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Biology

प्लांट रूट सिस्टम आर्किटेक्चर लक्षणों के मानचित्रण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64876
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,4
1Department of Biology, Western Kentucky University, 2Plant Biotechnology Division, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, 3Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 4Department of Biology, St. Joseph's University

Summary

हम एराबिडोप्सिस और मेडिकागो के रूट सिस्टम आर्किटेक्चर (आरएसए) की जांच करने के लिए सरल प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करते हैं। प्लांटलेट्स को जाल पर हाइड्रोपोनिक रूप से उगाया जाता है और आरएसए को प्रकट करने के लिए एक कला ब्रश का उपयोग करके फैलाया जाता है। छवियों को स्कैनिंग या उच्च-रिज़ॉल्यूशन कैमरे का उपयोग करके लिया जाता है, फिर लक्षणों को मैप करने के लिए इमेजजे के साथ विश्लेषण किया जाता है।

Abstract

पौधों की जड़ प्रणाली वास्तुकला (आरएसए) विकास का व्यापक ज्ञान पोषक तत्वों के उपयोग की दक्षता में सुधार और पर्यावरणीय चुनौतियों के लिए फसल खेती सहिष्णुता बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। हाइड्रोपोनिक सिस्टम, प्लांटलेट ग्रोथ, आरएसए प्रसार और इमेजिंग की स्थापना के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। दृष्टिकोण ने पॉली कार्बोनेट वेज द्वारा समर्थित पॉलीप्रोपाइलीन जाल युक्त एक मैजेंटा बॉक्स-आधारित हाइड्रोपोनिक प्रणाली का उपयोग किया। प्रयोगात्मक सेटिंग्स को अलग-अलग पोषक तत्वों (फॉस्फेट [पीआई]) आपूर्ति के तहत प्लांटलेट्स के आरएसए का आकलन करके उदाहरण दिया जाता है। इस प्रणाली को एराबिडोप्सिस के आरएसए की जांच करने के लिए स्थापित किया गया था, लेकिन यह मेडिकागो सैटिवा (अल्फाल्फा ) जैसे अन्य पौधों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय है। एराबिडोप्सिस थैलियाना (कोल -0) प्लांटलेट का उपयोग इस जांच में पौधे आरएसए को समझने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। इथेनॉल और पतला वाणिज्यिक ब्लीच का इलाज करके बीजों को सतह निष्फल किया जाता है, और स्तरीकरण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। बीज पॉली कार्बोनेट वेज द्वारा समर्थित पॉलीप्रोपाइलीन जाल पर तरल आधे एमएस माध्यम पर अंकुरित और उगाए जाते हैं। पौधों को वांछित दिनों के लिए मानक विकास स्थितियों के तहत उगाया जाता है, धीरे से जाल से उठाया जाता है, और पानी युक्त आगर प्लेटों में डुबोया जाता है। प्लांटलेट्स की प्रत्येक जड़ प्रणाली को एक गोल कला ब्रश की मदद से पानी से भरी प्लेट पर धीरे से फैलाया जाता है। आरएसए लक्षणों को दस्तावेज करने के लिए इन पेट्री प्लेटों को उच्च रिज़ॉल्यूशन पर फोटो या स्कैन किया जाता है। मूल लक्षण, जैसे प्राथमिक जड़, पार्श्व जड़ें और शाखा क्षेत्र, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा जाता है। यह अध्ययन नियंत्रित पर्यावरण सेटिंग्स में पौधे की जड़ विशेषताओं को मापने के लिए तकनीक प्रदान करता है। हम चर्चा करते हैं कि (1) प्लांटलेट कैसे उगाए जाएं, और जड़ के नमूने एकत्र और प्रसारित करें, (2) फैले हुए आरएसए नमूनों की तस्वीरें प्राप्त करें, (3) छवियों को कैप्चर करें, और (4) जड़ विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। वर्तमान विधि का लाभ आरएसए लक्षणों का बहुमुखी, आसान और कुशल माप है।

Introduction

रूट सिस्टम आर्किटेक्चर (आरएसए), जो भूमिगत है, पौधे के विकास और उत्पादकता 1,2,3 के लिए एक महत्वपूर्ण अंग है। भ्रूण चरण के बाद, पौधे अपने सबसे महत्वपूर्ण रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरते हैं। जिस तरह से मिट्टी में जड़ें बढ़ती हैं, वह जमीन के ऊपर पौधों के हिस्सों के विकास को बहुत प्रभावित करती है। जड़ विकास अंकुरण में पहला कदम है। यह एक सूचनात्मक विशेषता है क्योंकि यह विशिष्ट रूप से विभिन्न उपलब्ध पोषक तत्वों 1,2,3,4 का जवाब देता है। आरएसए विकासात्मक प्लास्टिसिटी की एक उच्च डिग्री प्रदर्शित करता है, जिसका अर्थ है कि पर्यावरण का उपयोग हमेशा विकासके बारे में निर्णय लेने के लिए किया जाता है 2,5। पर्यावरण में परिवर्तन ने वर्तमान परिदृश्य में फसल उत्पादन को और अधिक कठिन बना दिया है। निरंतर आधार पर, आरएसए पर्यावरणीय संकेतों को विकासात्मक विकल्पों में शामिल करताहै। नतीजतन, जड़ विकास के पीछे सिद्धांतों की पूरी तरह से समझ यह सीखने के लिए आवश्यक है कि पौधे बदलते वातावरण2,5 का जवाब कैसे देते हैं।

आरएसए अलग-अलग पोषक तत्व सांद्रता को महसूस करता है और फेनोटाइपिक परिवर्तन 4,6,7,8,9,10,11,12 प्रदान करता है। अध्ययनों से पता चलता है कि शूट आकृति विज्ञान 1,3 की तुलना में जड़ आकृति विज्ञान / आरएसए अत्यधिक प्लास्टिक है। आरएसए विशेषता मानचित्रण आसपास के मिट्टी के वातावरण को बदलने के प्रभाव को रिकॉर्ड करने में अत्यधिक प्रभावी है 1,11,12.

सामान्य तौर पर, रूट फेनोटाइप पर विभिन्न पोषक तत्वों की कमी के प्रभाव में विसंगतियों को कई पहले के अध्ययनों 3,11,13,14,15 में रिपोर्ट किया गया है। उदाहरण के लिए, पार्श्व जड़ों (एलआर) की संख्या, लंबाई और घनत्व में फॉस्फेट (पीआई) भुखमरी-प्रेरित परिवर्तनों पर कई विपरीत रिपोर्टें हैं। पाई की कमी की स्थिति 6,8 के तहत एलआर घनत्व में वृद्धि की सूचना दी गई है। इसके विपरीत, पाई की कमी की स्थिति के तहत एलआर घनत्व में कमी अन्य लेखकों 3,13,16 द्वारा भी रिपोर्ट की गई है। इन विसंगतियों के प्रमुख कारणों में से एक मौलिक संदूषण-प्रवण गेलिंग माध्यम का उपयोग है, जिसमें अक्सर10 होते हैं। शोधकर्ता आमतौर पर अपने प्रयोगात्मक पौधों को एगर-आधारित प्लेट प्रणाली पर उगाते हैं और जड़ लक्षणों को रिकॉर्ड करते हैं। कई आरएसए लक्षण अक्सर एगर सामग्री के भीतर छिपे या घुसे होते हैं और उन्हें प्रलेखित नहीं किया जा सकता है। पोषक तत्वों की कमी को प्रेरित करने से जुड़े प्रयोग, जिसमें उपयोगकर्ता अक्सर माध्यम से एक घटक को पूरी तरह से बाहर कर देते हैं, मौलिक संदूषण-प्रवण गेलिंग माध्यम 11,14,15 में नहीं किया जा सकता है। कई पोषक तत्व अक्सर आगर मीडिया में महत्वपूर्ण मात्रा में मौजूद होते हैं, जिनमें पी, जेडएन, एफई और कई और 11,14,15 शामिल हैं। इसके अलावा, गैर-आगर-आधारित तरल माध्यम की तुलना में एगर-आधारित मीडिया में आरएसए की वृद्धि धीमी है। नतीजतन, आरएसए के फेनोटाइप को निर्धारित करने और गुणात्मक रूप से रिकॉर्ड करने के लिए एक वैकल्पिक गैर-आगर-आधारित दृष्टिकोण स्थापित करने की आवश्यकता है। नतीजतन, वर्तमान विधि विकसित की गई है, जिसमें प्लांटलेट को पॉली कार्बोनेट वेज1,10,11 द्वारा समर्थित पॉलीप्रोपाइलीन जाल के ऊपर एक मैजेंटा बॉक्स-आधारित हाइड्रोपोनिक सिस्टम में उठाया जाता है।

यह अध्ययन जैन एट अल.10 द्वारा वर्णित पहले की विधि का एक विस्तृत तात्कालिक संस्करण प्रस्तुत करता है। इस रणनीति को पौधे की जड़ जीव विज्ञान में वर्तमान मांगों के लिए ट्यून किया गया है और इसका उपयोग मॉडल पौधों के अलावा अल्फाल्फा जैसे पौधों के लिए भी किया जा सकता है। प्रोटोकॉल आरएसए में परिवर्तनों को मापने का प्राथमिक तरीका है, और इसके लिए केवल सरल उपकरणों की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल दिखाता है कि सामान्य और संशोधित माध्यम (पाई की कमी) में प्राथमिक और पार्श्व जड़ों जैसे कई मूल विशेषताओं को कैसे फेनोटाइप किया जाए। लेखक के अनुभवों से प्राप्त चरण-दर-चरण निर्देश और अन्य उपयोगी संकेत शोधकर्ताओं को इस पद्धति में दी गई पद्धतियों के साथ पालन करने में मदद करने के लिए प्रदान किए जाते हैं। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य पौधों की पूरी जड़ प्रणाली को प्रकट करने के लिए एक सरल और प्रभावी विधि प्रदान करना है, जिसमें उच्च क्रम एलआर भी शामिल हैं। इस विधि में एक गोल वॉटरकलर आर्ट ब्रश के साथ रूट सिस्टम को मैन्युअल रूप से फैलाना शामिल है, जिससे जड़ों 1,10,11,12 के संपर्क पर सटीक नियंत्रण की अनुमति मिलती है। इसके लिए महंगे उपकरण या जटिल सॉफ्टवेयर की आवश्यकता नहीं है। इस विधि ने पोषक तत्वों के उत्थान और विकास दर में सुधार किया है; पौधों में पोषक तत्वों से भरपूर घोल होता है जो उनकी जड़ों द्वारा आसानी से अवशोषित होता है। वर्तमान विधि उन शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है जो पौधे की जड़ प्रणाली के लक्षणों को विस्तार से मैप करना चाहते हैं, खासकर प्रारंभिक विकास के दौरान (अंकुरण के 10-15 दिन बाद)। यह छोटे जड़ प्रणालियों, एराबिडोप्सिस और तंबाकू जैसे मॉडल पौधों और अल्फाल्फा जैसे गैर-पारंपरिक पौधों के लिए उपयुक्त है जब तक कि उनकी जड़ प्रणाली मैजेंटा बक्से में फिट नहीं होती है।

एराबिडोप्सिस में आरएसए विकास के फेनोटाइपिक विश्लेषण के चरणों को इस प्रोटोकॉल में निम्नानुसार रेखांकित किया गया है: (1) पौधों (एराबिडोप्सिस) के लिए बीज की सतह नसबंदी की विधि, (2) हाइड्रोपोनिक प्रणाली स्थापित करने के चरण, इसके बाद एक माध्यम पर बीज बुवाई, (3) आरएसए विश्लेषण के लिए पेट्री प्लेट पर पूर्ण बीज लेने और फैलने की प्रक्रिया। (4) आरएसए के लिए छवियों को कैसे रिकॉर्ड करें, और (5) इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके महत्वपूर्ण आरएसए मापदंडों की गणना करें।

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Protocol

पूरे प्रोटोकॉल को चित्रा 1 में योजनाबद्ध रूप से संक्षेपित किया गया है, जिसमें प्लांटलेट्स के रूट सिस्टम आर्किटेक्चर (आरएसए) को प्रकट करने में शामिल सभी आवश्यक चरणों को दिखाया गया है। प्रोटोकॉल चरण नीचे विस्तार से दिए गए हैं:

1. एराबिडोप्सिस बीज की सतह नसबंदी

  1. बीज के एक छोटे स्कूप (लगभग 100 बीज = लगभग 2.5 मिलीग्राम) को माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर आसुत पानी में 30 मिनट के लिए भिगोएं। यह पूरी प्रक्रिया सड़न रोकनेवाली स्थिति में की जाती है।
  2. संक्षेप में माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 500 x g पर 5 s के लिए बीज होते हैं, जो बीज को व्यवस्थित करने के लिए RT पर किसी भी टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करते हैं।
  3. पानी को अलग करें, 700% (v / v) इथेनॉल का 700 μL जोड़ें, कुछ सेकंड के लिए भंवर, और स्पिन करें। यदि आवश्यक हो तो भंवर और कताई को दोहराएं, लेकिन सुनिश्चित करें कि 70% इथेनॉल का उपचार समय 3 मिनट पर रहता है।
  4. 3 मिनट के बाद, तुरंत बाँझ पानी से एक बार धो लें। इथेनॉल धोने के चरण को यथासंभव समय पर रखें, क्योंकि लंबे समय तक इथेनॉल एक्सपोजर अंकुरण को कम करता है।
  5. बीज को पतला वाणिज्यिक ब्लीच (4% v/ v) के साथ ट्वीन -20 की एक बूंद के साथ 7 मिनट के लिए उपचारित करें। ट्यूबों को तेजी से 8-12 बार मोड़कर ब्लीच घोल के साथ बीज मिलाएं, इसके बाद एक संक्षिप्त सेंट्रीफ्यूज (आरटी पर 5 सेकंड के लिए 500 x g )। ट्यूब में झाग दिखाई दे रहा है।
  6. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को डिकैंटिन करें और उसी भंवर प्रक्रिया का पालन करते हुए, बाँझ पानी के साथ कम से कम पांच धोने के साथ बीज को कुल्ला करें।
  7. सतह के निष्फल बीजों को पानी में छोड़ दें और स्तरीकरण10 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।

2. बीज अंकुरण के लिए एक हाइड्रोपोनिक प्रणाली स्थापित करना

  1. आसुत जल के साथ एक मानक मैजेंटा बॉक्स को आधा भरें और इसे ऑटोक्लेव करें। पॉली कार्बोनेट शीट (स्पष्ट रंग और चिकनी बनावट) को ऑटोक्लेव करें और 4 सेमी x 8 सेमी आयताकारों को काटें, जिसमें एक मध्य बिंदु आयताकार के माध्यम से आधे से अधिक हो ताकि दो आयताकार एक साथ स्लॉट करके एक्स आकार10 बना सकें। इस सेटअप का उपयोग पॉलीप्रोपाइलीन जाल (250 μm छिद्र आकार के 6 सेमी x 6 सेमी वर्ग, या आवश्यकता के आधार पर) को 12x 24 इंच शीट10 से काटने के लिए करें।
    नोट: पॉलीप्रोपाइलीन एसिड, क्षार और अन्य रसायनों के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी है; इसलिए, इसे चुना गया है। ऑटोक्लेविंग पॉलीप्रोपाइलीन जाल को विकृत करता है; इसलिए, इसे एल्यूमीनियम पन्नी में अलग से लपेटकर ले जाने की सिफारिश की जाती है। 16 मिनट, 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआई, या 775 मिमी एचजी की विशिष्ट ऑटोक्लेविंग स्थितियों की सिफारिश की जाती है।
  2. एक लामिनर प्रवाह में पॉलीप्रोपाइलीन जाल के निचले किनारे तक पहुंचने के लिए प्रत्येक बॉक्स में विटामिन + 1.5% (डब्ल्यू / वी) सुक्रोज के साथ बाँझ आधा एमएस बेसल मीडिया जोड़ें। सभी प्रक्रियाएं सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में की जाती हैं।
  3. सतह-निष्फल बीजों को जाल (250 μm छिद्र आकार) पर हाइड्रोपोनिक रूप से बोएं और उन्हें 3 दिनों तक बढ़ने दें।
  4. 3 दिनों के बाद, रोपाई को एक जाल (500 μm छिद्र आकार) पर स्थानांतरित करें और उन्हें 2 दिनों के लिए बढ़ने दें।
  5. 2 दिनों (कुल 5 दिनों) के बाद, रोपाई को नियंत्रण मीडिया पर स्थानांतरित करें (यानी, संशोधित एमएस पोषक तत्व मीडिया1 जिसमें 2.0 एमएम एनएच4एनओ3, 1.9 एमएम केएनओ3, 0.15 एमएम एमजीएसओ4.7 एच2ओ, 0.1 एमएम एमएनएसओ4 शामिल हैं। H2O, 3.0 μM ZnSO4.7H 2O, 0.1 μM CuSO4.5H 2O, 0.3 mM CaCl2.2H 2O, 5.0 μM KI, 0.1 μM CoCl2.6H 2O, 0.1 mM FeSO4.7H 2O, 0.1 mM Na2EDTA·2H2O, 1.25 mM KH2PO4, 100 μM H3BO3, 1 μM Na2MoO 4.2H2O, 1.5% सुक्रोज, 1.25 mM MES, pH 5.7 0.1 M MES [pH 6.1]) और प्रयोगात्मक मीडिया (जैसे, P- [0 mM] उपचार के साथ समायोजित; केएच2पीओ4 को नियंत्रण मीडिया संरचना से 0.62 एमएम के2एसओ 4 के साथ बदल दियागया है जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गयाहै। अतिरिक्त पाई उपचार के लिए, केएच2पीओ4 की एकाग्रता संशोधित एमएस माध्यम [2.5, 5.0, 10.0, 20.0 एमएम]1] में बढ़ जाती है और बीज को 7 दिनों तक बढ़ने देती है।
    नोट: एक बड़ा जाल छिद्र आकार (500 μm) हाइपोकोटाइल में काटने की आवश्यकता या किसी भी नुकसान के बिना पूरे रोपाई के चिकनी चयन की सुविधा प्रदान करता है। प्लांटलेट मानक विकास स्थितियों (यानी, 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे फोटोअवधि, 150 μmol-m-2.s-1 प्रकाश तीव्रता, 60% -70% आर्द्रता) के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं।

3. आरएसए की परीक्षा

  1. जड़ फैलाने के लिए आगर (1.1%) प्लेटें तैयार करें (पेट्री प्लेट का आकार: 150 मिमी x 15 मिमी)।
  2. पेट्री प्लेट में 10-20 एमएल ऑटोक्लेव फ़िल्टर किए गए नल का पानी जोड़ें, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है। धीरे से जाल (500 μm) से रोपाई को बाहर निकालें और उन्हें प्लेटों पर पानी में डुबो दें।
  3. धीरे से एक गोल वॉटरकलर आर्ट ब्रश (आकार: संख्या 14, 16, 18, और 20) की मदद से पानी से भरी प्लेट में प्रत्येक पौधे की जड़ फैलाएं।
    नोट: जड़ प्रणाली के प्रसार को अंजाम देते समय, पहले प्राथमिक जड़ को पकड़ें और इसे एक सीधी रेखा में फैलाएं, क्योंकि यह एक धुरी के रूप में कार्य करता है। फिर, जहां भी संभव हो, प्राथमिक जड़ के प्रत्येक तरफ एलआर को सममित रूप से फैलाएं। उसके बाद, पहले ऑर्डर एलआर से जुड़े दूसरे ऑर्डर एलआर को फैलाएं। यह प्रसार प्रक्रिया एक प्रकार की कला है; इसे धीरे-धीरे, धीरे-धीरे करें, जैसे एक कलाकार आरएसए की छवि खींचता है।
  4. पानी निकालने के लिए प्लेट को थोड़ा झुकाएं।
    नोट: इस बिंदु पर, इन स्प्रेड प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखकर प्रक्रिया को रोका जा सकता है। बाद में, जब छवि प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है, तो प्लेटों को बाहर निकालें और उन्हें थोड़ी देर के लिए आरटी पर रखें। संघनित पानी को मिटा दें, और फिर छवि को आसानी से संसाधित किया जा सकता है।

4. आरएसए के लिए छवियों को रिकॉर्ड करना

  1. इन पेट्री प्लेटों को उचित रूप से स्कैन या फोटोग्राफ करें।
    नोट: उच्च गुणवत्ता वाली तस्वीरें प्राप्त करने के लिए, स्कैनिंग के लिए 600 डीपीआई रिज़ॉल्यूशन की सिफारिश की जाती है, और फोटोग्राफी के लिए कम से कम 12 मेगापिक्सेल कैमरा की सिफारिश की जाती है।
  2. स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजजे सॉफ्टवेयर (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) का उपयोग करके रूट सिस्टम आर्किटेक्चर लक्षणों को मापें। इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जड़ की लंबाई को मापने के लिए चरणों का जल्दी से पालन करने के लिए, कृपया उदाहरण "डीएनए समोच्च लंबाई को मापने" 17 देखें।
    नोट: उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्कैनर या कैमरे का उपयोग करके कैप्चर किए गए चित्रों पर रूट लंबाई को मापने के लिए इन चरणों का पालन किया जाता है।
    1. स्केल सेट करने के लिए लंबाई की दी गई दूरी का उपयोग करें। चित्र 3 में स्केल बार की ज्ञात दूरी 2 सेमी है। ImageJ टूलबार (बाईं ओर से पांचवां उपकरण) से सीधी रेखा उपकरण का चयन करें। स्केल पट्टी को रेखांकित करने वाली पंक्ति चयन बनाने के लिए स्ट्रेट-लाइन टूल का उपयोग करें। शुरुआत में बॉक्स में राइट-क्लिक, डबल-क्लिक या क्लिक करके आउटलाइनिंग समाप्त करें।
    2. विश्लेषण > माप उपकरण पट्टी का उपयोग करके पिक्सेल में ज्ञात स्केल बार की लंबाई को मापें । पिक्सेल लंबाई का नोट करें।
    3. विश्लेषण टैब में स्केल सेट टैब क्लिक करके स्केल सेट करें संवाद बॉक्स खोलें । पिक्सेल फ़ील्ड में दूरी में , पिक्सेल लंबाई दर्ज करें (जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है)। इसके बाद, ज्ञात दूरी फ़ील्ड में, मान दर्ज करें, जैसा कि स्केल बार द्वारा दिखाया गया है (यहां, यह 20 मिमी है)। लंबाई की इकाई को मिमी के रूप में सेट करें। पिक्सल-आस्पेक्ट रेशियो 1.0 है। अब, पैमाने को प्रति मिलीमीटर पिक्सेल की एक्स संख्या द्वारा निर्दिष्ट किया जाता है। इस विशेष छवि के लिए स्केल लॉक करने के लिए, ओके पर क्लिक करें।
    4. एक पंक्ति चयन बनाएँ जो खंडित लाइन उपकरण का उपयोग करके रूट लंबाई को रेखांकित करता है। शुरुआत में बॉक्स में राइट-क्लिक, डबल-क्लिक या क्लिक करके आउटलाइनिंग समाप्त करें। आवश्यकतानुसार लाइन चयन को समायोजित करने के लिए रूपरेखा के साथ छोटे काले और सफेद "हैंडल" पर क्लिक करें और खींचें।
    5. रूट की लंबाई निर्धारित करने के लिए ImageJ के विश्लेषण टैब के तहत माप आदेश का उपयोग करें। मापा डेटा को स्प्रेडशीट में स्थानांतरित करने के लिए, परिणाम विंडो पर राइट-क्लिक करें, पॉपअप मेनू से सभी कॉपी करें का चयन करें, स्प्रेडशीट पर स्विच करें, और फिर डेटा पेस्ट करें।
      नोट: जैसा कि ऊपर वर्णित है, इमेजजे सेट स्केल विकल्प में स्केल बार की ज्ञात दूरी का उपयोग करके स्केल सेट करें। यह प्रति यूनिट लंबाई पिक्सेल की संख्या देता है। हर बार पैमाने को ताजा सेट करना आवश्यक है, जब भी एक नई छवि का विश्लेषण किया जा रहा है।
  3. आरएसए लक्षणों का मापन और गणना
    1. हाइपोकोटिल जंक्शन से रूट टिप के अंत के बीच प्राथमिक जड़ की लंबाई को मापें।
    2. पहले और दूसरे क्रम की एलआर लंबाई को मापें।
    3. प्राथमिक जड़ के ब्रांचिंग ज़ोन (बीजेड) को मापें। प्राथमिक जड़ (बीजेडपीआर) का ब्रांचिंग जोन पहले एलआर उभरते बिंदु से अंतिम एलआर उभरते बिंदु तक फैला हुआ है।
    4. एलआर की संख्या रिकॉर्ड करें, जो बीजेड पीआर की सीमा के भीतर उत्पन्न होने वालेएलआर की संख्या है।
    5. प्रथम और उच्च-क्रम LRs की औसत लंबाई को मापें। 1° LR की कुल लंबाई को 1° LRs की कुल संख्या से विभाजित करके प्रथम-क्रम LR (1° LR) (सेंटीमीटर प्रति रूट) की औसत लंबाई ज्ञात कीजिये।
    6. दूसरे क्रम के एलआर की औसत लंबाई को मापें। 2° LR की कुल लंबाई को 2° LRs की कुल संख्या से विभाजित करके दूसरे क्रम के LR (2° LR) की औसत लंबाई की गणना कीजिये।
    7. 1 ° एलआर घनत्व को मापें। बीजेड पीआर की लंबाई से 1 डिग्री एलआर की संख्या को विभाजित करके 1 ° एलआर घनत्व (बीजेडपीआर की प्रति इकाई लंबाई में 1 ° एलआर की संख्या) की गणनाकरें।
    8. 2 ° एलआर घनत्व को मापें। 2° LR घनत्व की गणना 1° LRs के BZ की लंबाई से 2° LRs की लंबाई से (1° पार्श्व जड़ों के BZ की प्रति इकाई लंबाई में 2° LRs की संख्या) से करके कीजिये।
    9. कुल रूट लंबाई (टीआरएल) मापें। यह प्राथमिक जड़, 1 ° LR, और 2 ° LR (और अधिक यदि मौजूद है) लंबाई का कुल है।

5. जड़ बाल माप

नोट: हालांकि हाइड्रोपोनिक प्रणाली जड़ बालों के विकास और विकास को बढ़ावा देने में अच्छी नहीं है, ठोस विकास मीडिया में मजबूत होने के बावजूद, वर्तमान संदर्भ में इसका अध्ययन करना अभी भी महत्वपूर्ण है। रोपाई की प्राथमिक जड़ के सिरे से 5 मिमी अनुभाग में जड़ बालों के विकास का विश्लेषण करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।

  1. मूल सिरे से प्राथमिक जड़ के 2 सेमी खंड को काट लें।
  2. एक माउंटिंग माध्यम के रूप में 10% ग्लिसरॉल का उपयोग करके एक स्लाइड पर रूट सेक्शन को माउंट करें।
  3. स्लाइड को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
  4. जड़ बालों की छवियों को देखने और कैप्चर करने के लिए अक्षीय वाहक का उपयोग करें।
  5. इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जड़ बालों की संरचना और विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए छवियों का विश्लेषण करें जैसा कि पहले वर्णित है।

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Representative Results

रूट सिस्टम आर्किटेक्चर (आरएसए) के विभिन्न मोर्फोमेट्रिक लक्षणों को सरल प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके मापा जाता है, और चरणों को चित्रा 1 में योजनाबद्ध रूप से चित्रित किया गया है। हाइड्रोपोनिक सेटअप का विवरण आरएसए (चित्रा 1 और चित्रा 2) को मापने में प्रोटोकॉल की क्षमता को प्रदर्शित करता है।

गेलिंग एजेंटों में देखे गए अंतर को देखते हुए, हमने सभीअध्ययनों का संचालन करने के लिए एक हाइड्रोपोनिक बढ़ती प्रणाली का उपयोग किया। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, यह हाइड्रोपोनिक प्रणाली अच्छी तरह से काम करती है, जो पाई की कमी और पर्याप्त परिस्थितियों के तहत स्पष्ट विपरीत फेनोटाइप को दर्शाती है (चित्रा 3)। एराबिडोप्सिस के बीजों को पॉलीप्रोपाइलीन जाल पर आधे-एमएस माध्यम में 5 दिनों के लिए हाइड्रोपोनिक रूप से खेती की गई थी, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। प्लांटलेट्स को 5 दिनों के बाद पाई की कमी और पर्याप्त स्थितियों में प्रत्यारोपित किया गया था, और 7 दिनों तक बढ़ने की अनुमति दी गई थी (चित्रा 3)।

विभिन्न पोषक तत्वों (पाई) आपूर्ति के तहत आरएसए लक्षणों का प्रदर्शन
हमने आरएसए 3 के लक्षणों का विश्लेषण और रिकॉर्ड करने के लिए एक स्थापित योजना का पालन कियाहै। हाइड्रोपोनिक स्थितियों में विपरीत पाई शासन के तहत विभिन्न आरएसए लक्षणों का विश्लेषण किया गया था (चित्रा 3)। पीआई की कमी वाले उपचार (0 एमएमपीआई) ने आमतौर पर रिपोर्ट किए गए रूट फेनोटाइप को लागू किया, जो पाई पर्याप्त स्थिति (चित्रा 3 ए) की तुलना में एक छोटा, उथला और कम शाखित आरएसए प्रदर्शित करता है। प्राथमिक जड़ की लंबाई पाई की कमी की स्थिति (चित्रा 3 ए, बी) के तहत काफी क्षीण हो गई थी। प्राथमिक जड़ की लंबाई, पाई (1.25 एमएम) की उपस्थिति में तेजी से प्राप्त होती है, जो फिजियो-रूपात्मक परिवर्तनों को पर्याप्त रूप से दर्शाते हुए हाइड्रोपोनिक प्रणाली की दक्षता को दर्शाती है (चित्रा 3 ए, बी)। पाई की कमी की स्थिति (चित्रा 3 बी) के तहत टीआरएल में काफी कमी आई थी। ब्रांचिंग ज़ोन (बीजेडपीआर), जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, पाई की कमी की स्थिति (चित्रा 3 बी) के तहत काफी क्षीण हो गया था।

इन लक्षणों में से, सबसे अधिक प्रभावित टीआरएल था, क्योंकि दो पाई स्थितियों के बीच एलआर संख्या में उच्च अंतर था। पीआई पर्याप्त स्थिति (1.25 एमएम) के तहत आरएसए की जोरदार वृद्धि 1 डिग्री एलआर की संख्या और लंबाई में उल्लेखनीय वृद्धि के कारण थी। इस प्रकार, एक तेजी से आरएसए परिवर्तन हुआ, मुख्य रूप से एलआर विकास में परिवर्तन के कारण। हमने प्राथमिक जड़ के शाखा क्षेत्र की सीमा के भीतर उत्पन्न होने वाले एलआर की संख्या को मापा, क्योंकि उन्हें अधिक सार्थक 1,3,18 माना जाता है। पाई की कमी की स्थिति (चित्रा 3 सी) में 1 डिग्री एलआर (सेंटीमीटर प्रति रूट) की औसत लंबाई काफी कम हो गई थी। पी0 स्थिति के कारण औसत 2 ° एलआर लंबाई समान रूप से कम हो गई थी; हालांकि, यह औसत 1 ° एलआर लंबाई (चित्रा 3 सी) की तुलना में मात्रा में कम था। पी1.25 स्थिति (चित्रा 3 डी) की तुलना में पी0 स्थिति के तहत 1 डिग्री एलआर और 2 डिग्री एलआर की संख्या में भारी कमी आई है। 1 ° एलआर घनत्व (बीजेडपीआर लंबाई के प्रति सेंटीमीटर 1 ° एलआर की संख्या) को पी1.25 स्थिति (चित्रा 3 ई) के सापेक्ष पी0 स्थिति के तहत नहीं बदला गया था। 2 ° एलआर घनत्व (1 ° LRs के BZ के प्रति सेंटीमीटर 2 ° LRs की संख्या) ने भी कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखाया (चित्रा 3E)। नतीजतन, आरएसए प्लास्टिसिटी में सहायक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एलआर के घनत्व का निर्धारण करना आवश्यक है।

अलग-अलग फॉस्फेट (पाई) व्यवस्था के तहत जड़ बालों के विकास का विश्लेषण
जड़ बालों के विकास पर पाई की आपूर्ति के प्रभाव का अध्ययन रोपाई की प्राथमिक जड़ में किया गया था। यह पाया गया कि जड़ बालों की लंबाई पीआई की बढ़ती सांद्रता के साथ 2.5 एमएम तक बढ़ी, लेकिन 5 एमएम और 10 एमएम पर घट गई। हालांकि, 20 एमएम पर, जड़ बालों की लंबाई निकट-चरम स्तर पर लौट आई (पूरक चित्रा 1)। अन्य सभी पाई आपूर्ति की तुलना में जड़ बालों की संख्या 0 एमएम पर काफी अधिक थी, जिसमें सबसे अधिक संख्या 20 एमएम (पूरक चित्र 1) देखी गई थी।

एराबिडोप्सिस के अलावा अन्य पौधों पर वर्तमान विधि का अनुप्रयोग
हमने एराबिडोप्सिस के अलावा अन्य पौधों पर वर्तमान विधि की व्यवहार्यता की जांच की है, मेडिकागो सैटिवा (अल्फाल्फा) को एक परीक्षण संयंत्र के रूप में लिया है। प्रोटोकॉल को दो पहलुओं की आवश्यकता के अनुसार संशोधित किया गया है: (1) बीज की सतह नसबंदी विधि, और (2) पॉलीप्रोपाइलीन जाल का छिद्र आकार (अब बड़ा, 1,000 μm)। सतह बीज नसबंदी और स्तरीकरण प्रोटोकॉल को हमेशा अध्ययन करने के लिए चयनित पौधों के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। अल्फाल्फा के लिए, वीक्स एट अल.19 द्वारा वर्णित चरणों का पालन किया गया था। सतह नसबंदी के बाद, बीजों को स्तरीकरण के लिए 7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उगाया गया था। उसके बाद, हमने जाल छिद्र आकार के संशोधन के साथ इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक ही प्रक्रिया का पालन किया। जैसा कि चित्रा 4 ए, बी में दिखाया गया है, प्लांटलेट अच्छी तरह से उगाए गए थे, जिसमें पाई की अलग-अलग आपूर्ति के तहत एक परिवर्तित आरएसए था। चित्रा 4 सी पाई पोषक तत्व समाधान के 1.25, 0 और 20 एमएम के तहत रूट सिस्टम प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करता है। अतिरिक्त पाई (20 एमएम) और कम पाई आपूर्ति ने पाई पर्याप्त (1.25 एमएम) स्थिति (नियंत्रण) (चित्रा 4 सी) की तुलना में जड़ प्रणाली के विकास को कम कर दिया। प्रोटोकॉल में वर्णित इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आरएसए को विभिन्न लक्षणों के लिए मैप किया जा सकता है। इसलिए, प्रोटोकॉल सरल, कुशल है, और चयनित पौधों की प्रजातियों के अनुसार आसानी से संशोधित किया जा सकता है। यह विभिन्न पोषक तत्वों की स्थिति के तहत विभिन्न पौधों की प्रजातियों के आरएसए का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रिया का योजनाबद्ध। योजनाबद्ध आरेख आरएसए मैपिंग के लिए विधि प्रोटोकॉल में शामिल प्रमुख चरणों को रेखांकित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: पौधे उगाने के लिए मैजेंटा बक्से में हाइड्रोपोनिक सेटअप का प्रदर्शन। (ए) सेटअप को इकट्ठा करने के लिए पॉली कार्बोनेट वेज के पायदान के साथ दो आयताकार टुकड़े (4 सेमी x 8 सेमी)। (बी) जाल की सतह का समर्थन करने के लिए नॉच के माध्यम से पॉली कार्बोनेट वेजेज को एक्स आकार में बदलने के माध्यम से एक दूसरे में इकट्ठा करना। (सी) एक 250 μm पॉलीप्रोपाइलीन जाल शीट (6 सेमी x 6 सेमी)। (डी) मैजेंटा बॉक्स में पॉली कार्बोनेट वेज की असेंबली का शीर्ष दृश्य। (ई) मीडिया से भरे मैजेंटा बॉक्स में पॉली कार्बोनेट वेज पर पॉलीप्रोपाइलीन जाल की असेंबली। (च) एराबिडोप्सिस पौधों का एक प्रदर्शन जाल पर अंकुरित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इस फेनोटाइपिंग विधि का उपयोग करके अलग-अलग पोषक तत्वों की स्थिति (पाई की कमी [0 एमएम] और पर्याप्त [1.25 एमएम]) के तहत विशिष्ट आरएसए मॉड्यूलेशन का प्रदर्शन। एराबिडोप्सिस (कोल -0) रोपाई को 5 दिनों के लिए 0.5x MS मीडिया में हाइड्रोपोनिक रूप से उगाया जाता है, और उसके बाद Pi की कमी और पर्याप्त आपूर्ति (क्रमशः 0 और 1.25 mM) के अधीन किया जाता है और 7 दिनों के लिए उगाया जाता है, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। (ए) पॉलीप्रोपाइलीन जाल (500 μm) से अलग-अलग पौधों को बाहर निकाला जाता है और एक गोल कला ब्रश और पानी की मदद से आगर पेट्री प्लेटों पर फैलाया जाता है। आरएसए लक्षणों के डेटा को (बी) प्राथमिक जड़ (पीआर) लंबाई, कुल रूट लंबाई (टीआरएल), ब्रांचिंग जोन (बीजेड), (सी) औसत (एवी) पहले क्रम पार्श्व जड़ लंबाई (1 डिग्री एलआर लंबाई), औसत (एवी) दूसरे क्रम पार्श्व जड़ लंबाई (2 डिग्री एलआर लंबाई), (डी) 1 डिग्री एलआर और 2 डिग्री एलआर की संख्या, और (ई) 1 डिग्री एलआर और 2 डिग्री एलआर घनत्व के लिए प्रस्तुत किया जाता है। मूल्य एसई ± साधन हैं; n = 21. इस आंकड़े को शुक्ला एट अल.1 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एराबिडोप्सिस के अलावा अन्य पौधों के लिए इस विधि की प्रयोज्यता को दिखाने के लिए एक उदाहरण के रूप में मेडिकागो सैटिवा (अल्फाल्फा) जड़ प्रणाली का प्रदर्शन। (बी) मैजेंटा बॉक्स का शीर्ष दृश्य पॉलीप्रोपाइलीन जाल (1,000 μm का छिद्र आकार) पर शूट के उद्भव को दर्शाता है। (ग) इस आरएसए फेनोटाइपिंग विधि का उपयोग करके अलग-अलग पोषक तत्वों की स्थिति (पाई की कमी [0 एमएम], अतिरिक्त पाई [20 एमएम], और पर्याप्त या नियंत्रण [1.25 एमएम]) के तहत अल्फाल्फा मॉड्यूलेशन की विशिष्ट रूट सिस्टम आर्किटेक्चर (आरएसए)। अल्फाल्फा रोपाई को 5 दिनों के लिए 0.5x MS मीडिया में हाइड्रोपोनिक रूप से उगाया जाता है, पाई की कमी, पर्याप्त और अतिरिक्त आपूर्ति (क्रमशः 0, 1.25, और 20 mM) के अधीन किया जाता है, और 7 दिनों के लिए उगाया जाता है। अलग-अलग पौधों को पॉलीप्रोपाइलीन जाल (1,000 μm) से बाहर निकाला जाता है और एक कला ब्रश और पानी की मदद से सी में दिखाए गए अनुसार, आगर पेट्री प्लेटों पर फैलाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्र 1: विभिन्न अतिरिक्त पाई सांद्रता जड़ बालों के विकास को नियंत्रित करती है। डब्ल्यूटी रोपाई को हाइड्रोपोनिक रूप से उगाया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है। (ए) प्राथमिक जड़ के सिरे से 1-2 सेमी खंड को काटा गया और 10% ग्लिसरॉल के साथ एक स्लाइड पर रखा गया, और सिरे से 5 मिमी क्षेत्र को जड़ बाल संख्या और लंबाई के लिए प्रलेखित किया गया था। डेटा (बी) जड़ बालों की लंबाई और (सी) प्राथमिक रूट टिप के 5 मिमी क्षेत्र में जड़ बालों की संख्या के लिए प्रस्तुत किया जाता है। मूल्य एसई ± साधन हैं; n = 10 (B और C)। छात्र के युग्मित टी-टेस्ट के अनुसार अलग-अलग अल्फा अक्षरों वाले सलाखों में काफी अंतर होता है (पी ≤ 0.05)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस काम ने सरल प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके आरएसए मानचित्रण का प्रदर्शन किया। इस विधि का उपयोग करके, फेनोटाइपिक परिवर्तन परिष्कृत स्तर पर दर्ज किए जाते हैं। इस रणनीति का लाभ यह है कि शूट भाग कभी भी मीडिया के संपर्क में नहीं आता है, इसलिए प्लांटलेट्स का फेनोटाइप मूल है। इस विधि में प्रोटोकॉल में वर्णित प्लांटलेट्स को विकसित करने के लिए एक हाइड्रोपोनिक सिस्टम स्थापित करना शामिल है। फिर, प्रत्येक प्लांटलेट को बरकरार रखा जाता है और एक आगर से भरी पेट्री प्लेट पर रखा जाता है। रूट सिस्टम को तब एक कला ब्रश का उपयोग करके मैन्युअल रूप से फैलाने की अनुमति दी जाती है, और इमेजजे सॉफ्टवेयर 1,10,11,12 के साथ विश्लेषण करने के लिए तस्वीरें ली जाती हैं।

बीज अंकुरण के लिए बैक्टीरिया, कवक और वायरस को हटाने के लिए बीज की सतह नसबंदी की आवश्यकता होती है। अल्कोहल - 70% इथेनॉल - बीज की सतहों को निष्फल करने के लिए उपयोग किया जाता है। उन्हें नष्ट किए बिना बीजों को कीटाणुरहित करने के लिए, शराब नसबंदी के उपचार के समय का सावधानीपूर्वक पालन करने की आवश्यकता है। जब शराब नसबंदी अधिक हो जाती है तो बीज अंकुरण कम हो जाता है। उपचार का समय विभिन्न पौधों की प्रजातियों के साथ भिन्न होता है (उदाहरण के लिए, एराबिडोप्सिस के लिए, समय सीमा केवल 3 मिनट 1,10,11,12,20 है, जबकि मेडिकागो सैटिवा के लिए, यह 5 मिनट 19 है। विश्लेषण के लिए आरएसए के सुचारू चयन की सुविधा के लिए, प्रति जाल या मैजेंटा बॉक्स में बीजों की संख्या को सीमित करना महत्वपूर्ण है, ताकि जड़ प्रणाली के उलझाव को रोका जा सके। यह प्रति जाल कम संख्या में बीज का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रति जाल चार बीजों का उपयोग करने से जड़ प्रणालियों के मजबूत विकास और विकास की अनुमति देते हुए उलझाव के जोखिम को कम करने में मदद मिल सकती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रति जाल बीज की इष्टतम संख्या विशिष्ट पौधों की प्रजातियों और आरएसए विश्लेषण के लक्ष्यों पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, यदि किसी प्रयोग को आरएनए अलगाव जैसी आगे डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण आवश्यकताओं के लिए ऊतक की आवश्यकता होती है, तो इस मामले में, थोक बुवाई की सिफारिश की जाती है (एराबिडोप्सिस के मामले में प्रति जाल 100 बीज) 1,10,11,12। जाल से पौधे चुनना एक नाजुक प्रक्रिया है जिसके लिए अत्यधिक देखभाल और ध्यान देने की आवश्यकता होती है 1,10,11. नाजुक पौधों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए इस कार्य को धीरे-धीरे, धीरे-धीरे और सावधानी से करना महत्वपूर्ण है। जाल से पौधे चुनने के लिए, पौधों को धीरे से लेकिन मजबूती से पकड़ने के लिए महीन चिमटी या बल का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। जड़ प्रणालियों को परेशान करने या पौधों को कोई नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए प्लांटलेट्स को सावधानीपूर्वक जाल से बाहर निकाला जाना चाहिए। धैर्य रखना आवश्यक है और यह सुनिश्चित करने के लिए जाल से प्रत्येक पौधे को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए समय निकालें कि वे प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं हैं। यह एक क्रमिक प्रक्रिया है जिसे प्रयोग की सफलता सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे, धीरे-धीरे और सावधानी से किया जाना चाहिए। प्लांटलेट्स के आरएसए को सटीक रूप से मापने के लिए, सटीक माप1,10,11 की अनुमति देने के लिए पेट्री प्लेट पर एक पैमाने को चिह्नित करना महत्वपूर्ण है। यह एक ज्ञात दूरी पर पेट्री प्लेट पर एक रेखा खींचने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करके किया जा सकता है, जैसे कि 1 सेमी या 2 सेमी। पैमाने को एक दृश्यमान स्थान में पेट्री प्लेट के किनारे पर रखा जाना चाहिए। ब्रश का उपयोग करते समय, आरएसए को फैलाते समय अत्यधिक सावधानी बरतना भी आवश्यक है। प्राथमिक जड़ को पेट्री प्लेट के केंद्र में सावधानीपूर्वक तैनात किया जाना चाहिए, और पार्श्व जड़ों को प्राथमिक जड़ के दोनों किनारों पर फैलाया जाना चाहिए। फैलने की सुविधा के लिए रूट सिस्टम को आंशिक रूप से पानी में डूबा होना चाहिए। प्रत्येक नई पेट्री प्लेट को मापने के लिए, हर बार इमेजजे सॉफ्टवेयर में स्केल सेट करना होगा।

आरएसए विश्लेषण1 की दक्षता, गैर-आक्रामकता और प्रभावशीलता में सुधार के लिए कुछ संशोधनों को नियोजित किया जा सकता है। ऐसा ही एक सुधार पौधों को पकड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले पॉलीप्रोपाइलीन जाल के छिद्र आकार को बदलना है। जाल के छिद्र आकार को अध्ययन की जा रही पौधों की प्रजातियों की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है और रूट सिस्टम 1,10,11,12 के विकास और विकास को अनुकूलित करने के लिए। उदाहरण के लिए, एक बड़ा जाल छिद्र आकार (500 μm) हाइपोकोटाइल को काटे बिना पूरे रोपाई के चिकनी चयन की सुविधा प्रदान करता है, जिसे पहले10,11,12 का अभ्यास किया गया था। इसके अलावा, एक बड़ा छिद्र आकार बड़ी पौधों की प्रजातियों आरएसए के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है, जबकि एक छोटा छिद्र आकार छोटे पौधों की प्रजातियों के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। एक और संशोधन जो किया जा सकता है वह एल्यूमीनियम पन्नी में पॉलीप्रोपाइलीन जाल को लपेटना है ताकि इसे झुकने से रोका जा सके। यह जाल के आकार और अखंडता को बनाए रखने में मदद कर सकता है, जिससे यह फ्लैट फर्श मैट्रिक्स के रूप में सेवा करने के लिए उपयुक्त हो जाता है। इन संशोधनों के अलावा, आरएसए विश्लेषण के दौरान उत्पन्न होने वाले किसी भी मुद्दे को हल करने के लिए अन्य समस्या निवारण तकनीकों को नियोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि प्लांटलेट्स अपेक्षा के अनुसार बढ़ या विकसित नहीं हो रहे हैं, तो पर्यावरणीय परिस्थितियों, जैसे तापमान, आर्द्रता और प्रकाश के स्तर को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है। यदि जड़ प्रणाली उलझी हुई है, तो प्रति जाल बीज की संख्या को कम करना आवश्यक हो सकता है, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है।

आरएसए विश्लेषण के मुख्य लाभों में से एक यह है कि यह आगर की आवश्यकता के बिना पौधे की जड़ प्रणालियों का अध्ययन करने की अनुमति देता है। आगर का उपयोग आमतौर पर पौधे के ऊतक संवर्धन और बीज अंकुरण प्रयोगों में एक ठोस एजेंट के रूप में किया जाता है। हालांकि, आगर का उपयोग मौलिक संदूषण का परिचय दे सकता है जो संभावित रूप से कलाकृतियों को उत्पन्न कर सकता है और परिणामों की सटीकता को प्रभावित करसकता है। आगर की आवश्यकता को छोड़कर, आरएसए विश्लेषण आगर-व्युत्पन्न मौलिक संदूषण के जोखिम और कलाकृतियों की क्षमता को समाप्त करता है। यह आरएसए विश्लेषण को पौधे की जड़ प्रणालियों 1,3,10,11,12 का अध्ययन करने के लिए एक अधिक विश्वसनीय और सटीक तरीका बनाता है। उदाहरण के लिए, पार्श्व जड़ घनत्व पर पाई के अभाव के प्रभाव कई विरोधाभासी रिपोर्टों का विषय रहे हैं। यह बताया गया है कि पीआई कम 6,8 होने पर एलआर घनत्व बढ़ जाता है। इसके विपरीत, पार्श्व जड़ घनत्व में गिरावट पाई की कमी वाली स्थितियों 3,13,16 में भी पाई गई है। इन विसंगतियों को आगर-आधारित विकास मीडिया प्रणाली के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जिसमें श्रमिक पाई संदूषण10 की अलग-अलग डिग्री के साथ मीडिया को जेलीफाई करने के लिए आगर के विभिन्न ब्रांडों का उपयोग करते हैं। फिर, आरएसए पर जेडएन की कमी के प्रभाव को चित्रित करने की मांग करने वाले प्रयोगों को एगर-आधारित पेट्री-प्लेट विधि का उपयोग करके पर्याप्त रूप से आयोजित नहीं किया जा सकता है, क्योंकि एगर-आधारित गेलिंग माध्यम में जेडएन संदूषण11 भी शामिल है। इसलिए, एगर-आधारित गेलिंग माध्यम का उपयोग करके पोषक तत्वों की कमी की जांच करने के लिए आरएसए विश्लेषण करना उपयुक्त नहीं हो सकता है। दूसरा, आगर-आधारित गेलिंग मीडिया पर उगाए गए प्लांटलेट उतनी जल्दी विकसित नहीं होते हैं जितनी जल्दी हाइड्रोपोनिक रूप से खेती की जाती है। तीसरा, क्योंकि आरएसए आमतौर पर एक एगर माध्यम में एम्बेडेड होता है, कई रूट सुविधाओं को सही ढंग से प्रदर्शित नहीं किया जाता है। चौथा, आरएसए को माध्यम से हटाने से अक्सर आरएसए को काफी नुकसान होता है और यह एक विनाशकारी नमूना तकनीक प्रदान करता है।

जैन एट अल.10 द्वारा प्रकाशित पिछली हाइड्रोपोनिक तकनीक में 250 μm के पॉलीप्रोपाइलीन जाल आकार का उपयोग किया गया था, जिसमें संकरे छिद्र थे जो बरकरार आरएसए को बाहर निकालने में सक्षम नहीं थे। नतीजतन, उस विशेष मामले में, हमें आरएसए को अलग करने के लिए हाइपोकोटिल क्षेत्र से प्लांटलेट्स को काटना पड़ा, जिससे इसे विनाशकारी नमूना विधि10,11,12 में बदल दिया गया। मौजूदा विधि को एक बड़े छिद्र आकार (500 μm) के साथ एक पॉलीप्रोपाइलीन जाल का उपयोग करके इसे गैर-विनाशकारी बनाने के लिए सुधारकिया गया है जो आरएसए1 को कोई नुकसान पहुंचाए बिना पूरे एराबिडोप्सिस पौधों को बरकरार रखने की अनुमति देता है। यह ध्यान देने योग्य है कि हम प्लांटलेट के प्रकार के आधार पर पॉलीप्रोपाइलीन जाल के छिद्र आकार को हमेशा समायोजित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, चित्रा 4 दिखाता है कि विभिन्न पौधों के आरएसए को मैप करने के लिए एक समान दृष्टिकोण का उपयोग कैसे किया जा सकता है, जैसे कि मेडिकागो सैटिवा (अल्फाल्फा)। हमने मेडिकागो रूट सिस्टम को समायोजित करने के लिए 1 मिमी के पॉलीप्रोपाइलीन छिद्र आकार का विकल्प चुना है।

इस प्रणाली का एक नुकसान जड़ बालों का विकास हो सकता है, जो अक्सर एगर प्लेट सिस्टम की तुलना में हाइड्रोपोनिक सिस्टम के तहत नहीं पनपते हैं। प्राथमिक कारण ठोस मीडिया के बजाय तरल मीडिया में पोषक तत्वों की आसान उपलब्धता है। भले ही हमने एक ही प्रणाली का उपयोग करके जड़ बालों (मजबूत नहीं) के विकास को देखा और परिणाम प्राप्त किए (पूरक चित्र 1)। पाई की उपलब्धता जड़ बालों के विकास को दृढ़ता से प्रभावित करतीहै 10,11. इसमें, जड़ बालों की लंबाई शुरू में 2.5 एमएम तक बढ़ी, और फिर गिरावट आई।

कुल मिलाकर, सिस्टम के प्रमुख फायदे हैं: (1) यह एक सरल और सटीक विधि है जिसे किसी भी परिष्कृत उच्च अंत उपकरण की आवश्यकता नहीं है; (2) विधि अपनी हाइड्रोपोनिक प्रकृति के कारण पौधों के तेजी से विकास की अनुमति देती है; (3) यह एक गैर-विनाशकारी विधि है; (4) आरएसए का मैन्युअल प्रसार प्रत्येक विशेषता के उचित प्रदर्शन की अनुमति देता है, छिपे हुए आरएसए का खुलासा करता है, उपयोगकर्ता को पूर्ण नियंत्रण प्रदान करता है; और (5) विधि एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजिंग सॉफ्टवेयर (यानी, इमेजजे) को नियोजित करती है, जो उपयोग करने के लिए भी सरल है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम इस शोध का समर्थन करने के लिए अमेरिकी कृषि विभाग (अनुदान 58-6406-1-017) को स्वीकार करते हैं। हम डब्ल्यूकेयू जैव प्रौद्योगिकी केंद्र, वेस्टर्न केंटकी विश्वविद्यालय, बॉलिंग ग्रीन, केवाई, यूएसए और निदेशक, सीएसआईआर सेंट्रल इंस्टीट्यूट ऑफ मेडिसिनल एंड एरोमैटिक प्लांट्स, लखनऊ, भारत को उपकरण सुविधाएं और सहायता प्रदान करने के लिए भी स्वीकार करते हैं (सीएसआईआर सीमैप पांडुलिपि संचार संख्या सीआईएमएपी / पीयूबी / 2022/103)। एसएस सेंट जोसेफ विश्वविद्यालय, फिलाडेल्फिया, संयुक्त राज्य अमेरिका से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0) Lehle Seeds WT-02 Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes Amazon or any other vendor Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera Leica Microsystems LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software ImageJ ImageJ V
 1.8.0
Magenta box GA-7 Fisher Scientific  50-255-176
Medicago sativa Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm) USA Scientific 8609-0215 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera Cannon or Nikon Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar Sigma-Aldrich A3301 Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets Amazon 1 mm  thick
Polypropylene Mesh Amazon Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner Epson Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)

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प्लांट रूट सिस्टम आर्किटेक्चर लक्षणों के मानचित्रण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल
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Shukla, D., Trivedi, P. K., Sahi, S. A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits. J. Vis. Exp. (192), e64876, doi:10.3791/64876 (2023).

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