Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att etablera en musmodell av silikos genom upprepad exponering för kiseldioxidsuspensioner via ett näsdropp. Denna modell kan effektivt, bekvämt och flexibelt efterlikna den patologiska processen för human silikos med hög repeterbarhet och ekonomi.
Abstract
Silikos kan orsakas av exponering för andningskristallint kvartsdamm (CSD) i en industriell miljö. Patofysiologin, screeningen och behandlingen av silikos hos människor har alla studerats utförligt med hjälp av mussilikosmodellen. Genom att upprepade gånger få möss att andas in CSD i lungorna kan mössen efterlikna de kliniska symtomen på human silikos. Denna metod är praktisk och effektiv när det gäller tid och produktion och orsakar inte mekanisk skada på de övre luftvägarna på grund av operation. Dessutom kan denna modell framgångsrikt efterlikna akut/kronisk transformationsprocess av silikos. De viktigaste förfarandena var följande. Det steriliserade 1-5 μm CSD-pulvret maldes helt, suspenderades i saltlösning och dispergerades i ett ultraljudsvattenbad i 30 minuter. Möss under isofluraninducerad anestesi övergick från ytlig snabb andning till djup, långsam aspiration i cirka 2 sekunder. Musen placerades i en handflata och tumspetsen rörde försiktigt vid läppkanten på musens käke för att räta ut luftvägarna. Efter varje utandning andades mössen in kiseldioxidsuspensionen droppe för droppe genom ena näsborren, vilket slutförde processen inom 4-8 sekunder. Efter att mössens andning hade stabiliserats smektes och smektes deras bröstkorg för att förhindra att den inandade CSD:n hostades upp. Mössen sattes sedan tillbaka i buren. Sammanfattningsvis kan denna modell kvantifiera CSD längs den typiska fysiologiska passagen av små partiklar in i lungan, från de övre luftvägarna till de terminala bronkiolerna och alveolerna. Det kan också replikera den återkommande exponeringen av anställda på grund av arbete. Modellen kan utföras av en person och behöver ingen dyr utrustning. Den simulerar bekvämt och effektivt sjukdomsegenskaperna hos human silikos med hög repeterbarhet.
Introduction
Arbetstagare utsätts oundvikligen för oregelbundet kristallint kvartsdamm (CSD), som kan andas in och är giftigare i många yrkessammanhang, inklusive gruvdrift, keramik, glas, kvartsbearbetning och betong 1,2. Ett kroniskt damminandningstillstånd som kallas silikos orsakar progressiv lungfibros3. Enligt epidemiologiska data har förekomsten av silikos minskat globalt under de senaste decennierna, men under de senaste åren har den ökat och drabbat yngre människor 4,5,6. Den underliggande mekanismen för silikos utgör en betydande utmaning för vetenskaplig forskning på grund av dess smygande debut och utdragna inkubationstid. Det är fortfarande okänt hur silikos utvecklas. Dessutom finns det inga nuvarande mediciner som kan stoppa utvecklingen av silikos och reversera lungfibros.
De nuvarande musmodellerna för silikos involverar trakealt intag av en blandad suspension av CSD. Att till exempel administrera CSD i lungorna genom att anta cervikalt luftstrupstrauma efter anestesi överensstämmer inte med upprepad mänsklig exponering för färgdamm7. Effekterna av exponering för omgivande damm på individer kan studeras genom att utsätta dem för CSD i form av aerosoler, vilket mer exakt återspeglar miljökoncentrationerna av detta giftiga ämne8. Omgivnings-CSD kan dock inte bara andas in direkt i lungorna på grund av den unika fysiologiska strukturen hos musnäsan9. Dessutom är utrustningen som är förknippad med denna teknik dyr, vilket har fått forskare att omvärdera mussilikosmodellen10. Genom att inhalera CSD-suspension genom ett näsdropp fem gånger inom 2 veckor var det möjligt att bygga en dynamisk modell av silikos. Denna modell är konsekvent och säker samtidigt som den är lätt att använda. Det är viktigt att notera att denna studie tillåter upprepad inandning av CSD hos möss. Mussilikosmodellen som skapats genom denna procedur förväntas vara mer fördelaktig för forskningskraven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer följde riktlinjerna i National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publication No. 8023, reviderad 1978) och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Medical School of Anhui University of Science and Technology.
1. Hantera och mata möss
- Tilldela 20 friska C57BL/6-hanmöss till experiment- eller vehikelgrupperna i förhållandet 1:1. Acklimatisera mössen till den nya miljön under 1 vecka.
- Ge en konstant ljustid på 12 timmar per dag. Använd en tidskontrollomkopplare för exakt timing.
2. Förberedelse av avstängning av värdepapperscentralen
- Minst 1 dag före näsdropp, mal kiseldioxiden i en agatmortel i 0,5 timmar.
- Observera kristallpartiklarnas storlek och form. Ta representativa fotografier med svepelektronmikroskopi (SEM).
- Använd ledande tejp för att binda partiklarna för att förbereda provet för SEM. Använd en hårtork för att försiktigt blåsa bort de kiselpartiklar som inte är ordentligt bundna.
- Evakuera provkammaren, slå på högtrycket och ta bilden.
OBS: Arbetsavståndet (WD) mellan linsen och sample är 5.9 mm, accelerationsvolymentage är 2.0 kV och förstoringen (Mag) är 100 000x, med hjälp av SignalA-detektorn. Partiklarna dispergeras med oregelbunden kristallisation och cirka 80 % har en diameter på 1-5 μm (Figur 1A).
- Gör en 20 mg/ml steril CSD-suspension. Späd CSD:n med steril koksaltlösning och blanda den med en ultraljudsshaker (40 kHz, 80 W) vid rumstemperatur (RT) i 30 minuter.
- Rör om och blanda CSD-suspensionen noggrant på en virvelblandare i 10 s innan du administrerar näsdroppen.
3. Administrering av näsdropp till mus
- Bedöva snabbt en mus med 2 % isofluran i en dos på 3,6 ml/h i en anestesimaskin (Figur 1B, vänster panel).
OBS: Anestesi bör utföras i dragskåp för att undvika inandning av bedövningsmedlet av teknikern. Se till att anestesidjupet är tillräckligt djupt genom att observera förändringen från snabb och oregelbunden andning till ett långsamt och jämnt tillstånd hos mössen. - Droppa 50 μL av CSD nasalt inom 4-8 s (Figur 1B, höger).
- För näsdroppet, placera mushuvudet på forskarens metakarpofalangeala led med toppen av pekfingret.
- Håll musen i bukläge, med fyra fingrar lätt böjda och tumspetsen lätt vidrörd vid musens nedre läpp för att räta ut luftvägarna. Undvik att röra vid svalget för att framkalla kräkreflexen.
- Aspirera 50 μl vätska med en 200 μl pipett. Droppa vätskan i musens näshåla i tre till fyra uppdelade doser beroende på musens andningsfrekvens. Varje instillation bör bestå av 15 till 20 μl vätska. Ge droppen en gång var 3:e dag, 5 gånger inom 12 dagar. Behandla kontrollmusen med lika mycket saltlösning.
- Massera försiktigt musens hjärtområde 5x-10x i 5 s.
- Håll musens kropp med handflatan, nyp i huden på baksidan av nacken med tummen och pekfingret och fixera musens bakben med de andra fingrarna. Tryck sedan försiktigt på musens hjärtslagsområde med pekfingret på den andra handen 5-10 gånger under en period av 5 s.
- När musens andning har stabiliserats, placera den i en återhämtningsbur med en värmedyna och observera tills den återhämtar sig från narkosen, för sedan tillbaka musen till sin hembur. Offra musen efter 31 dagar.
4. Samla in lungvävnaderna och förbereda en paraffinsektion
- Injicera 0,18 ml 10 % kloralhydrat intraperitonealt och se till att mössen inte svarar på tå- eller svansstimulering (utförs med tandpincetten). Fortsätt sedan till nästa steg.
- Fäst musens lemmar på en skumtestbräda och spraya med 75 % alkohol för att fukta pälsen. Ta bort de flesta av bröstrevbenen i nyckelbenets mittlinje och öppna mössens brösthåla för att exponera hjärta och lungor.
- Skär omedelbart upp höger förmak med en oftalmisk kirurgisk sax och injicera långsamt 20 ml fosfatbuffert (PBS) från hjärtspetsen vid vänster förmaksslag med största amplitud så att hela blodet kan flöda. Ta sedan bort den nedre loben på höger lunga och förvara den vid -80 °C för western blotting-analys.
- Fortsätt att perfundera 10 ml 4 % paraformaldehyd (PFA) på samma ställe efter PBS-injektionen. Samla upp den återstående lungan och bevara provet i 30 ml 4 % PFA för patologisk analys.
- Efter 72 timmars fixering, bädda in proverna i paraffin.
- Torka vävnaderna genom en graderad serie etanol (EtOH) utspädningar i avjoniserat vatten (60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %) i 1 timme vardera vid RT. Rensa provet i två tvättar xylen i 1 timme vardera.
- Infiltrera proverna med det smälta paraffinvaxet genom upphettning till 50 °C i 2 timmar. Upprepa denna process i en annan cylinder. Kyl vaxformarna med servetter i 1 timme för att härda.
- Efter att vaxet har härdat och vävnaden har bäddats in, använd en paraffinsnittsmaskin för att skära vävnaden vid 5 μm. De exakta sektionerings- och glidmonteringsstegen har tidigare beskrivits11.
OBS: Tillräcklig vävnadsperfusion indikeras genom att utveckla muskelryckningar och svansvridning till en "S"-form eller flexion efter att ha fått 10 ml 4% PFA.
5. Utföra färgning av hematoxylin och eosin (HE)
- Värm paraffinvävnaderna på en värmeplatta (60 °C) i mer än 4 timmar för att möjliggöra vidhäftning till objektglasen och förbättrad avparaffinering.
- Avvaxa och återfukta paraffinsektioner. Blötlägg objektglasen med prover i xylen 2x i 30 minuter varje gång. Doppa dem sedan i vattenfri etanol, sedan 95 %, 85 %, 75 % alkohol och avjoniserat vatten i 5 minuter.
- Utför hematoxylin- och eosinfärgning. Färga vävnaderna i en hematoxylinfärgningshink i 10 min. Skölj dem med försiktigt rinnande vatten i 5 min. Doppa sedan objektglasen i eosinfärgningshinken i 10 s.
- Torka proverna i 75 %, 85 %, 95 % och vattenfri etanol i 5 minuter vardera. Rensa vävnadssnitten genom att doppa dem i xylen i 5 minuter. Försegla sektionen med cirka 60 μL neutrala hartsdroppar. Placera lockets glid över sektionen och sänk den försiktigt för att undvika luftbubblor.
6. Utföra Masson-färgning
- Avvaxa och återfukta paraffinproverna, som nämns i steg 5.2. Färga sedan cellkärnorna med 50 % Weigerts hematoxylin i 10 minuter. Blötlägg vävnaden i sur etanolförvätskning i 10 s och skölj vävnadsglasen försiktigt med rinnande vatten för att få cellkärnorna att blåna.
OBS: Bered Weigerts hematoxylinfärgningslösning omedelbart före användning. - Färga proverna med droppar Lichun röd färgningslösning (40 μL för varje vävnadsglas) i 7 minuter och tvätta dem med en svag syralösning (30 % saltsyra) i 1 minut för att avlägsna det obundna Lichun röda färgämnet.
- Doppa dem i 95 % alkohol i 20 s och torka dem 2 gånger med vattenfri etanol i 1-3 s vardera. Rensa sedan vävnaderna med xylen och försegla dem med 60 μL neutrala hartsdroppar, som nämns i steg 5.4.
7. Utföra Sirius rödfärgning
- Avvaxa och återfukta paraffinsektioner enligt beskrivningen i steg 5.2.
- Infiltrera sektionerna i 1 h med Sirius röd färgningslösning.
- Färga cellkärnorna i proverna i 8-10 minuter med Mayer hematoxylinfärgningslösning. Skölj dem försiktigt med rinnande vatten i 10 minuter. Torka sedan ut och rensa vävnadsglasen. Försegla dem enligt beskrivningen i steg 5.4.
8. Utföra immunhistokemi
- Avvaxa och återfukta paraffinproverna enligt beskrivningen i steg 5.2.
- Infiltrera proverna med en 3 mg/ml EDTA-antigenhämtningslösning på cirka 30 ml. Koka i 20-30 min. Tvätta vävnaderna med avjoniserat vatten och inkubera dem sedan i fosfatbuffrad lösning innehållande 0,5 % Tween-20 (PBST) i 5 minuter.
- Blötlägg proverna i 15 minuter med 0.3 % väteperoxidlösning för att inaktivera det endogena peroxidaset i proverna. Tvätta dem 3 gånger med PBST i 5 minuter varje gång.
OBS: 0.3 % väteperoxidlösningen måste göras färsk i en ljustät miljö. - Permeabilisera provmembranet i 15 minuter med 0,3 % Triton-100-lösning. Blockera sedan med 30-40 μL 5% bovint serumalbumin (BSA) i 1 timme.
- Ta bort den blockerande lösningen. Tillsätt utspädda primära antikroppar NF-κB (spädning 1:200) och CD68 (spädning 1:1 000) och inkubera proverna över natten vid 2-8 °C i en IHC-våtlåda för att förhindra avdunstning och ljus.
- Nästa dag, överför dem till RT i 1 timme. Tvätta dem sedan med PBST 3x i 5 minuter vardera.
- Inkubera proverna i 1 timme i kanin-anti-mus pepparrotsperoxidasmärkta sekundära antikroppar (spädningsförhållande 1:500) vid RT och tvätta dem med PBST 3x i 5 minuter vardera.
OBS: Både primära och sekundära antikroppar späddes med 5 % BSA. - Inkubera proverna med substratet 3,3'-diaminobenzidin (DAB) motsvarande den enzymmärkta antikroppen i 5-20 min. Stoppa reaktionen med avjoniserat vatten när den optimala färgningsintensiteten uppnås.
OBS: DAB-lösningen måste beredas färskt och skyddas från ljus. Färgutvecklingsreaktionen bör observeras i realtid under mikroskopet för att avgöra när färgningen ska stoppas. Positiva prover uppvisar intensiv färgning, medan negativa prover inte utvecklar färg. - Motfärga proverna i 30 s med Weigert hematoxylin. Skölj sedan servetterna under rinnande vatten i 1 min. Torka sedan ut, rensa och försegla vävnadsglasen, som nämns i steg 5.4.
9. Utföra western blotting-analys
- Lysera lungvävnaderna för att extrahera proteiner. Tillsätt 200 μl RIPA arbetslösning till 20 mg av lungvävnaden.
- Homogenisera vävnaden på is i 5 minuter med en handhållen elektrisk kvarn och inkubera i 1 timme på is med lätt skakning. Centrifugera därefter homogenatet vid 4 °C i 15 minuter vid 14 800 x g.
- Samla upp supernatanten och bestäm proteinkoncentrationen med BCA-proteinanalyssatsen. Bered proteinlagringslösningen med RIPA vid 6 μg/μL protein. Tillsätt 20 μl 5x belastningsbuffert till 80 μL proteinlysat. Stör den sekundära proteinstrukturen genom att värma de proteinhaltiga mikrocentrifugrören i ett metallbad (100 °C) i 20 minuter.
- Efter kylning aliska 100 μl av proteinlagringslösningen i varje rör och förvara proverna i ett kylskåp vid -80 °C. Späd proteinkoncentrationen till 2–3 μg/μL med 1x laddningsbuffert före elektrofores.
OBS: Proteinextraktionsprocessen bör utföras på is. För RIPA-arbetslösningen, tillsätt 1 μl 100 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) till 99 μL RIPA för att hämma nedbrytningen av fosforylerat protein. Förbered 1x belastningsbuffert genom att späda ut 5x belastningsbuffert med RIPA i förhållandet 1:4. - Tillsätt 20 μg prover till varje brunn och kör gelen. För 5 % koncentrerade geler, använd 80 V i 20 minuter för att få proteinerna elektroforeserade ner från samma startpunkt. För 10 % isolerade geler, kör på 100 V i 1 timme för att tillåta proteiner med olika molekylvikter att separeras så mycket som möjligt.
- Föraktivera PVDF-membranet med metanol i 20 s. Överför proteinerna till PVDF-membranet med hjälp av våtöverföringsmetoden med 400 mA ström i 1-2 timmar.
OBS: Se till att elektroforestanken och elektroöverföringstanken är horisontella. Kyl hela tanken med is, eftersom membranöverföringsprocessen genererar mycket värme. - Tvätta membranet med TBST-lösning i 5 minuter varje gång, 5 gånger. Blockera sedan med 5 % BSA eller 5 % skummjölk i 1 timme. Späd de primära antikropparna NF-κB (1:1 000) och β-aktin (1:1 000) med 5 % BSA. Sänk ner remsorna i antikroppslösningen och skaka remsorna försiktigt över natten vid 2–8 °C.
- Tvätta remsorna med PBST. Späd därefter pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad get-anti-kanin sekundär antikropp (1:10 000) och inkubera dem i den utspädda sekundära antikroppen i 1 timme vid RT med försiktig skakning.
- Förbered en framkallare av förbättrad kemiluminescens (ECL), släpp den på remsan och inkubera i 3 minuter.
- Utsätt remsan för en gelkamera i 20 s. Mät remsans gråvärde för att bedöma proteinnivån med systemprogramvara. Använd β-aktin som intern kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den potentiella patogenesen av silikos hos möss undersöktes med hjälp av den föreslagna metoden. Vi fann att kroppsvikten hos mössen i experimentgruppen minskade signifikant i förhållande till kontrollgruppen och att kroppsvikten återhämtade sig långsamt efter att exponeringen upphört. På grund av den optimerade dosen som används här observerades ingen dödlighet hos möss som exponerats för kiseldioxid i detta experiment. Den tekniska färdplanen för upprepat näsdropp till CSD visas i (Figur 1). De tidigare beskrivna procedurerna inkluderade CSD-suspensionsberedning, isofluraninducerad anestesi, näsdropp och thoraxmassage12. Vi visade kollagendeposition och myofibroblastdifferentiering efter 4 veckors statisk matning12. Vi har använt denna dammexponeringsmetod för att studera den underliggande mekanismen för lungfibros orsakad av koldamm. De nya undergrupperna av makrofager och interventionseffekten av D-vitamin hittades genom encellstranskriptomteknik13. I denna studie påskyndades progressionen av lungfibros hos möss signifikant av exponering för CSD, vilket orsakade skador på bronkial perifera elastiska fibrer (Figur 2 och Figur 3). Silikosknölar består av makrofager som innehåller CSD. Fibrosnodulär är berikad med många CSD, och CD68-positiva makrofager uppslukar aktivt dessa partiklar. Dessa deponerade värdepapperscentraler främjar bildandet av fibrösa foci. Som tidigare nämnts, efter att ha exponerats för CSD i 4 veckor, förvärvade möss uppenbara lesioner, såsom kollagenavsättning i kisellungknölar och skador på lungvävnadsstrukturen. Det fanns också en måttlig skada på vävnaden som omger bronkerna12. Den biologiska processen för ER-stress orsakad av CSD är relaterad till NF-κB, som är involverad i det inflammatoriska svaret (se figur 4). Sammantaget visar dessa resultat att det föreslagna tillvägagångssättet effektivt kan simulera utvecklingen av mussilikos.
Figur 1: Kristallina kvartsdammpartiklar (CSD) under fem mikrometer användes för näsdropp. (A) Svepelektronmikroskopi (SEM) av CSD visade att partiklarna var oregelbundet formade. (B) CSD-suspension användes för att bereda mussilikosmodellen genom näsdropp. Maskinen till vänster används för isoflurananestesi, och den högra panelen beskriver de viktigaste punkterna som leder till att näsdroppet fungerar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Sirius rödfärgning visade fibros i muslungor med nasal dropp CSD under 1 månad. (A) Sirius rödfärgning utfördes för att mäta kollagendeposition i lungvävnad efter CSD- eller koksaltsbehandling (vänster övre och vänster nedre i rutor). Polariserande mikroskopi avslöjade tre olika typer av kollagenfibrer (röda, gula och gröna), varav kollagenfibrer av typ 1 som visas i rött är en riskfaktor för silikos. Dock hittades ingen signifikant fibros i vehikelgruppen (höger upp och låga paneler). (B) Fibrospoäng (FS) är ett semikvantitativt utvärderingsindex baserat på Sirius rödfärgning12 som skiljer sig signifikant från kontrollen (***P < 0,0001). Skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Immunhistokemisk färgning av CD68 i CSD-behandlad muslunga för att övervaka makrofagers roll i en silikotisk knölbildning. En typisk kiseldioxidknöl kännetecknas av flytande nekros efter fagocytos av CSD i mitten, omgiven av makrofager i periferin (HE-färgning). Dessutom anrikades CSD i knölarna, åtföljd av fibros (Masson färgning). Immunhistokemisk färgning av CD68 avslöjade att makrofager var allmänt förekommande i lungvävnad. Dessutom hade dessa makrofager fått i sig CSD (ses under polariserad ljusmikroskopi, höger panel), vilket orsakade svåra lungskador. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: NF-κB-uttrycket i den CSD-behandlade muslungan . (A) Immunhistokemisk färgning utfördes på lungvävnaden. Den CSD-behandlade muslungan på den högra rutan visade hög NF-κB-färgning jämfört med vehikelgruppen på den vänstra. Skalstapel = 50 μm. (B) Representativ western blot visade att de CSD-behandlade mössen har ett ökat NF-κB-uttryck i lungan. Färsk lungvävnadslys utsattes för western blotting. (C) Skillnaden i NF-κB mellan Sil- och Veh-grupperna var signifikant (** P < 0,01). Bandintensiteten mättes med hjälp av bild J. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Silikosmusmodeller är avgörande för att studera patogenesen och behandlingen av silikos. Detta protokoll beskriver en metod för att förbereda en modell av silikos hos möss genom upprepad nasal exponering. Denna metod gör det möjligt att studera de patologiska egenskaperna hos silikos som induceras av olika exponeringstider. Mössen sövdes i respirator och deras andningsfrekvens övervakades. Den initiala korta, snabba andningsfrekvensen avtog och fördjupades gradvis med tiden. Narkosen fick mössens muskler att slappna av, vilket ledde till djup andning och gjorde det möjligt för dem att andas in CSD under ett tidsfönster av långsam, djup andning. Under denna process håller operatören musens underkäke med tummen och rätar ut nacken för att förhindra att vätskan kommer in i matsmältningskanalen, en metod för exponering för respirabelt damm som inte orsakar smärta och är icke-invasiv. Denna metod kan möta de individuella behoven av upprepad implementering för att studera dammexponering. Kato et al. använde 2017 en enda stor dos (125 mg/ml, 40 μL) via ett orofaryngealt dropp för att modellera lungfibros, och vi hänvisar till denna koncentration för att försöka utforska de lungförändringar som induceras av flera små doser genom näshålan14.
Det finns flera utmaningar förknippade med näsdropp efter anestesi ur teknisk synvinkel. Under denna process håller operatören musens underkäke med tummen för att räta ut halsen och för att förhindra att vätskan kommer in i matsmältningskanalen. Om mössen inte uppnår djup anestesi eller om operatören inte är skicklig och missar tidsfönstret för långsam djupandning, kommer effekten av näsdroppet och modellens patologiska egenskaper inte att vara som förväntat. Därför, för att undvika översövd död och underbedövad modelleringsfel, måste de som arbetar med isofluransövda möss vara adekvat utbildade och behärska de kritiska egenskaperna hos isofluransövda möss innan de utför näsdroppet. Att trycka på mössens bröstkorg efter näsdroppet, vanligen kallat massage, främjar dessutom CSD:s resa för att nå de terminala bronkerna och till och med lungornas alveolära väggar. Möss som sövdes till en djup nivå var benägna att kvävas när de fick en hög dos näsdropp. Men om bröstkorgen snabbt trycktes ihop ökade överlevnaden. Sist men inte minst kräver skapandet av silikosmodeller möss med en sund fysisk grund, och vissa studier har visat att möss äldre än 10-12 veckor har dålig tolerans och en ökad dödlighet efter upprepad exponering för CSD. Trots sina fördelar har denna modell flera nackdelar. En nackdel är att musen inte direkt andas in dammpartiklar genom luftflödet. För att komma till rätta med detta problem har vi begränsat mängden CSD-suspension som inhaleras i ett enda andetag och frekvensen av upprepad administrering av CSD. Dessutom har vi inrättat fordonsgrupper. Uppgifterna visar att inandning av en liten mängd vätska endast tillfälligt stör ventilationen, vilket inte skadar mössens lungor12. Fordonskontrollmössen absorberar snabbt den inandade saltlösningen utan att påverka mössens lungfunktion, kroppsvikt eller basala aktivitet. Tvärtom kan upprepad exponering för CSD genom näsinandning skapa den önskade dynamiska modellen av silikos hos möss12. Eftersom olika exponeringsfrekvenser påverkar fibrosprocessen i modeller med upprepad exponering har vi ingen tydlig tidpunkt. Vanligtvis, för en engångsexponering av kvartsdamm, är dag 7 fortfarande i de tidiga stadierna av silikosen. Dag 7-14 motsvarar det inflammatoriska aktivitetsstadiet, dag 14-28 motsvarar fibrostransformationsstadiet och tiden efter dag 28 motsvarar fibrosbildningsstadiet12,15. Patologin vid dessa tidpunkter kan dock variera beroende på dosen.
Näsdroppsmetoden har flera fördelar jämfört med traditionella endotrakealdropp eller kirurgiskt exponerade trakeostomimetoder16,17, såsom att minska trakeotomirelaterade infektioner och postoperativ vård. Detta tillvägagångssätt kan också uppfylla kravet på upprepad exponering för värdepapperscentraler under ett experiment och kräver inte dyr utrustning. Dessutom är näsdroppsmetoden en mer realistisk representation av dammexponering, eftersom små partiklar kommer in i lungorna från de övre luftvägarna och färdas till de terminala bronkiolerna och alveolerna. Eftersom vi använder flera små doser av kiseldioxiddroppar kan kvartsdammdosen komma in i lungan i maximal utsträckning och kontinuerligt stimulera organismen. Således är denna modelleringsmetod utvecklad för att simulera den återkommande exponeringen av anställda för CS i deras arbetsmiljö och för att utforska den patologiska processen av silikos.
Att skapa musmodeller av silikos via nasal exponering för CSD kan tillämpas på upprepade exponeringar. Därför kan denna djurmodell användas för att studera effekterna av exponeringsfrekvens och dosering på silikosprogression och de dynamiska patologiska egenskaperna och mekanismerna för silikos. Dessutom är kombinerad exponering med andra ämnen eller mediciner också mycket möjlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av University Synergy Innovation Program i Anhui-provinsen (GXXT-2021-077) och Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
- The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W.
- Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
- Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
- Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
- Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).
- Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
- Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).
- Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).
- Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).
