Summary
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) ट्यूमर बच्चों में कैंसर से संबंधित मौत का प्रमुख कारण हैं, और नैदानिक परीक्षणों में रोगियों के लिए लोकोरीजनल प्रतिरक्षा-आधारित उपचारों का तेजी से परीक्षण किया जा रहा है। यह प्रोटोकॉल सीएनएस ट्यूमर को लक्षित करने वाले इम्यूनोथेराप्यूटिक इन्फ्यूजन के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन के लिए चूहों में लोकोरीजनल कैनुला प्रत्यारोपण के तरीकों का वर्णन करता है।
Abstract
बाल चिकित्सा सीएनएस ट्यूमर बच्चों में कैंसर से संबंधित अधिकांश मौतों के लिए जिम्मेदार हैं और कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी में प्रगति के बावजूद खराब प्रोग्नोस हैं। चूंकि कई ट्यूमर में प्रभावोत्पादक उपचार की कमी होती है, इसलिए इम्यूनोथेरेपी जैसे अधिक आशाजनक चिकित्सीय विकल्प विकसित करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता होती है; सीएनएस ट्यूमर के खिलाफ निर्देशित चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी सेल थेरेपी का उपयोग विशेष रुचि का है। सेल सतह लक्ष्य जैसे कि बी 7-एच 3, आईएल 13 आरए 2, और डिसियालोगैंग्लियोसाइड जीडी 2 कई बाल चिकित्सा और वयस्क सीएनएस ट्यूमर की सतह पर अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं, जिससे इन और अन्य सतह लक्ष्यों के खिलाफ सीएआर टी सेल थेरेपी का उपयोग करने का अवसर मिलता है। प्रीक्लिनिकल मुराइन मॉडल में सीएआर टी कोशिकाओं के बार-बार लोकोरीजनल डिलीवरी का मूल्यांकन करने के लिए, एक निवास कैथेटर प्रणाली स्थापित की गई थी जो वर्तमान में मानव नैदानिक परीक्षणों में उपयोग किए जा रहे कैथेटर को पुन: उत्पन्न करती है। स्टीरियोटैक्टिक डिलीवरी के विपरीत, निवास कैथेटर प्रणाली कई सर्जरी के उपयोग के बिना बार-बार खुराक की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल एक निश्चित गाइड कैनुला के इंट्राट्यूमरल प्लेसमेंट का वर्णन करता है जिसका उपयोग बाल चिकित्सा मस्तिष्क ट्यूमर के ऑर्थोटोपिक मुराइन मॉडल में सीरियल सीएआर टी सेल इन्फ्यूजन का सफलतापूर्वक परीक्षण करने के लिए किया गया है। चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन और एनग्राफमेंट के बाद, एक निश्चित गाइड कैनुला का इंट्राट्यूमरल प्लेसमेंट एक स्टीरियोटैक्टिक उपकरण पर पूरा किया जाता है और स्क्रू और ऐक्रेलिक राल के साथ सुरक्षित किया जाता है। उपचार कैनुला को फिर बार-बार सीएआर टी सेल डिलीवरी के लिए निश्चित गाइड कैनुला के माध्यम से डाला जाता है। गाइड कैनुला के स्टीरियोटैक्टिक प्लेसमेंट को सीएआर टी कोशिकाओं को सीधे पार्श्व वेंट्रिकल या मस्तिष्क के अन्य स्थानों में पहुंचाने के लिए समायोजित किया जा सकता है। यह मंच इन विनाशकारी बाल चिकित्सा ट्यूमर के लिए सीएआर टी कोशिकाओं और अन्य नवीन चिकित्सीय के बार-बार इंट्राक्रैनील इन्फ्यूजन के प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए एक विश्वसनीय तंत्र प्रदान करता है।
Introduction
कीमोथेरेपी, रेडियोथेरेपी और सर्जरी में सुधार के बावजूद, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) ट्यूमर बाल चिकित्सा1 में सबसे घातक घातक हैं, जो अधिक सफल परिणामों के साथ नए दृष्टिकोण ों की महत्वपूर्ण आवश्यकता को रेखांकित करते हैं। इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति के साथ, दत्तक सेलुलर थेरेपी (एसीटी) दृष्टिकोण ने विभिन्न कैंसर, विशेष रूप से हेमेटोलॉजिकल मैलिग्नेंसी2 में आशाजनक परिणाम दिखाए हैं। चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी सेल थेरेपी, एक विशिष्ट प्रकार का एसीटी, ट्यूमर-टारगेटिंग टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए टी कोशिकाओं की विशिष्टता को पुनर्निर्देशित करकेहानिकारक कोशिकाओं को पहचानने और मारने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की प्राकृतिक क्षमता का लाभ उठाता है। सीएआर टी सेल थेरेपी ने ल्यूकेमिया और लिम्फोमा4 के उपचार में पर्याप्त सफलता का प्रदर्शन किया है, जिससे यह एक आशाजनक इम्यूनोथेराप्यूटिक दृष्टिकोण बन गया है और ठोस ट्यूमर में इसकी जांच को प्रोत्साहित कर रहा है। हालांकि, इस प्रकार, अब तक, ठोस ट्यूमर में सीएआर टी सेल थेरेपी ने बहुत कम नैदानिक सफलता हासिल की है और कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है, जैसे कि अक्षम ट्यूमर प्रवेश, सीमित लक्षित एंटीजन और दमनकारी ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट5।
हाल के नैदानिक परीक्षणों ने बाल चिकित्सा सीएनएस ट्यूमर के लिए सीएआर टी सेल थेरेपी का मूल्यांकन शुरू कर दिया है, जो प्रारंभिक रिपोर्ट 6,7,8 में टी सेल गतिविधि की अवधारणा और प्रारंभिक साक्ष्य का प्रमाण प्रदान करता है। जबकि अधिकांश प्रारंभिक प्रीक्लिनिकल डेटा सीएआर टी कोशिकाओं के अंतःशिरा वितरण पर केंद्रित थे, हाल के प्रीक्लिनिकल सबूतों ने सीएनएस9,10 में लोकोरीजनल डिलीवरी की श्रेष्ठता का सुझाव दिया है, जिसका उपयोग कईनैदानिक परीक्षणों 6,7,8,11 में सफलतापूर्वक किया गया है।. आज तक के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में सीएनएस में सीएआर टी कोशिकाओं के लोकोरीजनल डिलीवरी को शामिल किया गया है, जो स्टीरियोटैक्टिकल रूप से 9,10 वितरित सीएआर टी कोशिकाओं की एकल इंट्राक्रैनील खुराक पर निर्भर है। हालांकि, मनुष्यों में नैदानिक परीक्षणों में सीएनएस 6,7,8,11 में सीएआर टी कोशिकाओं के बार-बार इन्फ्यूजन की आवश्यकता होती है, जो प्रीक्लिनिकल विकास में कई बार-बार इन्फ्यूजन का मूल्यांकन करने की आवश्यकता को रेखांकित करता है। इस प्रक्रिया का लक्ष्य बाल चिकित्सा मस्तिष्क ट्यूमर के ऑर्थोटोपिक मुराइन मॉडल में कैथेटर का उपयोग करके सीरियल सीएआर टी सेल इन्फ्यूजन का सफलतापूर्वक परीक्षण करना है। इस तकनीक का लाभ बार-बार इंट्रा-सीएनएस उपचार प्रदान करने के लिए कई शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं से बचना है। कैनुला का उपयोग मुख्य रूप से न्यूरोट्रांसमीटर के माइक्रोडायलिसिस नमूने और कृन्तकों में तंत्रिका विज्ञान और व्यवहार अनुसंधान में न्यूरोएक्टिव पदार्थों के वितरण के लिए किया गयाहै, जिसमें कैंसर विरोधी चिकित्सीय के वितरण के लिए उनके उपयोग की सीमित रिपोर्ट है। पूर्व रिपोर्टों के आधार पर, यह प्रोटोकॉल सीएनएस ट्यूमर के जेनोग्राफ्ट मुराइन मॉडल में सीएआर टी कोशिकाओं को वितरित करने के लिए एक स्टीरियोटैक्टिकल रूप से रखी गई प्रवेशनी प्रणाली का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल का उपयोग न्यूरोलॉजिकल या न्यूरो-ऑन्कोलॉजिक विकारों के मुराइन मॉडल में अतिरिक्त चिकित्सीय का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, और नवीन चिकित्सीय का परीक्षण करने में सहायक हो सकता है जहां प्रभावकारिता के लिए रक्त-मस्तिष्क बाधा को दरकिनार करना महत्वपूर्ण है।
Protocol
सभी प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं को फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल (आईएसी 19-000907) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, जो एएएएलएसी द्वारा मान्यता प्राप्त है। इस अध्ययन में ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट ट्यूमर के साथ 6-12 सप्ताह के एनओडी सिड गामा (एनएसजी) चूहों का उपयोग किया गया; हालाँकि, प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी माउस तनाव पर किया जा सकता है। एनएसजी चूहों को बाँझ बाधा स्थितियों में रखा गया था और बाँझ जैव सुरक्षा अलमारियों के तहत सर्जरी की गई थी। जब ट्यूमर कोशिकाओं या टी कोशिकाओं जैसी मानव सामग्री का उपयोग किया जा रहा है, तो प्रक्रियाओं और हैंडलिंग को एबीएसएल -2 जैव सुरक्षा अलमारियों में पूरा किया जाना चाहिए।
1. सर्जरी के लिए माउस तैयार करना
- माउस को 1 एल / मिनट की ऑक्सीजन प्रवाह दर पर आइसोफ्लुरेन (2-4%) के साथ एक प्रेरण कक्ष में एनेस्थेटाइज करें जब तक कि संज्ञाहरण का पर्याप्त विमान (लगभग 5 मिनट) तक नहीं पहुंच जाता।
- निकटतम 0.1 ग्राम के पैमाने का उपयोग करके माउस का वजन करें और चमड़े के नीचे धीमी गति से रिलीज (एसआर), ब्यूप्रेनोर्फिन (1 मिलीग्राम / किग्रा), या अन्य एनाल्जेसिक का प्रबंधन करें।
नोट: एसआर ब्यूप्रेनोर्फिन 72 घंटे के लिए एनाल्जेसिया प्रदान करता है। - इलेक्ट्रिक क्लिपर या डिपिलेटरी एजेंटों का उपयोग करके माउस के सिर के शीर्ष पर फर को शेव करें।
- स्टीरियोटैक्टिक आर्म के निचले हिस्से को धीरे से खोलने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें और फोर्सप्स का उपयोग करके गाइड कैनुला डालें। कैनुला को सुरक्षित करने के लिए बांह पर पेंच कस दें ताकि कैनुला के सफेद प्लास्टिक के हिस्से का लगभग 1/2 से 2/3 हिस्सा उद्घाटन के नीचे से बाहर निकल जाए, साथ ही कैनुला की पूरी 5 मिमी धातु की लंबाई भी हो।
- स्टीरियोटेक्सिक उपकरण के बाइट बार में माउस के शीर्ष दांतों को डालें और सुरक्षित करें। नाक शंकु को आगे खींचें और इसे कस ें, यह सुनिश्चित करें कि माउस आइसोफ्लुरेन को साँस ले रहा है।
- अत्यधिक दबाव से बचने के लिए कान के कफ या कान की सलाखों का उपयोग करके गर्म स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर माउस माउंट करें।
नोट: वार्म ट्रे में एक रेक्टल थर्मामीटर डाला जाना चाहिए, और प्रक्रिया के दौरान माउस के सामान्य शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए वार्मिंग ट्रे को समायोजित करना चाहिए। - एक कपास युक्त एप्लिकेटर का उपयोग करके दोनों आंखों पर बाँझ नेत्र मरहम लागू करें।
- एक पैड या एप्लिकेटर पर पोविडोन-आयोडीन के साथ सर्जिकल साइट को पोंछें, इसके बाद एक अल्कोहल पैड। इस प्रक्रिया को कुल तीन बार करें।
- प्रक्रिया शुरू करने से पहले, पर्याप्त बेहोशी का आकलन करने के लिए बल के साथ पैर की अंगुली की चुटकी करें।
2. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया
नोट: सर्जिकल प्रक्रिया के सभी पहलू निष्फल उपकरणों और सड़न रोकनेवाली तकनीकों का उपयोग करते हैं। चूहे प्रक्रिया की अवधि के दौरान आइसोफ्लुरेन (2-4%) के साथ संज्ञाहरण के तहत जारी रहते हैं, लगभग 10-20 मिनट।
- धीरे से बल के साथ कानों के बीच खोपड़ी उठाएं। बाँझ कैंची का उपयोग करके, खोपड़ी के समानांतर उठाई गई खोपड़ी को काटें और खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा के एक अंडाकार फ्लैप (लंबाई में 0.75-1 सेमी) को हटा दें।
नोट: कैंची को एक साफ, अंडाकार आकार का उद्घाटन प्रदान करने और आसपास की त्वचा और ऊतक को अनावश्यक नुकसान को रोकने के लिए स्केलपेल पर पसंद किया जाता है। - आवश्यकतानुसार अत्यधिक रक्तस्राव को धीमा करने में मदद करने के लिए स्केलपेल या कपास से भरे स्वैब और हेमोस्टैटिक कपास गोली का उपयोग करके प्रावरणी को दूर करें।
नोट: बाँझ कपास की नोक के लकड़ी के किनारे का उपयोग करना प्रावरणी को भी दूर कर सकता है और अत्यधिक रक्तस्राव से बचने में मदद कर सकता है। - लैंडमार्क ब्रेग्मा और लैम्ब्डा की पहचान करें, खोपड़ी पर संबंधित पूर्ववर्ती और पीछे के निशान जहां कपाल प्लेटेंमिलती हैं।
नोट: हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ उजागर खोपड़ी के शीर्ष को पोंछकर पहचान को बढ़ाया जा सकता है। - ऐक्रेलिक को संलग्न करने के लिए एक सतह बनाने के लिए स्केलपेल का उपयोग करके खोपड़ी को धीरे से स्कोर करें। स्कोरिंग में एक दूसरे के 90 ° कोण ों पर लगभग 0.5-1 सेमी लंबाई की कई रैखिक रेखाएं शामिल होनी चाहिए।
- स्टीरियोटैक्सिक आर्म का उपयोग करके, कैनुला को रुचि के मील के पत्थर (ब्रेग्मा या लैम्ब्डा) में स्थानीयकृत करें। एक बार स्थानीयकृत होने के बाद, खोपड़ी की सतह से 1-2 मिमी ऊपर कैनुला टिप उठाएं और वांछित निर्देशांक पर जाएं। इंट्राट्यूमरल इंजेक्शन के लिए, यह ट्यूमर प्लेसमेंट के समान ए / पी और एम / एल निर्देशांक का उपयोग करता है।
- उजागर खोपड़ी पर, उस क्षेत्र से दूर जहां प्रवेशनी प्रवेश करेगी, 18 ग्राम सुई या सर्जिकल ड्रिल के साथ दो पेंच छेद बनाएं। सुनिश्चित करें कि प्रवेशनी के लिए पर्याप्त जगह शामिल करने के लिए छेद ों को जगह दी गई है। ड्रिल बिट का उपयोग करके, पेंच छेद के माध्यम से मोड़ें जब तक कि वे खोपड़ी पर पकड़ न लें। एक फ्लैट-टिंप स्क्रूड्राइवर का उपयोग करके छेद में दो स्क्रू डालें और बांधें। फिर, धीरे से पेंच को ऊपर खींचें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे सुरक्षित हैं।
नोट: स्क्रू को तब तक न डालें जब तक कि वे खोपड़ी के साथ फ्लश न हों, या वे नीचे माउस मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकते हैं। पेंच और खोपड़ी के बीच कम से कम 1-2 मिमी का अंतर छोड़ दें। - 18 ग्राम सुई या सर्जिकल ड्रिल का उपयोग करके, पहचाने गए निर्देशांक पर खोपड़ी के माध्यम से ड्रिल करें ताकि कैनुला डालने के लिए एक छेद बनाया जा सके।
- स्टीरियोटैक्टिक आर्म का उपयोग करके, कैनुला को वांछित डी / वी समन्वय तक कम करें।
नोट: कैनुला आरोपण के डी / वी समन्वय को डमी और उपचार प्रवेशनी की प्रक्षेपण लंबाई के लिए जिम्मेदार होना चाहिए, और ट्यूमर कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन की तुलना में अधिक सतही हो सकता है (चित्रा 1)। - चीनी मिट्टी के बरतन 12-वेल प्लेट में, ऐक्रेलिक राल पाउडर (लगभग 0.3 ग्राम) और ऐक्रेलिक राल तरल की 10-15 बूंदों (लगभग 0.5-0.75 एमएल) के साथ एक अच्छी तरह से भरें। यह एक चिपचिपा सफेद रंग की सामग्री का उत्पादन करता है। मिश्रण को 1 एमएल सिरिंज में खींचें और इसका उपयोग खोपड़ी को कोट और कवर करने के लिए करें, कैनुला और स्क्रू के आसपास के रिक्त स्थान को भरें।
नोट: चिपचिपा पदार्थ समय के साथ सीमेंट में कठोर हो जाता है, इसलिए मिश्रण के बाद इस चरण को तुरंत पूरा किया जाना चाहिए। - जबकि सीमेंट अभी भी व्यवहार्य है, स्टीरियोटैक्टिक बांह पर पेंच को ढीला करें और धारक से कैनुला को धीरे से छोड़ने के लिए नीचे की ओर उद्घाटन में एक स्पैटुला का उपयोग करें और धीरे-धीरे स्टीरियोटैक्टिक आर्म को माउस से दूर ले जाएं।
- एक बार सीमेंट पूरी तरह से सूख जाने के बाद, डमी कैनुला को गाइड कैनुला में डालें और घड़ी की दिशा में मोड़कर इसे कसकर सुरक्षित करें।
- एक बार प्रक्रिया पूरी हो जाने के बाद, माउस को सावधानीपूर्वक निगरानी करने के लिए अपने गर्म घर के पिंजरे में वापस रखें, पर्याप्त वसूली सुनिश्चित करें और कॉलोनी में लौटने से पहले किसी भी पोस्ट-प्रक्रिया अवलोकन को रिकॉर्ड करें, जिसमें माउस पूरी तरह से होश में आ गया है।
नोट: आमतौर पर हीटिंग पैड पर पिंजरे के केवल आधे हिस्से को रखने की सिफारिश की जाती है ताकि जानवर को ओवरहीटिंग से बचने के लिए कूलर साइड में जाने की अनुमति मिल सके। - आवश्यकतानुसार अतिरिक्त एनाल्जेसिक का प्रबंधन करें यदि चूहे ऑपरेशन के बाद दर्द का संकेत देने वाले व्यवहार प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि मेलोक्सिकैम 5 मिलीग्राम / किग्रा चमड़े के नीचे 3 दिनों तक दैनिक रूप से एक बार वितरित किया जाता है।
3. सीएआर टी सेल तैयार करना
- सेल काउंटर का उपयोग करके पूर्व-संक्रमित सीएआर टी सेल एकाग्रता को मापें।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज प्री-ट्रांसक्रिप्टेड टी कोशिकाएं।
- वैक्यूम एस्पिरेशन सिस्टम पर एक बाँझ पाश्चर पाइप का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और फॉस्फेटे बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में गोली को वांछित एकाग्रता तक फिर से निलंबित करें। विशिष्ट वितरण वॉल्यूम 2-5 μL हैं। विशिष्ट सेल खुराक 0.5-5 x 106 कोशिकाएं हैं।
4. सीएआर टी सेल इन्फ्यूजन
- पीकेजी ट्यूबिंग के एक छोटे से टुकड़े के माध्यम से शीर्ष को खिलाकर उपचार प्रवेशनी तैयार करें।
- सीएआर टी सेल सस्पेंशन के साथ उपचार सिरिंज भरें और इसे पीकेजी ट्यूबिंग के दूसरे छोर के माध्यम से डालें, जो उपचार प्रवेशनी के शीर्ष को कवर करने के लिए पर्याप्त है।
- माउस को 1 एल / मिनट की ऑक्सीजन प्रवाह दर पर आइसोफ्लुरेन (2-4%) के साथ एनेस्थेटाइज करें।
- बेस पर फोर्सप्स का उपयोग करके गाइड कैनुला को स्थिर करें, और फिर सावधानीपूर्वक पेंच को खोलें और डमी कैनुला को हटा दें, जिससे गाइड कैनुला में पहुंच हो सके।
नोट: एक स्टीरियोटैक्सिक सेटअप आवश्यक नहीं है, लेकिन उपचार के लिए सिर को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - 1 मिनट के लिए सीएआर टी कोशिकाओं को इंजेक्ट करें और जलसेक की समाप्ति के बाद अतिरिक्त 1 मिनट के लिए उपचार प्रवेशनी को रखें।
- उपचार प्रवेशनी को हटा दें और डमी कैनुला को कसकर वापस जगह पर पेंच करें।
- वैकल्पिक दर्द नियंत्रण के लिए चमड़े के नीचे मेलोक्सिकैम (5 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रबंधन करें।
Representative Results
माउस सीएनएस में सफल प्रवेशनी प्रत्यारोपण।
सफल कैनुलाशन वाले चूहों में एक सुरक्षित गाइड कैनुला होता है, जो दैनिक जीवन की गतिविधियों में हस्तक्षेप नहीं करता है (चित्रा 2 ए) और यह आसानी से एक उपचार प्रवेशनी पारित कर सकता है और प्रतिरोध के बिना तरल पदार्थ वितरित कर सकता है (चित्रा 2 बी)। हमारे अनुभव में, अधिकांश कैनुला 4 सप्ताह से अधिक समय तक बने रहते हैं, हालांकि समय के साथ 0-25% को हटाया जा सकता है। सही प्लेसमेंट के सत्यापन की पुष्टि इवांस ब्लू डाई के साथ प्रवेशनी में इंजेक्ट की जा सकती है। उदाहरण के लिए, पार्श्व वेंट्रिकल में डाला गया एक कैनुला पूरे वेंट्रिकुलर सिस्टम में इवांस ब्लू डाई दिखाता है क्योंकि यह सेरेब्रल स्पाइनल द्रव के माध्यम से यात्रा करता है, जो सही प्लेसमेंट की पुष्टि करता है (चित्रा 2 सी)। ट्यूमर में डाले गए कैनुला ट्यूमर आरोपण की साइट पर इवांस ब्लू डाई दिखाते हैं।
जेनोग्राफ्ट ट्यूमर के उपचार के लिए सीएनएस में सीएआर टी कोशिकाओं का प्रभावी वितरण।
इंट्राक्रैनील कैनुला प्रणाली की प्रभावकारिता और मुराइन मॉडल में सीएआर टी कोशिकाओं की चिकित्सीय प्रभावकारिता को बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग और समग्र अस्तित्व सहित विभिन्न तंत्रों के माध्यम से मापा जा सकता है। जीपीसी 2-निर्देशित सीएआर टी कोशिकाओं को क्रमशः म्यूरिन मेडुलोब्लास्टोमा और डिफ्यूज मिडलाइन ग्लियोमा मॉडल, 7316-4509 और 7316-3058 के खिलाफ परीक्षण किया गया था, जिसमें कहा गया इंट्राक्रैनील कैनुला सिस्टम14 के माध्यम से बार-बार सीएआर टी सेल खुराक का उपयोग किया गया था। ऑर्थोटोपिक ट्यूमर प्लेसमेंट और एनग्राफमेंट की पुष्टि बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग द्वारा की गई थी, और कैनुला को ऑर्थोटोपिक ट्यूमर प्लेसमेंट के समान निर्देशांक का उपयोग करके ट्यूमर बेड में रखा गया था। उपचार में 2-4 सप्ताह के लिए सप्ताह में एक से दो बार जीपीसी 2 सीएआर टी सेल इन्फ्यूजन शामिल थे, कुल चार से छह खुराक। उपचार के बाद, जीपीसी 2-निर्देशित सीएआर टी सेल थेरेपी ने मेडुलोब्लास्टोमा मॉडल 7316-4509 (पी < 0.01) (चित्रा 3 ए) में महत्वपूर्ण ट्यूमर प्रतिगमन को प्रेरित किया और थैलेमिक डिफ्यूज मिडलाइन ग्लिओमा 7316-3058 (पी < 0.05) (चित्रा 3 बी)14 में काफी लंबे समय तक जीवित रहने के लिए प्रेरित किया।
चित्रा 1: प्रोजेक्शन डमी और ट्रीटमेंट कैनुला के साथ गाइड कैनुला। (ए) 0.5 मिमी प्रक्षेपण और 2 मिमी प्रक्षेपण डमी कैनुला के साथ गाइड कैनुला। (बी) 0.5 मिमी प्रक्षेपण और 2 मिमी प्रक्षेपण उपचार प्रवेशनी के साथ गाइड कैनुला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: सीएआर टी कोशिकाओं की बार-बार खुराक के लिए उपचार प्रवेशनी वितरण प्रणाली । (ए) उपयोग में नहीं होने पर एक टोपी के साथ एक माउस खोपड़ी में प्रत्यारोपित कैनुला। (बी) उपचार प्रवेशनी के माध्यम से एक पोंटिन ट्यूमर में सीएआर टी कोशिकाओं का जलसेक, जबकि माउस संज्ञाहरण के तहत है। (सी) इवांस ब्लू डाई का उपयोग करके पार्श्व वेंट्रिकल में कैनुला प्लेसमेंट का सत्यापन। डाई को कैनुला के माध्यम से डाला गया था, इसके बाद इच्छामृत्यु और मस्तिष्क छांटना था, जिसमें पूरे वेंट्रिकल्स में डाई मौजूद थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: जीपीसी 2-निर्देशित सीएआर टी कोशिकाएं एंटीट्यूमर प्रतिक्रियाओं को मध्यस्थ करती हैं और विवो में बाल चिकित्सा मस्तिष्क ट्यूमर में जीवित रहती हैं। (ए) ऑर्थोटोपिक समूह 4 मेडुलोब्लास्टोमा जेनोग्राफ्ट 7316-4509 के बायोल्यूमिनेसेंस का परिमाणीकरण या तो जीपीसी 2- या सीडी 19-निर्देशित एमआरएनए सीएआर टी कोशिकाओं के साथ इलाज किया जाता है। खुराक ग्राफ पर तीर द्वारा इंगित की जाती है। एसडी के साथ औसत के रूप में प्रदर्शित डेटा, एन = 9-11 चूहे प्रति हाथ। (बी) थैलेमिक डीएमजी जेनोग्राफ्ट 7316-3058 के साथ प्रत्यारोपित चूहों के समग्र अस्तित्व का इलाज 2 x 106 सीएआर टी कोशिकाओं की छह बार-बार खुराक के साथ किया गया। खुराक ग्राफ पर तीर द्वारा इंगित की जाती है। एन = 7 चूहे प्रति हाथ। ** पी < 0.01; * पी < 0.05; एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। इस आंकड़े को फोस्टर एट अल .14 से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
सीएआर टी सेल थेरेपी ने हेमेटोलॉजिकल कैंसर के उपचार में क्रांति ला दी है और ठोस मस्तिष्क ट्यूमर 6,7,8 के इलाज में आशाजनक मूल्य दिखाता है। यह प्रोटोकॉल बाल चिकित्सा सीएनएस ट्यूमर के उपचार के लिए लोकोरीजनल सीएआर टी सेल डिलीवरी के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। कैनुला प्रणाली एक ओममाया या रिकहम जलाशय की नकल करती है, एक इंट्रावेंट्रिकुलर कैथेटर सिस्टम जो वर्तमान में बाल चिकित्सा सीएनएस ट्यूमर 6,7,8 में सीएआर टी सेल थेरेपी के चल रहे नैदानिक परीक्षणों में उपयोग किया जा रहा है, इन तरीकों की प्रासंगिकता और अनुवाद क्षमता को रेखांकित करता है। यह प्रणाली सीएआर टी कोशिकाओं के बार-बार वितरण की अनुमति देती है जो रक्त-मस्तिष्क बाधा को बायपास करती हैं, फिर से चल रहे नैदानिक परीक्षणों में नियोजित तरीकों के समान। लोकोरीजनल डिलीवरी सीएनएस9 में अधिकतम प्रभावकारिता प्रदान कर सकती है और परिसंचरण15 से तस्करी से जुड़े प्रणालीगत विषाक्तता के जोखिम को भी कम कर सकती है। जबकि स्टीरियोटैक्टिक डिलीवरी सीएनएस में एक खुराक प्रदान कर सकती है, इस प्रणाली का लाभ कई सर्जरी की आवश्यकता के बिना सीएनएस में एक निर्दिष्ट स्थान पर कई बार-बार खुराक प्रदान करने का अवसर है। इस प्रक्रिया की सीमाओं में एक निश्चित वितरण साइट शामिल है जिसमें स्थान बदलने या कैनुला होने के बाद समायोजन करने की क्षमता नहीं है, और कैनुला के विघटन की संभावना है।
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम डी / वी समन्वय पर निश्चित गाइड कैनुला का आरोपण है जो उपचार प्रवेशनी के प्रक्षेपण को ध्यान में रखता है। उपचार प्रवेशनी गाइड कैनुला की नोक से परे फैल जाएगी, और इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि प्लेसमेंट के परिणामस्वरूप सीएआर टी कोशिकाओं को रुचि के क्षेत्र में वितरित किया जाएगा। उपचार प्रवेशनी की प्रक्षेपण लंबाई को अनुकूलित किया जा सकता है, और लेखक के अनुभव में, 0.5 मिमी एक उपयोगी प्रक्षेपण लंबाई है। यह लंबाई यह सुनिश्चित करती है कि चिकित्सीय वितरण पर गाइड कैनुला में नहीं रहता है, लेकिन रुचि के क्षेत्र में गाइड कैनुला के लिए डी / वी निर्देशांक के महत्वपूर्ण समायोजन की भी आवश्यकता नहीं होती है। इस प्रोटोकॉल में एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम वह समय है जब सीएआर टी सेल इन्फ्यूजन के बाद उपचार प्रवेशनी को छोड़ दिया जाता है। रिसाव को रोकने और सीएआर टी सेल थेरेपी के लोकोरीजनल डिलीवरी के नुकसान को रोकने के लिए, जलसेक के अंत के बाद उपचार प्रवेशनी को कम से कम 1 मिनट के लिए रखा जाना चाहिए।
इस विधि का समस्या निवारण सरल है, अधिकांश जटिलताओं में डमी कैनुला को हटाने या निश्चित गाइड कैनुला में उपचार प्रवेशनी डालने में कठिनाई शामिल है, संभवतः गाइड कैनुला के इंटीरियर पर सूखे रक्त के कारण। यह आसानी से गाइड कैनुला के माध्यम से डमी कैनुला को धीरे से पारित करके हल किया जा सकता है जब तक कि कम प्रतिरोध न हो और मलबे को साफ न किया गया हो। ऐक्रेलिक राल कभी-कभी खोपड़ी से हट सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कैनुला प्रणाली का नुकसान होता है। हमारे अनुभव में, यह आम तौर पर खोपड़ी को स्केलपेल के साथ स्कोर करके और दो स्क्रू के प्लेसमेंट से सीमित है। इसके अलावा, पिंजरे से कोई भी आइटम जो माउस के चारों ओर घूमते समय गलती से प्रवेशनी पर बल लागू कर सकता है, उसे हटा दिया जाता है, जैसे कि छोटे उद्घाटन के साथ विशेष माउस संवर्धन झोपड़ी।
अंत में, यहां वर्णित सीएआर टी कोशिकाओं के बार-बार वितरण के लिए सीएनएस ट्यूमर के मुराइन मॉडल में एक प्रवेशनी प्रणाली के सम्मिलन के लिए एक प्रोटोकॉल है। कैनुला प्लेसमेंट को कई लोकोरीजनल डिलीवरी स्थानों पर समायोजित किया जा सकता है, जो विभिन्न वितरण साइटों की प्रभावकारिता का परीक्षण करता है। इसके अलावा, इस प्रणाली का उपयोग रक्त-मस्तिष्क बाधा को दरकिनार करते समय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए सीएआर टी कोशिकाओं से परे अतिरिक्त चिकित्सीय के लिए किया जा सकता है, और गैर-ऑन्कोलॉजिकल विकारों के मुराइन मॉडल में चिकित्सीय के मूल्यांकन के लिए भी उपयोगी हो सकता है।
Disclosures
जेबीएफ के पास ग्लाइपिकन 2 (जीपीसी 2) -निर्देशित इम्यूनोथेरेपी से संबंधित पेटेंट है। अन्य सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम के लिए फंडिंग मैथ्यू लार्सन फाउंडेशन, ग्रेसन सेव्स फाउंडेशन, हुंडई होप ऑन व्हील्स यंग इन्वेस्टिगेटर अवार्ड, कॉर्टनी रोज फाउंडेशन, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ एनसीआई के 12 सीए 076931-19 और 1के08सीए263179-01 और रक्षा विभाग डब्ल्यू 81एक्सडब्ल्यूएच-21-1-0221 द्वारा प्रदान की गई थी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needles | BD | 511097 | 1 1/2 inch metal hub |
| Acrylic resin liquid | Lang Dental | B1323 | |
| Acrylic resin powder | Lang Dental | B1323 | |
| Alcohol wipes | BD | 326895 | |
| Centrifuge 5240 | Eppendorf | 5420000040 | Centrifuge |
| Cotton tipped swabs | Puritan | 826-WC | Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500) |
| Drill bit holder | P1 Technologies | DH-1 | Drill bit holder for D56-D70 |
| Drill bit | P1 Technologies | D58 | 1.07 mm |
| Dummy cannula | P1 Technologies | C315DCS-5/SPC | Configuration: Small cap; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
| Flat tip screwdriver | P1 Technologies | SD-80 | Screwdriver |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Forceps |
| Guide cannula | P1 Technologies | C315GS-5/SPC | Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal |
| Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine | Pascal | 1151602 | |
| MOXI Z Mini automated cell counter Kit | Moxi | MXZ001 | Cell counter |
| NOD scid gamma (NSG) mice | Jackson Laboratory | 5557 | 6 to 12-week-old males and females |
| Pasteur pipet | VWR | 14673-043 | |
| PKG tubing | P1 Technologies | C313CT | Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm |
| Porcelain 12 well plate | Flinn Scientific | AP6064 | |
| Povidone iodine | Medline | MDS093943 | |
| Scalpel | World Precision Instrument | 50-822-457 | Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6" Ruler |
| Screws | P1 Technologies | 0-80 X 3/32 | 2.4 mm |
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 940 | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console |
| Student fine scissors | Fine Science Tools | 91460-12 | Scissors |
| Treatment cannula | P1 Technologies | C315IS-5/SPC | 33GA; Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
| Treatment syringes | Hamilton | 87908 | 5 µL, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5"/PT3 |
| Vactrap XL | Foxx Life Sciences | 305-4401-FLS | Vacuum System |
References
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