Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

השתלת צינורית תוך גולגולתית עבור קולטן אנטיגן כימרי טורי (CAR) עירוי תאי T בעכברים

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64886
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 1,2, 1,2, 4,5, 2,3, 2,3, 1,2
1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Center for Data Driven Discovery in Biomedicine, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Division of Neurosurgery, Children’s Hospital of Philadelphia, 4Ben Towne Center for Childhood Cancer Research, Seattle Children’s Research Institute, 5Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital, University of Washington

Summary

גידולים במערכת העצבים המרכזית (CNS) הם הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן בקרב ילדים, וטיפולים מבוססי מערכת החיסון נבדקים יותר ויותר עבור חולים בניסויים קליניים. פרוטוקול זה מתאר שיטות להשתלת צינורית לוקו-אזורית בעכברים לצורך הערכה פרה-קלינית של עירויים אימונותרפיים המכוונים לגידולים במערכת העצבים המרכזית.

Abstract

גידולים במערכת העצבים המרכזית בילדים אחראים לרוב מקרי המוות הקשורים לסרטן בקרב ילדים ויש להם פרוגנוזות גרועות, למרות ההתקדמות בכימותרפיה והקרנות. מכיוון שלגידולים רבים אין טיפולים יעילים, יש צורך חיוני לפתח אפשרויות טיפוליות מבטיחות יותר, כגון אימונותרפיה; השימוש בקולטן אנטיגן כימרי (CAR) טיפול בתאי T המכוון נגד גידולים במערכת העצבים המרכזית מעניין במיוחד. מטרות פני השטח של התא כגון B7-H3, IL13RA2 ו- disialoganglioside GD2 מבוטאות היטב על פני השטח של מספר גידולים במערכת העצבים המרכזית בילדים ובמבוגרים, מה שמעלה את ההזדמנות להשתמש בטיפול בתאי CAR T נגד מטרות פני שטח אלה ואחרות. כדי להעריך את ההולכה הלוקואזורית החוזרת ונשנית של תאי CAR T במודלים פרה-קליניים של מורין, הוקמה מערכת צנתרים פנימית המשחזרת צנתרים שוכנים המשמשים כיום בניסויים קליניים בבני אדם. בניגוד להעברה סטריאוטקטית, מערכת הצנתרים מאפשרת מינון חוזר ללא שימוש במספר ניתוחים. פרוטוקול זה מתאר את המיקום התוך-גידולי של צינורית מנחה קבועה ששימשה לבדיקה מוצלחת של עירויי תאי CAR T סדרתיים במודלים אורתוטופיים של גידולי מוח בילדים. לאחר הזרקה אורתוטופית והשתלה של תאי הגידול בעכברים, הושלם מיקום תוך גידולי של צינורית מנחה קבועה על מכשיר סטריאוטקטי ומאובטח באמצעות ברגים ושרף אקרילי. לאחר מכן מוחדרות צינוריות טיפול דרך צינורית המנחה הקבועה למסירה חוזרת ונשנית של תאי CAR T. ניתן לכוונן את המיקום הסטריאוטקטי של צינורית ההנחיה כדי להעביר תאי CAR T ישירות לחדר הצידי או למקומות אחרים במוח. פלטפורמה זו מציעה מנגנון אמין לבדיקות פרה-קליניות של עירויים תוך-גולגולתיים חוזרים ונשנים של תאי CAR T וטיפולים חדשניים אחרים לגידולי ילדים הרסניים אלה.

Introduction

למרות שיפורים בכימותרפיה, הקרנות וניתוחים, גידולים במערכת העצבים המרכזית (CNS) הם הממאירות הקטלנית ביותר ברפואת ילדים1, מה שמדגיש את הצורך החשוב בגישות חדשות עם תוצאות מוצלחות יותר. עם התקדמות משמעותית בתחום האימונותרפיה, גישות הטיפול התאי המאמץ (ACT) הראו תוצאות מבטיחות בסוגי סרטן שונים, במיוחד ממאירויות המטולוגיות2. טיפול בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR), סוג מסוים של ACT, מנצל את היכולת הטבעית של מערכת החיסון לזהות ולהרוג תאים מזיקים על ידי ניתוב מחדש של הספציפיות של תאי T ליצירת תאי T ממוקדי גידול3. טיפול בתאי CAR T הוכיח הצלחה משמעותית בטיפול בלוקמיה ולימפומות4, מה שהופך אותו לגישה אימונותרפית מבטיחה ומעודד את חקירתו בגידולים מוצקים. עם זאת, עד כה, טיפול בתאי CAR T בגידולים מוצקים השיג הצלחה קלינית מועטה ועומד בפני אתגרים רבים, כגון חדירה לא יעילה של הגידול, אנטיגנים מוגבלים הניתנים למטרה, ומיקרו-סביבה מדכאת-גידול5.

ניסויים קליניים אחרונים החלו להעריך טיפול בתאי CAR T עבור גידולים במערכת העצבים המרכזית בילדים, ומספקים הוכחת היתכנות וראיות מוקדמות לפעילות תאי T בדיווחים ראשוניים 6,7,8. בעוד שרוב הנתונים הפרה-קליניים הראשוניים התמקדו בהעברה תוך ורידית של תאי CAR T, ראיות פרה-קליניות אחרונות הצביעו על עליונות המסירה הלוקואזורית במערכת העצבים המרכזית9,10, אשר נוצלה בהצלחה גם במספר ניסויים קליניים 6,7,8,11 . מחקרים פרה-קליניים עד כה ששילבו את ההעברה הלוקואזורית של תאי CAR T במערכת העצבים המרכזית הסתמכו על מנה תוך-גולגולתית אחת של תאי CAR T שנמסרו באופן סטריאוטקטי 9,10. עם זאת, ניסויים קליניים בבני אדם דרשו עירויים חוזרים ונשנים של תאי CAR T במערכת העצבים המרכזית 6,7,8,11, מה שמדגיש את הצורך להעריך עירויים חוזרים מרובים בפיתוח פרה-קליני. מטרת הליך זה היא לבדוק בהצלחה עירויי תאי CAR T סדרתיים באמצעות קטטר במודלים אורתוטופיים של גידולי מוח בילדים. היתרון של טכניקה זו הוא הימנעות של הליכים כירורגיים מרובים כדי לספק טיפולים חוזרים תוך CNS. קנולות שימשו בעיקר לדגימת מיקרו-דיאליזה של מוליכים עצביים ולאספקת חומרים נוירואקטיביים במדעי המוח ובמחקר התנהגותי במכרסמים12, עם דיווחים מוגבלים על השימוש בהם למתן טיפולים אנטי-סרטניים. בהתבסס על הדיווחים הקודמים, פרוטוקול זה משתמש במערכת צינורית שוכנת הממוקמת באופן סטריאוטקטי כדי לספק תאי CAR T במודלים של xenograft murine של גידולי CNS. הפרוטוקול יכול לשמש לבדיקת טיפולים נוספים במודלים מורינים של הפרעות נוירולוגיות או נוירו-אונקולוגיות, ועשוי להיות מועיל לבדיקת טיפולים חדשניים שבהם עקיפת מחסום הדם-מוח היא קריטית ליעילות.

Protocol

כל נהלי הפרוטוקול אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים לילדים של פילדלפיה (IAC 19-000907), המוסמכת על ידי AAALAC. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי NOD scid gamma (NSG) בני 6-12 שבועות עם גידולי xenograft אורתוטופיים; עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול על כל זן עכבר. עכברי NSG שוכנו בתנאי מחסום סטריליים וניתוחים בוצעו תחת ארונות בטיחות ביולוגית סטריליים. כאשר נעשה שימוש בחומר אנושי כגון תאי גידול או תאי T, יש להשלים הליכים וטיפול בארונות בטיחות ביולוגית ABSL-2.

1. הכנת העכבר לניתוח

  1. מרדימים את העכבר בתא אינדוקציה עם איזופלורן (2-4%) בקצב זרימת חמצן של 1 ליטר/דקה עד שמגיעים למישור הרדמה מתאים (כ-5 דקות).
  2. שקול את העכבר באמצעות משקל ל 0.1 גרם הקרוב ביותר ולתת שחרור איטי תת עורי (SR), buprenorphine (1 מ"ג / ק"ג) או משכך כאבים אחר.
    הערה: SR buprenorphine מספק שיכוך כאבים במשך 72 שעות.
  3. לגלח את הפרווה על החלק העליון של ראש העכבר באמצעות קוצץ חשמלי או חומרים depilatory.
  4. השתמש במרית כדי לפתוח בעדינות את החלק התחתון של הזרוע הסטריאוטקטית והכנס את צינורית ההנחיה באמצעות מלקחיים. הדקו את הבורג על הזרוע כדי לאבטח את הצינורית כך שכ-1/2 עד 2/3 מחלק הפלסטיק הלבן של הצינורית יבלוט מתחתית הפתח, יחד עם כל אורך המתכת של הצינורית בקוטר 5 מ"מ.
  5. הכנס ואבטח את שיניו העליונות של העכבר בסרגל הנשיכה של המנגנון הסטריאוטקסי. משוך את חרוט האף קדימה והדק אותו, ודא שהעכבר שואף איזופלורן.
  6. הרכיבו את העכבר על המנגנון הסטריאוטקסי המחומם באמצעות אזיקי אוזניים או מוטות אוזניים, תוך הימנעות מלחץ מוגזם.
    הערה: מגש מחומם צריך להיות מוכנס מדחום רקטלי, ואת מגש החימום צריך להתאים כדי לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית של העכבר במהלך ההליך.
  7. יש למרוח משחה אופתלמית סטרילית על שתי העיניים באמצעות מוליך צמר גפן.
  8. נגבו את אתר הניתוח עם פובידון-יוד על פד או מוליך, ואחריו כרית אלכוהול. בצע שלב זה שלוש פעמים בסך הכל.
  9. לפני תחילת ההליך, בצע צביטת בוהן עם מלקחיים כדי להעריך טשטוש נאות.

2. הליך כירורגי

הערה: כל ההיבטים של ההליך הכירורגי משתמשים במכשירים מעוקרים ובטכניקות אספטיות. העכברים ממשיכים בהרדמה עם איזופלורן (2-4%) לאורך כל ההליך, כ-10-20 דקות.

  1. הרימו בעדינות את הקרקפת בין האוזניים בעזרת מלקחיים. בעזרת מספריים סטריליים, חותכים את הקרקפת המורמת במקביל לגולגולת ומסירים דש עור סגלגל (0.75-1 ס"מ אורך) כדי לחשוף את הגולגולת.
    הערה: מספריים עדיפים על פני אזמל כדי לספק פתח נקי בצורת אליפסה וכדי למנוע נזק מיותר לעור ולרקמות שמסביב.
  2. יש להרחיק את הפאשיה בעזרת אזמל או מקלוני צמר גפן וגלולת צמר גפן המוסטטית כדי לסייע בהאטת דימום יתר לפי הצורך.
    הערה: שימוש בצד העץ של קצה כותנה סטרילי יכול גם להרחיק את הפאשיה ולעזור למנוע דימום מוגזם.
  3. זהה את ציוני הדרך ברגמה ולמבדה, הסימנים הקדמיים והאחוריים בהתאמה על הגולגולת שבה לוחות הגולגולת נפגשים13.
    הערה: ניתן להגדיל את הזיהוי על ידי ניגוב החלק העליון של הגולגולת החשופה במי חמצן.
  4. הניחו בעדינות את הגולגולת בעזרת אזמל כדי ליצור משטח שהאקריליק יוכל להצמיד. הניקוד צריך לכלול קווים ליניאריים מרובים באורך של כ-0.5-1 ס"מ בזוויות של 90° זה לזה.
  5. באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית, מקמו את הצינורית לנקודת העניין (bregma או lambda). לאחר המיקום, הרימו את קצה הצינורית 1-2 מ"מ מעל פני הגולגולת ועברו לקואורדינטות הרצויות. עבור זריקות תוך גידוליות, זה משתמש באותן קואורדינטות A/P ו- M/L כמו מיקום הגידול.
  6. על הגולגולת החשופה, הרחק מהאזור אליו תיכנס הצינורית, עשו שני חורי בורג עם מחט 18 G או מקדחה כירורגית. ודא שהחורים מרווחים כדי לכלול מספיק מקום לצינורית. בעזרת מקדחה, סובבו דרך חורי הבורג עד שהם תופסים את הגולגולת. הכנס וחבר שני ברגים לתוך החורים באמצעות מברג שטוח. לאחר מכן, משכו בעדינות את הברגים כלפי מעלה כדי לוודא שהם מאובטחים.
    הערה: אין להכניס את הברגים עד שהם צמודים לגולגולת, אחרת הם עלולים לגרום נזק למוח העכבר שמתחת. השאירו לפחות רווח של 1-2 מ"מ בין הבורג לגולגולת.
  7. באמצעות מחט 18 G או מקדחה כירורגית, קדח דרך הגולגולת בקואורדינטות שזוהו כדי ליצור חור להחדרת הצינורית.
  8. בעזרת הזרוע הסטריאוטקטית, מורידים את הצינורית לקואורדינטת D/V הרצויה.
    הערה: קואורדינטת D/V של השתלת צינורית צריכה לקחת בחשבון את אורך ההקרנה של צינוריות הדמה והטיפול, ועשויה להיות שטחית יותר מההזרקה האורתוטופית של תאי הגידול (איור 1).
  9. בצלחת חרסינה בעלת 12 בארות, ממלאים באר אחת באבקת שרף אקרילי (כ-0.3 גרם) ו-10-15 טיפות (כ-0.5-0.75 מ"ל) נוזל שרף אקרילי. זה מייצר חומר צמיג בצבע לבן. ציירו את התערובת לתוך מזרק 1 מ"ל והשתמשו בו כדי לצפות ולכסות את הגולגולת, מילוי החללים סביב הצינורית והברגים.
    הערה: החומר הצמיגי מתקשה למלט עם הזמן, ולכן יש להשלים שלב זה מיד לאחר הערבוב.
  10. כאשר המלט עדיין גמיש, שחררו את הבורג על הזרוע הסטריאוטקטית והשתמשו במרית בפתח בתחתית כדי לשחרר בעדינות את הצינורית מהמחזיק ולמשוך לאט לאט את הזרוע הסטריאוטקטית כלפי מעלה הרחק מהעכבר.
  11. ברגע שהמלט יבש לחלוטין, הכניסו את צינורית הדמה לצינורית המנחה והדקו אותה היטב על ידי סיבוב בכיוון השעון.
  12. לאחר השלמת ההליך, החזירו את העכבר לכלוב הביתי המחומם שלו כדי לפקח בקפידה, להבטיח התאוששות נאותה ולתעד את כל התצפיות שלאחר ההליך, כולל העובדה שהעכבר חזר להכרה מלאה, לפני שחזר למושבה.
    הערה: בדרך כלל מומלץ להניח רק מחצית מהכלוב על כרית חימום כדי לאפשר לבעל החיים לעבור לצד הקריר יותר כדי למנוע התחממות יתר.
  13. יש לתת משככי כאבים נוספים לפי הצורך אם העכברים מפגינים התנהגויות המעידות על כאב לאחר הניתוח, כגון מלוקסיקם 5 מ"ג/ק"ג המועברת תת עורית פעם ביום למשך עד 3 ימים.

3. הכנת תאי CAR T

  1. מדוד את ריכוז תאי CAR T הנגועים מראש באמצעות מונה תאים.
  2. צנטריפוגה מראש תאי T נגועים ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. יש לשאוף את הסופרנאטנט באמצעות פיפט פסטר סטרילי על מערכת שאיפת ואקום ולהשהות מחדש את הגלולה במי מלח חוצצים פוספטים (PBS) לריכוז הרצוי. נפחי אספקה אופייניים הם 2-5 μL. מינונים אופייניים של תאים הם 0.5-5 x 106 תאים.

4. עירויי תאי CAR T

  1. הכינו את צינורית הטיפול על ידי הזנת החלק העליון דרך חתיכה קטנה של צינורות PKG.
  2. מלאו את מזרק הטיפול בתרחיף תא CAR T והכניסו אותו דרך הקצה השני של צינורית ה-PKG, מספיק כדי לכסות את החלק העליון של צינורית הטיפול.
  3. מרדימים את העכבר עם איזופלורן (2-4%) בקצב זרימת חמצן של 1 ליטר/דקה.
  4. ייצבו את צינורית ההנחיה באמצעות מלקחיים בבסיס, ולאחר מכן פתחו בזהירות את הברגים והוציאו את צינורית הדמה, מה שמאפשר גישה לצינורית המנחה.
    הערה: התקנה סטריאוטקסית אינה הכרחית, אך ניתן להשתמש בה כדי לייצב את הראש לטיפול.
  5. יש להחדיר את תאי CAR T למשך דקה אחת ולהחזיק את צינורית הטיפול במקומה למשך דקה נוספת לאחר הפסקת העירוי.
  6. מוציאים את צינורית הטיפול ומבריחים את צינורית הדמה בחוזקה חזרה למקומה.
  7. מתן מלוקסיקם תת עורי (5 מ"ג/ק"ג) לשליטה אופציונלית בכאב.

Representative Results

השתלת צינורית מוצלחת במערכת העצבים המרכזית של העכבר
לעכברים עם קנולציה מוצלחת יש צינורית מנחה מאובטחת במקום, שאינה מפריעה לפעילויות היומיום (איור 2A) ושיכולה לעבור בקלות צינורית טיפול ולספק נוזלים ללא התנגדות (איור 2B). מניסיוננו, רוב הצינוריות נשארות במקומן במשך יותר מ-4 שבועות, אם כי ניתן לעקור 0-25% מהן עם הזמן. אימות המיקום הנכון ניתן לאשר עם צבע כחול אוונס מוזרק לתוך הצינורית. לדוגמה, צינורית המוחדרת לחדר הצידי מראה צבע כחול של אוונס בכל מערכת החדרים כשהוא עובר דרך נוזל עמוד השדרה המוחי, מה שמאשר מיקום נכון (איור 2C). קנולות המוחדרות לגידול מראות צבע כחול של אוונס באתר השתלת הגידול.

משלוח יעיל של תאי CAR T למערכת העצבים המרכזית לטיפול בגידולי xenograft.
את היעילות של מערכת הצינורית התוך גולגולתית ואת היעילות הטיפולית של תאי CAR T במודלים של מורין ניתן למדוד באמצעות מגוון מנגנונים, כולל הדמיה ביולומינסנטית והישרדות כוללת. תאי CAR T מכווני GPC2 נבדקו כנגד מודלים של מדולובלסטומה מורין וגליומה מפושטת בקו האמצע, 7316-4509 ו-7316-3058, בהתאמה, תוך שימוש במינון חוזר של תאי CAR T באמצעות מערכת הצינורית התוך גולגולתית המוצהרת14. מיקום הגידול האורתוטופי וקליטתו אושרו על ידי הדמיה ביולומינסנטית, וצינוריות הוכנסו למיטת הגידול באמצעות אותן קואורדינטות כמו מיקום הגידול האורתוטופי. הטיפולים כללו עירויי תאי GPC2 CAR T פעם עד פעמיים בשבוע למשך 2-4 שבועות, בסך הכל ארבע עד שש מנות. לאחר הטיפול, טיפול בתאי CAR T מכוון GPC2 גרם לרגרסיה משמעותית של הגידול במודל המדולובלסטומה 7316-4509 (p < 0.01) (איור 3A) והישרדות ממושכת משמעותית בגליומה תלמית מפושטת בקו האמצע 7316-3058 (p < 0.05) (איור 3B)14.

Figure 1
איור 1: צינורית מנחה עם בובת הקרנה וצינוריות טיפול. (A) צינורית מנחה עם צינוריות הקרנה בקוטר 0.5 מ"מ וצינוריות בובת הקרנה בקוטר 2 מ"מ. (B) צינורית מנחה עם צינוריות הקרנה בקוטר 0.5 מ"מ וצינוריות טיפול הקרנה בקוטר 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מערכת העברת צינורית טיפול למינונים חוזרים של תאי CAR T . (A) קנולה שהושתלה בגולגולת עכבר עם כובע במקומו כאשר אינה בשימוש. (B) עירוי של תאי CAR T לתוך גידול פונטיני דרך צינורית הטיפול בזמן שהעכבר נמצא תחת הרדמה. (C) אימות מיקום הצינורית בחדר הלטרלי באמצעות צבע כחול אוונס. צבע הוכנס דרך הצינורית, ואחריו המתת חסד וכריתת מוח, עם צבע נוכח בכל החדרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תאי CAR T מכווני GPC2 מתווכים תגובות אנטי-סרטניות ומאריכים את ההישרדות בגידולי מוח בילדים in vivo. (A) כימות של ביולומינסנציה של הקבוצה האורתוטופית 4 medulloblastoma xenograft 7316-4509 שטופלה בתאי mRNA CAR T מכווני GPC2 או CD19. המינונים מסומנים על ידי חצים בגרף. הנתונים מוצגים כממוצע עם SD, n = 9-11 עכברים לכל זרוע. (B) הישרדות כוללת של עכברים שהושתלו עם xenograft DMG תלמי 7316-3058 שטופלו בשש מנות חוזרות של 2 x 106 תאי CAR T. המינונים מסומנים על ידי חצים בגרף. n = 7 עכברים לכל זרוע. **P < 0.01; *p < 0.05; ns = לא משמעותי. נתון זה שוחזר באישור Foster et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

טיפול בתאי CAR T חולל מהפכה בטיפול בסרטן המטולוגי ומראה ערך מבטיח בטיפול בגידולי מוח מוצקים 6,7,8. פרוטוקול זה נועד לאפשר הערכה פרה-קלינית של העברת תאי CAR T לוקו-אזוריים לטיפול בגידולים במערכת העצבים המרכזית בילדים. מערכת הצינורית משכפלת מאגר אומאיה או ריקהם, מערכת צנתרים תוך-חדרית המשמשת כיום בניסויים קליניים מתמשכים של טיפול בתאי CAR T בגידולי CNS ילדים 6,7,8, ומדגישה את הרלוונטיות והפוטנציאל התרגומי של שיטות אלה. מערכת זו מאפשרת העברה חוזרת ונשנית של תאי CAR T העוקפים את מחסום הדם-מוח, שוב בדומה לשיטות המשמשות בניסויים קליניים מתמשכים. משלוח לוקואזורי יכול לספק יעילות מקסימלית במערכת העצבים המרכזית9 ועשוי גם להפחית את הסיכון לרעילות מערכתית הקשורה לסחר מהמחזור15. בעוד משלוח סטריאוטקטי יכול לספק מנה אחת לתוך CNS, היתרון של מערכת זו היא ההזדמנות לספק מנות חוזרות מרובות במיקום מוגדר במערכת העצבים המרכזית ללא צורך בניתוחים מרובים. מגבלותיו של הליך זה כוללות אתר מסירה קבוע ללא יכולת לשנות מיקום או לבצע התאמות ברגע שהצינורית נמצאת במקומה, ופוטנציאל לתזוזה של הצינורית.

שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא השתלת צינורית ההנחיה הקבועה בקואורדינטת D/V הלוקחת בחשבון את הקרנת צינוריות הטיפול. צינורית הטיפול תבלוט מעבר לקצה הצינורית המנחה, ולכן יש להקפיד על כך שהמיקום יביא להעברת תאי CAR T לאזור המעניין. אורכי הקרנה של צינורית הטיפול ניתנים להתאמה אישית, ומניסיונו של המחבר, 0.5 מ"מ הוא אורך הקרנה שימושי. אורך זה מבטיח כי הטיפול לא יישאר בצינורית המנחה בעת הניפוק, אך גם אינו דורש התאמה משמעותית של קואורדינטות D/V עבור צינורית המדריך לאזור העניין. שלב חשוב נוסף בפרוטוקול זה הוא הזמן שבו צינורית הטיפול נשארת במקומה לאחר עירוי תאי CAR T. צינורית הטיפול צריכה להיות מוחזקת במקומה לפחות 1 דקות לאחר סיום העירוי, כדי למנוע דליפות ואובדן משלוח לוקואזורי של טיפול בתאי CAR T.

פתרון בעיות בשיטה זו הוא פשוט, כאשר רוב הסיבוכים כרוכים בקושי להסיר את צינורית הדמה או להחדיר את צינורית הטיפול לצינורית המנחה הקבועה, ככל הנראה עקב דם יבש בחלק הפנימי של צינורית המנחה. ניתן לפתור זאת בקלות על ידי העברה עדינה של צינורית הדמה דרך צינורית ההנחיה עד שיש פחות התנגדות והפסולת פונתה. השרף האקרילי יכול מדי פעם לעקור מהגולגולת, וכתוצאה מכך לאבד את מערכת הצינוריות. מניסיוננו, זה מוגבל בדרך כלל על ידי ניקוד הגולגולת עם אזמל ומיקום של שני ברגים. בנוסף, כל פריט מהכלוב שעלול להפעיל בטעות כוח על הצינורית בזמן שהעכבר מסתובב מוסר, כגון בקתות העשרה מסוימות לעכבר עם פתחים קטנים.

לסיכום, מתואר כאן פרוטוקול להחדרת מערכת צינורית במודלים מורינים של גידולי CNS למסירה חוזרת של תאי CAR T. ניתן להתאים את מיקום Cannula למספר מיקומי מסירה לוקואזוריים, תוך בדיקת היעילות של אתרי מסירה שונים. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש לטיפולים נוספים מעבר לתאי CAR T כדי להעריך את היעילות בעת עקיפת מחסום הדם-מוח, ועשויה להיות שימושית גם להערכת טיפולים במודלים מורינים של הפרעות לא אונקולוגיות.

Disclosures

JBF מחזיקה בפטנט הקשור לאימונותרפיה מכוונת גליפיקן 2 (GPC2). לכל המחברים האחרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המימון לעבודה זו ניתן על ידי קרן מתיו לארסון, קרן גרייסון מציל, פרס החוקר הצעיר של יונדאי הופ על גלגלים, קרן קורטני רוז, המכונים הלאומיים לבריאות NCI K12 CA076931-19 ו- 1K08CA263179-01, ומשרד ההגנה W81XWH-21-1-0221.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles BD 511097 1 1/2 inch metal hub
Acrylic resin liquid Lang Dental  B1323 
Acrylic resin powder Lang Dental  B1323 
Alcohol wipes BD 326895
Centrifuge 5240 Eppendorf 5420000040 Centrifuge 
Cotton tipped swabs Puritan 826-WC Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500)
Drill bit holder  P1 Technologies  DH-1  Drill bit holder for D56-D70 
Drill bit  P1 Technologies  D58  1.07 mm 
Dummy cannula  P1 Technologies  C315DCS-5/SPC  Configuration: Small cap;  Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm 
Flat tip screwdriver  P1 Technologies  SD-80  Screwdriver 
Graefe forceps Fine Science Tools 11051-10 Forceps
Guide cannula  P1 Technologies  C315GS-5/SPC  Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal 
Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine  Pascal  1151602 
MOXI Z Mini automated cell counter Kit  Moxi MXZ001 Cell counter
NOD scid gamma (NSG) mice Jackson Laboratory 5557 6 to 12-week-old males and females
Pasteur pipet VWR 14673-043
PKG tubing  P1 Technologies  C313CT  Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm 
Porcelain 12 well plate Flinn Scientific AP6064 
Povidone iodine Medline MDS093943
Scalpel World Precision Instrument 50-822-457 Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6" Ruler
Screws  P1 Technologies  0-80 X 3/32  2.4 mm  
Stereotaxic Frame  David Kopf Instruments  940  Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console 
Student fine scissors Fine Science Tools 91460-12 Scissors
Treatment cannula  P1 Technologies  C315IS-5/SPC  33GA; Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm  
Treatment syringes  Hamilton 87908 5 µL, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5"/PT3 
Vactrap XL  Foxx Life Sciences 305-4401-FLS Vacuum System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curtin, S. C., Minino, A. M., Anderson, R. N. Declines in cancer death rates among children and adolescents in the United States, 1999-2014. NCHS Data Brief. 257, 1-8 (2016).
  2. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: the current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  3. Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discovery. 3 (4), 388-398 (2013).
  4. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  5. Wagner, J., Wickman, E., DeRenzo, C., Gottschalk, S. CAR T cell therapy for solid tumors: Bright future or dark reality. Molecular Therapy. 28 (11), 2320-2339 (2020).
  6. Vitanza, N. A., et al. Locoregional infusion of HER2-specific CAR T cells in children and young adults with recurrent or refractory CNS tumors: an interim analysis. Nature Medicine. 27 (9), 1544-1552 (2021).
  7. Majzner, R. G., et al. GD2-CAR T cell therapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas. Nature. 603 (7903), 934-941 (2022).
  8. Vitanza, N. A., et al. Intraventricular B7-H3 CAR T cells for diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary first-in-human bioactivity and safety. Cancer Discovery. 13 (1), 114-131 (2023).
  9. Theruvath, J., et al. Locoregionally administered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atypical teratoid/rhabdoid tumors. Nature Medicine. 26 (5), 712-719 (2020).
  10. Donovan, L. K., et al. Locoregional delivery of CAR T cells to the cerebrospinal fluid for treatment of metastatic medulloblastoma and ependymoma. Nature Medicine. 26 (5), 720-731 (2020).
  11. Brown, C. E., et al. Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor T-Cell therapy. The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
  12. Bourne, J. A. Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  13. Zhou, P., et al. Automatically detecting bregma and lambda points in rodent skull anatomy images. PLoS One. 15 (12), 0244378 (2020).
  14. Foster, J. B., et al. Development of GPC2-directed chimeric antigen receptors using mRNA for pediatric brain tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (9), 004450 (2022).
  15. Akhavan, D., et al. T cells for brain tumors: Lessons learned and road ahead. Immunological Reviews. 290 (1), 60-84 (2019).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 192
השתלת צינורית תוך גולגולתית עבור קולטן אנטיגן כימרי טורי (CAR) עירוי תאי T בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harvey, K., Madsen, P. J., Smith,… More

Harvey, K., Madsen, P. J., Smith, T., Griffin, C., Patterson, L., Vitanza, N. A., Storm, P. B., Resnick, A. C., Foster, J. B. Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice. J. Vis. Exp. (192), e64886, doi:10.3791/64886 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter