкубируют их в фосфатно-буферном растворе, содержащем 0,5% Tween-20 (PBST), в течение 5 мин.
- Замочить образцы на 15 мин 0,3% раствором перекиси водорода для инактивации эндогенной пероксидазы в образцах. Мойте их 3 раза PBST в течение 5 минут каждый раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: 0,3% раствор перекиси водорода должен быть свежим в светонепроницаемой среде. - Пермеабилизацию мембраны образцов в течение 15 мин 0,3% раствором Тритона-100. Затем блокируют 30-40 мкл 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч.
- Удалите блокирующий раствор. Добавьте разбавленные первичные антитела NF-κB (разведение 1:200) и CD68 (разведение 1:1000) и инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 2-8 °C во влажной коробке для микроскопа с предметным стеклом ИГХ, чтобы предотвратить испарение и свет.
- На следующий день перенесите их в RT на 1 час. Затем вымойте их PBST 3 раза по 5 минут каждый.
- Инкубируют образцы в течение 1 ч во вторичных антителах, меченных пероксидазой хрена кроликов (соотношение разведения 1:500) при РТ и промывают их PBST 3x по 5 мин каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как первичные, так и вторичные антитела были разбавлены 5% БСА. - Инкубируют образцы с субстратом 3,3'-диаминобензидина (DAB), соответствующим меченному ферментом антителу, в течение 5-20 мин. Остановите реакцию деионизированной водой, когда будет достигнута оптимальная интенсивность окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор DAB должен быть приготовлен свежим и защищен от света. Реакцию развития цвета следует наблюдать в режиме реального времени под микроскопом, чтобы определить, когда следует прекратить окрашивание. Положительные образцы демонстрируют интенсивное окрашивание, в то время как отрицательные образцы не развивают цвет. - Контрокрашивают образцы в течение 30 с гематоксилином Вейгерта. Далее промойте ткани под проточной водой в течение 1 мин. Затем обезвоживайте, очищайте и герметизируйте предметные стекла, как указано в шаге 5.4.
9. Проведение вестерн-блоттинг-анализа
- Лизируйте ткани легких для извлечения белков. К 20 мг легочной ткани добавляют 200 мкл рабочего раствора РИПА.
- Гомогенизируйте ткань на льду в течение 5 минут с помощью ручной электрической кофемолки и инкубируйте в течение 1 часа на льду при легком встряхивании. После этого гомогенат центрифугируют при 4 °C в течение 15 мин при 14 800 x g.
- Соберите надосадочную жидкость и определите концентрацию белка с помощью набора для анализа белка BCA. Приготовьте раствор для хранения белка с RIPA в концентрации белка 6 мкг/мкл. Добавьте 20 мкл 5-кратного загрузочного буфера к 80 мкл лизата белка. Нарушить структуру вторичного белка путем нагревания белоксодержащих пробирок микроцентрифуг в металлической ванне (100 °C) в течение 20 мин.
- После охлаждения в каждую пробирку наливают 100 мкл раствора для хранения белка и хранят образцы в холодильнике при температуре -80 °C. Перед электрофорезом разбавляют концентрацию белка до 2–3 мкг/мкл 1-кратным загрузочным буфером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс экстракции белка должен выполняться на льду. Для рабочего раствора RIPA добавьте 1 мкл 100 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) к 99 мкл RIPA, чтобы ингибировать деградацию фосфорилированного белка. Приготовьте 1-кратный загрузочный буфер, разбавив 5-кратный загрузочный буфер RIPA в соотношении 1:4. - Добавьте по 20 мкг образцов в каждую лунку и запустите гель. Для 5% концентрированных гелей используйте 80 В в течение 20 минут, чтобы белки электрофорезировались с той же начальной точки. Для 10%-ных изолированных гелей запускают при 100 В в течение 1 ч, чтобы обеспечить максимальное разделение белков с разной молекулярной массой.
- Предварительно активируйте мембрану ПВДФ метанолом в течение 20 с. Перенос белков на мембрану ПВДФ методом мокрого переноса током 400 мА в течение 1-2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что резервуар для электрофореза и резервуар для электропереноса находятся горизонтально. Охладите весь резервуар льдом, так как в процессе мембранного переноса выделяется много тепла. - Промывайте мембрану раствором TBST в течение 5 мин каждый раз, 5 раз. Затем перемешайте с 5% БСА или 5% обезжиренным молоком в течение 1 часа. Первичные антитела NF-κB (1:1000) и β-актин (1:1000) разбавляют 5% БСА. Погрузите полоски в раствор антител и осторожно встряхните их в течение ночи при температуре 2-8 °C.
- Вымойте полоски с помощью ПБСТ. Затем разбавляют конъюгированные пероксидазой хрена (HRP) козьи вторичные антитела к кроликам (1:10 000) и инкубируют их в разбавленном вторичном антителе в течение 1 ч при РТ при легком встряхивании.
- Приготовьте проявитель усиленной хемилюминесценции (ECL), капните его на полоску и инкубируйте в течение 3 минут.
- Экспонируйте полоску на гелевом тепловизоре в течение 20 секунд. Измерьте значение серого полоски, чтобы оценить уровень белка с помощью системного программного обеспечения. Используйте β-актин в качестве средства внутреннего контроля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью предложенного метода исследован потенциальный патогенез силикоза у мышей. Мы обнаружили, что масса тела мышей в опытной группе значительно снизилась по сравнению с контрольной группой, и что масса тела медленно восстанавливалась после прекращения воздействия. Благодаря оптимизированной дозе, использованной здесь, смертности у мышей, подвергшихся воздействию диоксида кремния, в этом эксперименте не наблюдалось. Техническая дорожная карта повторного затекания из носа в БКД приведена на рисунке 1. Ранее описанные процедуры включали приготовление суспензии CSD, анестезию, индуцированную изофлураном, капельницу из носа и грудной массаж12. Мы продемонстрировали отложение коллагена и дифференцировку миофибробластов после 4 недель статического кормления12. Мы использовали этот метод воздействия пыли для изучения основного механизма легочного фиброза, вызванного угольной пылью. Новые субпопуляции макрофагов и эффект вмешательства витамина D были обнаружены с помощью технологии одноклеточной транскриптомной технологии13. В данном исследовании прогрессирование фиброза легких у мышей значительно ускорялось при воздействии БЦД, который вызывал повреждение периферических эластических волокон бронхов (рис. 2 и рис. 3). Узелки силикоза состоят из макрофагов, которые содержат CSD. Фиброзный узелок обогащен многими БСД, и CD68-позитивные макрофаги активно поглощают эти частицы. Эти депонированные БКЦ способствуют образованию фиброзных очагов. Как упоминалось ранее, после воздействия CSD в течение 4 недель у мышей появились очевидные повреждения, такие как отложение коллагена в кремниевых узелках легких и повреждение структуры легочной ткани. Также наблюдалось умеренное повреждение тканей, окружающих бронхи12. Биологический процесс ER-стресса, вызванного ХСД, связан с NF-κB, который участвует в воспалительной реакции (см. рис. 4). В целом, эти результаты показывают, что предложенный подход может эффективно моделировать развитие силикоза мышей.
Рисунок 1: Частицы кристаллической кварцевой пыли (CSD) размером менее пяти микрон использовались для закапывания в нос. (A) Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) CSD показала, что частицы имеют неправильную форму. (B) Суспензия CSD была использована для приготовления модели силикоза мышей путем назального капельного введения. Аппарат слева используется для анестезии изофлураном, а на правой панели обозначены ключевые моменты, которые приводят к работе назального капельного раствора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Красное окрашивание Sirius показало фиброз в легких мышей с помощью назальной капельницы CSD в течение 1 месяца. (A) Красное окрашивание по Сириусу проводилось для измерения отложения коллагена в легочной ткани после лечения КСД или физиологическим раствором (слева вверху и слева внизу в панелях). Поляризационная микроскопия выявила три различных типа коллагеновых волокон (красные, желтые и зеленые), из которых коллагеновые волокна 1-го типа, показанные красным цветом, являются фактором риска развития силикоза. Тем не менее, в группе транспортных средств (верхняя и нижняя панели) не было обнаружено значительного фиброза. (Б) Оценка фиброза (FS) – полуколичественный оценочный индекс на основе окрашивания Sirius red12, который значительно отличается от контроля (***P < 0,0001). Масштабная линейка = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Иммуногистохимическое окрашивание CD68 в легких мышей, получавших CSD, для мониторинга роли макрофагов в формировании силикотического узелка. Типичный кремнеземистый узел характеризуется разжиженным некрозом после фагоцитоза ХСД в центре, окруженном макрофагами на периферии (окрашивание HE). Кроме того, КСД обогащался в узелках, что сопровождалось фиброзом (окрашивание по Массону). Иммуногистохимическое окрашивание CD68 показало, что макрофаги широко представлены в легочной ткани. Кроме того, эти макрофаги проглотили CSD (видимый под микроскопией поляризованного света, правая панель), что вызвало тяжелое повреждение легких. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Экспрессия NF-κB в легких мышей, получавших CSD . (А) Иммуногистохимическое окрашивание легочной ткани. В легких мышей, обработанных CSD, на правом панелях наблюдалось высокое окрашивание NF-κB по сравнению с группой Vehicle слева. Масштабная линейка = 50 мкм. (B) Репрезентативная вестерн-блоттинг показала, что у мышей, получавших CSD, повышенная экспрессия NF-κB в легких. Лизис свежей легочной ткани подвергали вестерн-блоттингу. (C) Разница NF-κB между группами Sil и Veh была значимой (** P < 0,01). Интенсивность полосы была измерена с помощью изображения J. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модели силикоза на мышах имеют решающее значение для изучения патогенеза и лечения силикоза. В этом протоколе описан метод подготовки модели силикоза у мышей путем многократного назального воздействия. Этот метод позволяет изучать патологические особенности силикоза, индуцированные различным временем воздействия. Мышей обезболивали на аппарате искусственной вентиляции легких и контролировали частоту дыхания. Первоначальная короткая, быстрая частота дыхания постепенно замедлялась и углублялась с течением времени. Анестезия заставляла мышцы мышей расслабляться, что приводило к глубокому дыханию и позволяло им вдыхать CSD во время медленного, глубокого дыхания. Во время этого процесса оператор держит нижнюю челюсть мыши большим пальцем и выпрямляет ее шею, чтобы предотвратить попадание жидкости в пищеварительный тракт — метод вдыхаемого воздействия пыли, который не вызывает боли и является неинвазивным. Этот метод может удовлетворить индивидуальные потребности многократного применения для изучения воздействия пыли. Kato et al. в 2017 г. использовали однократную большую дозу (125 мг/мл, 40 мкл) через орофарингеальную капельницу для моделирования фиброза легких, и мы ссылаемся на эту концентрацию, чтобы попытаться изучить легочные изменения, индуцированные множественными малыми дозами через носовую полость14.
Существует несколько проблем, связанных с затеканиями из носа после анестезии с технической точки зрения. Во время этого процесса оператор держит нижнюю челюсть мыши большим пальцем, чтобы выпрямить ее шею и предотвратить попадание жидкости в пищеварительный тракт. Если мыши не достигают глубокой анестезии или оператор не обладает достаточной квалификацией и пропускает временное окно для медленного глубокого дыхания, эффект от назального затекания и патологические характеристики модели будут не такими, как ожидалось. Поэтому, чтобы избежать смерти от чрезмерной анестезии и неудачного моделирования под недостаточным наркозом, те, кто работает с мышами, анестезированными изофлураном, должны быть надлежащим образом обучены и овладеть критическими характеристиками мышей, анестезированных изофлураном, прежде чем выполнять назальную капельницу. Более того, надавливание на грудную клетку мышей после капельницы из носа, обычно называемое массированием, способствует перемещению БСД к конечным бронхам и даже альвеолярным стенкам легких. Мыши, обезболивавшиеся до глубокого уровня, были склонны к удушью, когда получали высокую дозу капельниц из носа. Однако, если их грудная клетка была быстро сдавлена, выживаемость увеличивалась. И последнее, но не менее важное: для создания моделей силикоза необходимы мыши с прочной физической основой, и некоторые исследования показали, что мыши старше 10-12 недель имеют плохую переносимость и повышенный уровень смертности после повторного воздействия БСД. Несмотря на свои достоинства, данная модель имеет ряд недостатков. Одним из недостатков является то, что мышь не вдыхает частицы пыли напрямую через воздушный поток. Для решения этой проблемы мы ограничили количество суспензии CSD, вдыхаемой на одном дыхании, и частоту повторного введения CSD. Кроме того, мы создали группы транспортных средств. Данные показывают, что вдыхание небольшого количества жидкости лишь временно нарушает вентиляцию, что не повреждает легкие мышей12. Мыши, управляющие транспортным средством, быстро поглощают вдыхаемую физиологическую жидкость, не влияя на функцию легких, массу тела или базальную активность мышей. Напротив, повторное воздействие БКК через нос при вдыхании может создать желаемую динамическую модель силикоза у мышей12. Поскольку различные частоты воздействия влияют на процесс фиброза в моделях с повторными воздействиями, у нас нет четкой временной точки. Как правило, при однократном воздействии кварцевой пыли на 7 день находится еще на ранних стадиях силикоз. 7-14 сутки соответствуют стадии воспалительной активности, 14-28 дни соответствуют стадии трансформации фиброза, а время после 28 суток соответствует стадии формирования фиброза12,15. Однако патология в эти моменты времени может варьироваться в зависимости от дозы.
Назальный капельный метод имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными эндотрахеальными капельницами или хирургически открытой трахеостомией16,17, такими как уменьшение инфекций, связанных с трахеотомией, и послеоперационный уход. Такой подход также может удовлетворить потребность в повторном воздействии КСД в течение одного эксперимента и не требует дорогостоящего оборудования. Кроме того, метод назального капельного орошения является более реалистичным представлением воздействия пыли, поскольку мелкие частицы попадают в легкие из верхних дыхательных путей и перемещаются к концевым бронхиолам и альвеолам. Поскольку мы используем несколько небольших доз капельниц кремнезема, доза кремнеземной пыли может максимально проникать в легкие и непрерывно стимулировать организм. Таким образом, данный подход к моделированию разработан для моделирования повторяющегося воздействия КС на сотрудников в их рабочей среде и изучения патологического процесса силикоза.
Создание мышиных моделей силикоза с помощью назального воздействия CSD может быть применено к повторным экспозициям. Таким образом, данная животная модель может быть использована для изучения влияния частоты и дозирования экспозиции на прогрессирование силикоза, а также динамических патологических особенностей и механизмов силикоза. Более того, комбинированное воздействие с другими веществами или лекарствами также вполне осуществимо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Инновационной программой университетской синергии провинции Аньхой (GXXT-2021-077) и Инновационным фондом выпускников Аньхойского университета науки и технологий (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
- The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W.
- Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
- Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
- Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
- Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).
- Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
- Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).
- Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).
- Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).
