Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Etablierung eines Mausmodells der Silikose durch wiederholte Exposition gegenüber Kieselsäuresuspensionen über einen Nasentropf. Dieses Modell kann den pathologischen Prozess der menschlichen Silikose effizient, bequem und flexibel mit hoher Wiederholbarkeit und Wirtschaftlichkeit nachahmen.
Abstract
Silikose kann durch die Exposition gegenüber respiratorischem kristallinem Quarzstaub (CSD) in einer industriellen Umgebung verursacht werden. Die Pathophysiologie, das Screening und die Behandlung von Silikose beim Menschen wurden alle ausführlich mit dem Maus-Silikose-Modell untersucht. Indem sie Mäuse wiederholt dazu bringen, CSD in ihre Lunge einzuatmen, können die Mäuse die klinischen Symptome der menschlichen Silikose nachahmen. Diese Methode ist praktisch und effizient in Bezug auf Zeit und Leistung und verursacht keine mechanischen Verletzungen der oberen Atemwege durch Operationen. Darüber hinaus kann dieses Modell den akuten/chronischen Transformationsprozess der Silikose erfolgreich nachahmen. Die wichtigsten Verfahren waren folgende: Das sterilisierte 1-5 μm CSD-Pulver wurde vollständig gemahlen, in Kochsalzlösung suspendiert und 30 min lang in einem Ultraschall-Wasserbad dispergiert. Mäuse unter Isofluran-induzierter Anästhesie wechselten für ca. 2 s von einer flachen, schnellen Atmung zu einer tiefen, langsamen Aspiration. Die Maus wurde in eine Handfläche gelegt, und die Daumenspitze berührte sanft den Lippenrand des Kiefers der Maus, um die Atemwege zu begradigen. Nach jedem Ausatmen atmeten die Mäuse die Kieselsäuresuspension tropfenweise durch ein Nasenloch ein und schlossen den Vorgang innerhalb von 4-8 s ab. Nachdem sich die Atmung der Mäuse stabilisiert hatte, wurde ihre Brust gestreichelt und gestreichelt, um zu verhindern, dass der eingeatmete CSD ausgehustet wird. Die Mäuse wurden dann in den Käfig zurückgebracht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell CSD entlang der typischen physiologischen Passage winziger Partikel in die Lunge von den oberen Atemwegen zu den terminalen Bronchiolen und Alveolen quantifizieren kann. Es kann auch die wiederkehrende Exposition von Mitarbeitern aufgrund der Arbeit replizieren. Das Modell kann von einer Person durchgeführt werden und benötigt keine teure Ausrüstung. Es simuliert bequem und effektiv die Krankheitsmerkmale der menschlichen Silikose mit hoher Wiederholbarkeit.
Introduction
Arbeiter sind unweigerlich unregelmäßigem kristallinem Quarzstaub (CSD) ausgesetzt, der eingeatmet werden kann und in zahlreichen beruflichen Kontexten giftiger ist, darunter Bergbau, Töpferei, Glas, Quarzverarbeitung und Beton 1,2. Eine chronische Staubinhalation, die als Silikose bekannt ist, verursacht eine fortschreitende Lungenfibrose3. Epidemiologischen Daten zufolge ist die Inzidenz von Silikose in den letzten Jahrzehnten weltweit zurückgegangen, aber in den letzten Jahren hat sie zugenommen und betrifft jüngere Menschen 4,5,6. Der zugrundeliegende Mechanismus der Silikose stellt aufgrund ihres schleichenden Beginns und der langen Inkubationszeit eine große Herausforderung für die wissenschaftliche Forschung dar. Es ist noch nicht bekannt, wie sich die Silikose entwickelt. Darüber hinaus gibt es derzeit keine Medikamente, die das Fortschreiten der Silikose und der umgekehrten Lungenfibrose aufhalten können.
Die aktuellen Mausmodelle für Silikose beinhalten die tracheale Einnahme einer gemischten CSD-Suspension. Zum Beispiel entspricht die Verabreichung von CSD in die Lunge durch Übernahme des zervikalen Luftröhrentraumas nach der Anästhesie nicht der wiederholten Exposition des Menschen gegenüber Farbstoffstaub7. Die Auswirkungen der Exposition gegenüber Umgebungsstaub auf den Menschen können untersucht werden, indem sie CSD in Form von Aerosolen ausgesetzt werden, die die Umweltkonzentrationen dieser giftigen Substanz genauer widerspiegeln8. Aufgrund der einzigartigen physiologischen Struktur der Mausnase kann CSD jedoch nicht einfach direkt in die Lunge eingeatmet werden9. Darüber hinaus ist die mit dieser Technologie verbundene Ausrüstung teuer, was die Forscher dazu veranlasst hat, das Maus-Silikose-Modell10 neu zu bewerten. Durch fünfmaliges Einatmen der CSD-Suspension durch einen Nasentropf innerhalb von 2 Wochen war es möglich, ein dynamisches Modell der Silikose zu erstellen. Dieses Modell ist konsistent und sicher und gleichzeitig einfach zu bedienen. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Studie eine wiederholte Inhalation von CSD bei Mäusen ermöglicht. Es wird erwartet, dass das durch dieses Verfahren erstellte Maus-Silikose-Modell für Forschungsanforderungen vorteilhafter ist.
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Protocol
Alle Verfahren folgten den Richtlinien des National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH-Veröffentlichung Nr. 8023, überarbeitet 1978) und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Medizinischen Fakultät der Anhui University of Science and Technology genehmigt.
1. Mäuse managen und füttern
- Ordnen Sie 20 gesunde männliche C57BL/6-Mäuse in einem Verhältnis von 1:1 der Versuchs- oder Vehikelgruppe zu. Akklimatisieren Sie die Mäuse 1 Woche lang an die neue Umgebung.
- Sorgen Sie für eine konstante Lichtzeit von 12 h pro Tag. Verwenden Sie einen Zeitschalter für präzises Timing.
2. Vorbereitung der CSD-Aussetzung
- Mindestens 1 Tag vor dem Nasentropfen die Kieselsäure 0,5 h lang in einem Achatmörser mahlen.
- Beobachten Sie die Größe und Form der Kristallpartikel. Machen Sie repräsentative Fotos mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM).
- Verwenden Sie leitfähiges Klebeband, um die Partikel zu binden, um die Probe für das REM vorzubereiten. Verwenden Sie einen Föhn, um die Silikonpartikel, die nicht fest gebunden sind, vorsichtig wegzublasen.
- Evakuieren Sie die Probenkammer, schalten Sie den Hochdruck ein und nehmen Sie das Bild auf.
HINWEIS: Der Arbeitsabstand (WD) zwischen dem Objektiv und der Probe beträgt 5,9 mm, die Beschleunigungsspannung beträgt 2,0 kV und die Vergrößerung (Mag) beträgt 100.000x bei Verwendung des SignalA-Detektors. Die Partikel werden mit unregelmäßiger Kristallisation dispergiert und haben zu etwa 80 % einen Durchmesser von 1-5 μm (Abbildung 1A).
- Stellen Sie eine 20 mg/ml sterile CSD-Suspension her. Verdünnen Sie den CSD mit steriler Kochsalzlösung und mischen Sie ihn mit einem Ultraschallschüttler (40 kHz, 80 W) bei Raumtemperatur (RT) für 30 min.
- Rühren und mischen Sie die CSD-Suspension 10 s lang gründlich auf einem Vortex-Mischer, bevor Sie die Nasentropfen verabreichen.
3. Verabreichung von Nasentropfen an Mäuse
- Schnelles Anästhesieren einer Maus mit 2 % Isofluran in einer Dosis von 3,6 ml/h in einem Anästhesiegerät (Abbildung 1B, linkes Bild).
HINWEIS: Die Anästhesie sollte in einem Abzug durchgeführt werden, um ein Einatmen des Anästhetikums durch den Techniker zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die angemessene Tiefe der Anästhesie erreicht wird, indem Sie den Wechsel von schneller und unregelmäßiger Atmung zu einem langsamen und stetigen Zustand bei den Mäusen beobachten. - Tropfen Sie 50 μl des CSD nasal innerhalb von 4-8 s (Abbildung 1B, rechts).
- Für den Nasentropf legen Sie den Kopf der Maus mit der Spitze des Zeigefingers auf das Metakarpophalangealgelenk des Forschers.
- Halten Sie die Maus in Bauchlage, wobei vier Finger leicht gebeugt sind und die Daumenspitze leicht die Unterlippe der Maus berührt, um die Atemwege zu begradigen. Vermeiden Sie es, den Rachen zu berühren, um den Würgereflex auszulösen.
- 50 μl Flüssigkeit mit einer 200 μl Pipette absaugen. Träufeln Sie die Flüssigkeit in drei bis vier geteilten Dosen in die Nasenhöhle der Maus, abhängig von der Atemfrequenz der Maus. Jede Instillation sollte aus 15 bis 20 μl Flüssigkeit bestehen. Verabreichen Sie die Infusionen einmal alle 3 Tage, 5x innerhalb von 12 Tagen. Behandeln Sie die Steuermaus mit der gleichen Menge Kochsalzlösung.
- Massieren Sie den Herzbereich der Maus 5x-10x 5 s lang sanft ein.
- Halten Sie den Körper der Maus mit der Handfläche fest, kneifen Sie mit Daumen und Zeigefinger in die Haut im Nacken und fixieren Sie mit den anderen Fingern die Hinterbeine der Maus. Drücken Sie dann mit dem Zeigefinger der anderen Hand 5-10 Mal in einem Zeitraum von 5 s sanft auf den Herzschlagbereich der Maus.
- Wenn sich die Atmung der Maus stabilisiert hat, setzen Sie sie in einen Erholungskäfig mit einem Heizkissen und beobachten Sie, bis sie sich von der Narkose erholt, und bringen Sie die Maus dann in ihren Heimatkäfig zurück. Opfern Sie die Maus nach 31 Tagen.
4. Entnahme des Lungengewebes und Anfertigung eines Paraffinschnitts
- Injizieren Sie 0,18 ml 10%iges Chloralhydrat intraperitoneal und stellen Sie sicher, dass die Mäuse nicht auf die Zehen- oder Schwanzstimulation (mit der Zahnzange) reagieren. Fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort.
- Befestigen Sie die Gliedmaßen der Maus auf einem Schaumstoff-Testbrett und besprühen Sie das Fell mit 75%igem Alkohol. Entfernen Sie den größten Teil der Brustrippen an der Mittellinie des Schlüsselbeins und öffnen Sie die Brusthöhle der Mäuse, um Herz und Lunge freizulegen.
- Schneiden Sie sofort den rechten Vorhof mit einer ophthalmologischen chirurgischen Schere auf und injizieren Sie langsam 20 ml Phosphatpuffer (PBS) aus der Herzspitze am linken Vorhofschlag mit der größten Amplitude, damit das ganze Blut fließen kann. Als nächstes entfernen Sie den unteren Lungenlappen der rechten Lunge und lagern ihn bei -80 °C für die Western-Blotting-Analyse.
- Nach der PBS-Injektion 10 ml 4%iges Paraformaldehyd (PFA) an derselben Stelle perfundieren. Entnehmen Sie die verbleibende Lunge und bewahren Sie die Probe in 30 ml 4% PFA für die pathologische Analyse auf.
- Nach 72 h Fixierung werden die Proben in Paraffin eingebettet.
- Dehydrieren Sie das Gewebe durch eine abgestufte Reihe von Ethanol (EtOH)-Verdünnungen in deionisiertem Wasser (60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %) für jeweils 1 Stunde bei RT. Reinigen Sie die Probe in zwei Wäschen von Xylol für jeweils 1 Stunde.
- Infiltrieren Sie die Proben mit dem geschmolzenen Paraffinwachs, indem Sie es 2 h lang auf 50 °C erhitzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang in einem anderen Zylinder. Kühlen Sie die Wachsformen mit Tüchern 1 h lang zum Aushärten ab.
- Nachdem das Wachs ausgehärtet und das Gewebe eingebettet wurde, wird das Gewebe mit einer Paraffinschneidemaschine bei 5 μm geschnitten. Die genauen Schritte zum Schneiden und Montieren des Schlittens wurden bereitsbeschrieben 11.
HINWEIS: Eine ausreichende Gewebedurchblutung wird angezeigt, wenn sich nach Erhalt von 10 ml 4% PFA Muskelzuckungen und Schwanzdrehungen in eine "S"-Form oder Beugung entwickeln.
5. Durchführung der Hämatoxylin- und Eosinfärbung (HE)
- Erhitzen Sie das in Paraffin eingebettete Gewebe auf einer heißen Platte (60 °C) für mehr als 4 Stunden, um eine Haftung auf den Objektträgern und eine verbesserte Entparaffinierung zu ermöglichen.
- Paraffinabschnitte entwachsen und hydratisieren. Tränken Sie die Objektträger mit Proben in Xylol 2x für jeweils 30 min. Als nächstes tauchen Sie sie 5 Minuten lang in wasserfreies Ethanol, dann in 95 %, 85 %, 75 % Alkohol und deionisiertes Wasser.
- Führen Sie eine Hämatoxylin- und Eosinfärbung durch. Färben Sie das Gewebe 10 Minuten lang in einem Hämatoxylin-Färbeeimer. Spülen Sie sie 5 Minuten lang mit leicht fließendem Wasser ab. Tauchen Sie die Objektträger dann für 10 s in den Eosin-Färbeeimer.
- Dehydrieren Sie die Proben in 75 %, 85 %, 95 % und wasserfreiem Ethanol für jeweils 5 Minuten. Reinigen Sie die Gewebeschnitte, indem Sie sie 5 Minuten lang in Xylol tauchen. Versiegeln Sie den Abschnitt mit ca. 60 μl Neutralharztropfen. Legen Sie den Abdeckschieber über den Abschnitt und senken Sie ihn vorsichtig ab, um Luftblasen zu vermeiden.
6. Durchführung der Masson-Färbung
- Entwachsen und hydratisieren Sie die Paraffinproben, wie in Schritt 5.2 beschrieben. Anschließend färben Sie die Zellkerne 10 Minuten lang mit 50%igem Weigert-Hämatoxylin. Weichen Sie das Gewebe 10 s lang in saurer Ethanolverflüssigung ein und spülen Sie die Gewebeobjektträger vorsichtig mit fließendem Wasser ab, um die Kerne zu bläuen.
HINWEIS: Bereiten Sie die Hämatoxylin-Färbelösung von Weigert unmittelbar vor der Anwendung vor. - Die Proben werden 7 Minuten lang mit Tropfen Lichunrot-Färbelösung (40 μl für jeden Objektträger) gefärbt und 1 Minute lang mit einer schwach sauren Arbeitslösung (30%ige Salzsäure) gewaschen, um den ungebundenen Lichunrot-Farbstoff zu entfernen.
- Tauchen Sie sie für 20 s in 95%igen Alkohol und dehydrieren Sie sie 2x mit wasserfreiem Ethanol für jeweils 1-3 s. Danach reinigen Sie das Gewebe mit Xylol und versiegeln Sie es mit 60 μl neutralen Harztropfen, wie in Schritt 5.4 beschrieben.
7. Durchführung der Sirius-Rot-Färbung
- Entwachsen und hydratisieren Sie Paraffinabschnitte wie in Schritt 5.2 beschrieben.
- Infiltrieren Sie die Schnitte für 1 Stunde mit Sirius-Rot-Färbelösung.
- Färben Sie die Zellkerne der Proben für 8-10 min mit Mayer-Hämatoxylin-Färbelösung. Spülen Sie sie 10 Minuten lang vorsichtig mit fließendem Wasser ab. Dehydrieren und reinigen Sie dann die Gewebeobjektträger. Versiegeln Sie sie wie in Schritt 5.4 beschrieben.
8. Durchführung der Immunhistochemie
- Entwachsen und hydratisieren Sie die Paraffinproben wie in Schritt 5.2 beschrieben.
- Infiltrieren Sie die Proben mit einer 3 mg/ml EDTA-Antigen-Entnahmelösung von etwa 30 ml. 20-30 Min. kochen lassen. Waschen Sie das Gewebe mit deionisiertem Wasser und inkubieren Sie es dann 5 Minuten lang in phosphatgepufferter Lösung mit 0,5 % Tween-20 (PBST).
- Tränken Sie die Proben 15 Minuten lang mit 0,3%iger Wasserstoffperoxidlösung, um die endogene Peroxidase in den Proben zu inaktivieren. Waschen Sie sie 3x mit PBST für jeweils 5 min.
HINWEIS: Die 0,3%ige Wasserstoffperoxidlösung muss in einer lichtdichten Umgebung frisch zubereitet werden. - Permeabilisieren Sie die Membran der Proben für 15 Minuten mit 0,3%iger Triton-100-Lösung. Anschließend mit 30-40 μl 5%igem Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h blockieren.
- Entfernen Sie die blockierende Lösung. Die verdünnten Primärantikörper NF-κB (Verdünnung 1:200) und CD68 (Verdünnung 1:1.000) werden zugegeben und die Proben über Nacht bei 2-8 °C in einer IHC-Nassbox für Objektträger inkubiert, um Verdunstung und Licht zu vermeiden.
- Übertragen Sie sie am nächsten Tag für 1 Stunde auf RT. Waschen Sie sie dann 3x mit PBST für jeweils 5 min.
- Die Proben werden für 1 h in Kaninchen-Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase-markierten Sekundärantikörpern (Verdünnungsverhältnis 1:500) bei RT inkubiert und 3x für jeweils 5 min mit PBST gewaschen.
HINWEIS: Sowohl die primären als auch die sekundären Antikörper wurden mit 5% BSA verdünnt. - Die Proben werden mit dem 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Substrat, das dem enzymmarkierten Antikörper entspricht, für 5-20 Minuten inkubiert. Stoppen Sie die Reaktion mit deionisiertem Wasser, wenn die optimale Färbeintensität erreicht ist.
HINWEIS: Die DAB-Lösung muss frisch zubereitet und vor Licht geschützt werden. Die Farbentwicklungsreaktion sollte in Echtzeit unter dem Mikroskop beobachtet werden, um festzustellen, wann die Färbung gestoppt werden muss. Positive Proben weisen eine intensive Färbung auf, während negative Proben keine Farbe entwickeln. - Die Proben 30 s lang mit Weigert-Hämatoxylin gegenfärben. Spülen Sie das Gewebe anschließend 1 Minute lang unter fließendem Wasser ab. Entwässern, reinigen und versiegeln Sie dann die Objektträger, wie in Schritt 5.4 beschrieben.
9. Durchführung der Western-Blotting-Analyse
- Lysieren Sie das Lungengewebe, um Proteine zu extrahieren. 200 μl RIPA-Arbeitslösung zu 20 mg Lungengewebe geben.
- Homogenisieren Sie das Gewebe auf Eis für 5 Minuten mit einem elektrischen Handgrinder und inkubieren Sie es 1 Stunde lang auf Eis mit leichtem Schütteln. Anschließend wird das Homogenat bei 4 °C für 15 min bei 14.800 x g zentrifugiert.
- Sammeln Sie den Überstand und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Protein-Assay-Kit. Stellen Sie die Proteinspeicherlösung mit RIPA bei 6 μg/μl Protein her. Zu den 80 μl des Proteinlysats werden 20 μl 5-facher Ladepuffer hinzugefügt. Die sekundäre Proteinstruktur wird durch Erhitzen der proteinhaltigen Mikrozentrifugenröhrchen in einem Metallbad (100 °C) für 20 min aufgebrochen.
- Nach dem Abkühlen werden 100 μl der Proteinspeicherlösung in jedes Röhrchen aliquotiert und die Proben in einem -80 °C heißen Kühlschrank gelagert. Verdünnen Sie die Proteinkonzentration vor der Elektrophorese auf 2–3 μg/μl mit 1x Ladepuffer.
HINWEIS: Der Proteinextraktionsprozess sollte auf Eis durchgeführt werden. Für die RIPA-Arbeitslösung 1 μl 100 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) zu 99 μl RIPA hinzufügen, um den Abbau phosphorylierter Proteine zu hemmen. Bereiten Sie 1x Ladepuffer vor, indem Sie 5x Ladepuffer mit RIPA im Verhältnis 1:4 verdünnen. - Geben Sie 20 μg Proben in jede Vertiefung und lassen Sie das Gel laufen. Verwenden Sie für konzentrierte Gele mit 5 % 80 V für 20 Minuten, um die Proteine vom gleichen Ausgangspunkt aus elektrophoresieren zu lassen. Bei 10%igen isolierten Gelen 1 h lang bei 100 V laufen, damit die Proteine unterschiedlichen Molekulargewichts so weit wie möglich getrennt werden können.
- Die PVDF-Membran mit Methanol für 20 s voraktivieren. Die Proteine werden im Nasstransferverfahren mit 400 mA Strom für 1-2 h auf die PVDF-Membran übertragen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Elektrophoresetank und der Elektrotransfertank waagerecht sind. Kühlen Sie den gesamten Tank mit Eis, da der Membrantransferprozess viel Wärme erzeugt. - Waschen Sie die Membran 5x jeweils 5 Minuten lang mit TBST-Lösung. Anschließend mit 5 % BSA oder 5 % Magermilch 1 h lang blocken. Verdünnen Sie die Primärantikörper NF-κB (1:1.000) und β-Aktin (1:1.000) mit 5% BSA. Tauchen Sie die Streifen in die Antikörperlösung und schütteln Sie die Streifen vorsichtig über Nacht bei 2-8 °C.
- Waschen Sie die Streifen mit PBST. Als nächstes wird der Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:10.000) verdünnt und im verdünnten Sekundärantikörper 1 h bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert.
- Bereiten Sie einen ECL-Entwickler (Enhanced Chemiluminescence) vor, geben Sie ihn auf den Streifen und inkubieren Sie ihn 3 Minuten lang.
- Belichten Sie den Streifen 20 s lang einem Gel-Imager. Messen Sie den Grauwert des Streifens, um den Proteingehalt mit der Systemsoftware zu beurteilen. Verwenden Sie β-Aktin als interne Kontrolle.
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Representative Results
Die potentielle Pathogenese der Silikose in Mäusen wurde mit der vorgeschlagenen Methode untersucht. Wir fanden heraus, dass das Körpergewicht der Mäuse in der Versuchsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant abnahm und dass sich das Körpergewicht nach Beendigung der Exposition langsam erholte. Aufgrund der hier verwendeten optimierten Dosis wurde in diesem Experiment keine Mortalität bei Kieselsäure-exponierten Mäusen beobachtet. Die technische Roadmap von wiederholtem Nasentropf zu CSD ist in (Abbildung 1) dargestellt. Zu den zuvor beschriebenen Verfahren gehörten die CSD-Suspensionsvorbereitung, die Isofluran-induzierte Anästhesie, der Nasentropf und die Thoraxmassage12. Wir zeigten Kollagenablagerung und Myofibroblastendifferenzierung nach 4-wöchiger statischer Fütterung12. Wir haben diese Staubbelastungsmethode verwendet, um den zugrundeliegenden Mechanismus der durch Kohlenstaub verursachten Lungenfibrose zu untersuchen. Die neuen Untergruppen der Makrophagen und die Interventionswirkung von Vitamin D wurden durch die Einzelzell-Transkriptom-Technologie gefunden13. In dieser Studie wurde das Fortschreiten der Lungenfibrose bei Mäusen durch die Exposition gegenüber CSD signifikant beschleunigt, was zu einer Schädigung der peripheren elastischen Fasern der Bronchien führte (Abbildung 2 und Abbildung 3). Silikose-Knötchen bestehen aus Makrophagen, die CSD enthalten. Die Fibrose knotig ist mit vielen CSDs angereichert, und CD68-positive Makrophagen verschlingen diese Partikel aktiv. Diese abgelagerten CSDs fördern die Bildung von fibrösen Herden. Wie bereits erwähnt, erhielten die Mäuse nach einer 4-wöchigen CSD-Exposition offensichtliche Läsionen, wie z. B. Kollagenablagerungen in Silizium-Lungenknötchen und Schäden an der Lungengewebestruktur. Es gab auch eine leichte Verletzung des Gewebes, das die Bronchien umgibt,12. Der biologische Prozess des ER-Stresses, der durch CSD verursacht wird, hängt mit NF-κB zusammen, das an der Entzündungsreaktion beteiligt ist (siehe Abbildung 4). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass der vorgeschlagene Ansatz die Entwicklung der Maus-Silikose effektiv simulieren kann.
Abbildung 1: Kristalliner Quarzstaub (CSD)-Partikel unter fünf Mikrometern wurden für den Nasentropf verwendet. (A) Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) von CSD zeigte, dass die Partikel unregelmäßig geformt waren. (B) Die CSD-Suspension wurde verwendet, um das Maus-Silikose-Modell durch Nasentropf herzustellen. Das Gerät auf der linken Seite wird für die Isofluran-Anästhesie verwendet, und die rechte Tafel umreißt die wichtigsten Punkte, die dazu führen, dass der Nasentropf funktioniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Sirius-Rot-Färbung zeigte eine Fibrose in der Mauslunge durch Nasentropf-CSD für 1 Monat. (A) Die Sirius-Rot-Färbung wurde durchgeführt, um die Kollagenablagerung im Lungengewebe nach einer CSD- oder Kochsalzbehandlung zu messen (links oben und links unten in den Scheiben). Die Polarisationsmikroskopie ergab drei verschiedene Arten von Kollagenfasern (rot, gelb und grün), von denen die rot dargestellten Kollagenfasern vom Typ 1 ein Risikofaktor für Silikose sind. Es wurde jedoch keine signifikante Fibrose in der Vehikelgruppe (rechte und untere Panels) gefunden. (B) Der Fibrose-Score (FS) ist ein semi-quantitativer Bewertungsindex, der auf der Sirius-Rot-Färbung12 basiert und sich signifikant von der Kontrolle unterscheidet (***P < 0,0001). Maßstabsleiste = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Immunhistochemische Färbung von CD68 in einer CSD-behandelten Mauslunge zur Überwachung der Rolle von Makrophagen bei der Bildung eines silikotischen Knotens. Ein typisches Kieselsäure-Knötchen ist gekennzeichnet durch eine verflüssigte Nekrose nach Phagozytose von CSD im Zentrum, umgeben von Makrophagen in der Peripherie (HE-Färbung). Darüber hinaus wurde CSD in den Knötchen angereichert, begleitet von einer Fibrose (Masson-Färbung). Die immunhistochemische Färbung von CD68 zeigte, dass Makrophagen im Lungengewebe weit verbreitet sind. Darüber hinaus hatten diese Makrophagen CSD aufgenommen (zu sehen unter der Polarisationsmikroskopie, rechtes Bild), was zu schweren Lungenschäden führte. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die NF-κB-Expression in der CSD-behandelten Mauslunge . (A) Die immunhistochemische Färbung wurde am Lungengewebe durchgeführt. Die CSD-behandelte Mäuselunge auf der rechten Scheibe zeigte eine hohe NF-κB-Färbung im Vergleich zur Vehikelgruppe auf der linken Scheibe. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Der repräsentative Western Blot zeigte, dass die mit CSD behandelten Mäuse eine erhöhte NF-κB-Expression in der Lunge aufweisen. Die Lyse von frischem Lungengewebe wurde einem Western Blot unterzogen. (C) Der NF-κB-Unterschied zwischen der Sil- und der Veh-Gruppe war signifikant (** P < 0,01). Die Bandenintensität wurde mit Bild J gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Silikose-Mausmodelle sind entscheidend für die Erforschung der Pathogenese und Behandlung der Silikose. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Modells der Silikose bei Mäusen durch wiederholte nasale Exposition. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der pathologischen Merkmale der Silikose, die durch unterschiedliche Expositionszeiten induziert wird. Die Mäuse wurden an einem Beatmungsgerät betäubt und ihre Atemfrequenz wurde überwacht. Die anfängliche kurze, schnelle Atemfrequenz verlangsamte und vertiefte sich mit der Zeit. Die Anästhesie bewirkte, dass sich die Muskeln der Mäuse entspannten, was zu einer tiefen Atmung führte und es ihnen ermöglichte, CSD während eines Zeitfensters langsamer, tiefer Atmung einzuatmen. Während dieses Vorgangs hält der Bediener den Unterkiefer der Maus mit dem Daumen fest und richtet den Hals auf, um zu verhindern, dass die Flüssigkeit in den Verdauungstrakt gelangt, eine Methode der Feinstaubexposition, die keine Schmerzen verursacht und nicht invasiv ist. Diese Methode kann den individuellen Anforderungen einer wiederholten Implementierung zur Untersuchung der Staubbelastung gerecht werden. Kato et al. verwendeten 2017 eine einzelne große Dosis (125 mg/ml, 40 μl) über einen oropharyngealen Tropf, um eine Lungenfibrose zu modellieren, und wir beziehen uns auf diese Konzentration, um zu versuchen, die Lungenveränderungen zu untersuchen, die durch mehrere kleine Dosen durch die Nasenhöhle induziert werden14.
Aus technischer Sicht gibt es mehrere Herausforderungen, die mit Nasentropfen nach der Anästhesie verbunden sind. Während dieses Vorgangs hält der Bediener den Unterkiefer der Maus mit dem Daumen, um den Hals zu strecken und zu verhindern, dass die Flüssigkeit in den Verdauungstrakt gelangt. Wenn die Mäuse keine Tiefenanästhesie erreichen oder der Bediener nicht geübt ist und das Zeitfenster für die langsame, tiefe Atmung verpasst, wird die Wirkung des Nasentropfens und die pathologischen Eigenschaften des Modells nicht wie erwartet sein. Um einen übernarkotisierten Tod und ein unzureichend anästhesiertes Modellierungsversagen zu vermeiden, müssen diejenigen, die mit Isofluran-anästhesierten Mäusen arbeiten, angemessen geschult werden und die kritischen Eigenschaften von Isofluran-anästhesierten Mäusen beherrschen, bevor sie den Nasentropf durchführen. Darüber hinaus fördert das Drücken auf die Brust der Mäuse nach dem Nasentropf, das allgemein als Massage bezeichnet wird, die Reise von CSD zu den terminalen Bronchien und sogar zu den Alveolarwänden der Lunge. Mäuse, die bis zu einem tiefen Niveau betäubt waren, neigten zum Ersticken, wenn sie eine hohe Dosis Nasentropfen erhielten. Wenn der Brustkorb jedoch schnell zusammengedrückt wurde, erhöhte sich die Überlebensrate. Zu guter Letzt erfordert die Erstellung von Silikosemodellen Mäuse mit einer soliden körperlichen Grundlage, und einige Studien haben gezeigt, dass Mäuse, die älter als 10-12 Wochen sind, eine schlechte Verträglichkeit und eine erhöhte Sterblichkeitsrate nach wiederholter Exposition gegenüber CSD aufweisen. Trotz seiner Vorteile hat dieses Modell mehrere Nachteile. Ein Nachteil ist, dass die Maus Staubpartikel nicht direkt über den Luftstrom einatmet. Um dieses Problem anzugehen, haben wir die Menge der CSD-Suspension, die in einem einzigen Atemzug inhaliert wird, und die Häufigkeit der wiederholten Verabreichung von CSD begrenzt. Des Weiteren haben wir Fahrzeuggruppen eingerichtet. Die Daten zeigen, dass das Einatmen einer kleinen Menge Flüssigkeit die Beatmung nur vorübergehend stört, was die Lunge der Mäuse nicht schädigt12. Die Kontrollmäuse des Vehikels nehmen die eingeatmete Kochsalzflüssigkeit schnell auf, ohne die Lungenfunktion, das Körpergewicht oder die Basalaktivität der Mäuse zu beeinträchtigen. Im Gegenteil, eine wiederholte Exposition gegenüber CSD durch Einatmen in die Nase kann das gewünschte dynamische Modell der Silikose bei Mäusen erzeugen12. Da unterschiedliche Expositionsfrequenzen den Fibroseprozess in Modellen mit wiederholter Exposition beeinflussen, haben wir keinen klaren Zeitpunkt. In der Regel befindet sich bei einer einmaligen Exposition mit Quarzstaub Tag 7 noch im Frühstadium der Silikose. Die Tage 7-14 entsprechen dem Stadium der Entzündungsaktivität, die Tage 14-28 dem Stadium der Fibrosetransformation und die Zeit nach dem Tag 28 dem Stadium der Fibrosebildung12,15. Die Pathologie zu diesen Zeitpunkten kann jedoch je nach Dosis variieren.
Die Nasentropfmethode hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen endotrachealen Tropfinfusionen oder chirurgisch exponierten Tracheostomieansätzen16,17, wie z. B. die Reduzierung von tracheotomiebedingten Infektionen und die postoperative Versorgung. Dieser Ansatz kann auch die Anforderung einer wiederholten CSD-Exposition während eines Experiments erfüllen und erfordert keine teure Ausrüstung. Darüber hinaus ist die Nasentropfmethode eine realistischere Darstellung der Staubbelastung, da kleine Partikel aus den oberen Atemwegen in die Lunge gelangen und zu den terminalen Bronchiolen und Alveolen gelangen. Da wir mehrere kleine Dosen von Kieselsäuretropfen verwenden, kann die Quarzstaubdosis maximal in die Lunge gelangen und den Organismus kontinuierlich stimulieren. Daher wird dieser Modellierungsansatz entwickelt, um die wiederkehrende Exposition von Mitarbeitern gegenüber CS in ihrem Arbeitsumfeld zu simulieren und den pathologischen Prozess der Silikose zu untersuchen.
Die Erstellung von Mausmodellen für Silikose durch nasale Exposition gegenüber CSD kann auf wiederholte Expositionen angewendet werden. Daher kann dieses Tiermodell verwendet werden, um die Auswirkungen der Expositionshäufigkeit und -dosierung auf das Fortschreiten der Silikose und die dynamischen pathologischen Merkmale und Mechanismen der Silikose zu untersuchen. Darüber hinaus ist auch eine kombinierte Exposition mit anderen Substanzen oder Medikamenten sehr gut möglich.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom University Synergy Innovation Program der Provinz Anhui (GXXT-2021-077) und dem Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
- The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W.
- Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
- Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
- Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
- Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).
- Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
- Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).
- Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).
- Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).
