Summary
Um protocolo detalhado é fornecido aqui para estabelecer organoides mamários humanos a partir de ressecções de tumor de mama derivadas de pacientes ou tecido mamário normal. O protocolo fornece instruções passo a passo abrangentes para cultivar, congelar e descongelar organoides mamários derivados de pacientes humanos.
Abstract
O câncer de mama é uma doença complexa que tem sido classificada em vários subtipos histológicos e moleculares. Os organoides de tumor de mama derivados de pacientes desenvolvidos em nosso laboratório consistem em uma mistura de múltiplas populações de células derivadas de tumores, e assim representam uma melhor aproximação da diversidade e do meio celular tumoral do que as linhagens de células cancerosas 2D estabelecidas. Os organoides servem como um modelo ideal in vitro , permitindo interações célula-matriz extracelular, conhecidas por desempenhar um papel importante nas interações célula-célula e na progressão do câncer. Os organoides derivados do paciente também têm vantagens sobre os modelos de camundongos, pois são de origem humana. Além disso, eles demonstraram recapitular a heterogeneidade genômica, transcriptômica e metabólica dos tumores dos pacientes; Assim, são capazes de representar a complexidade tumoral, bem como a diversidade de pacientes. Como resultado, eles estão prontos para fornecer insights mais precisos sobre a descoberta e validação de alvos e ensaios de sensibilidade a medicamentos. Neste protocolo, fornecemos uma demonstração detalhada de como organoides mamários derivados de pacientes são estabelecidos a partir de tumores de mama ressecados (organoides de câncer) ou tecido mamário derivado de mamoplastia redutiva (organoides normais). Isso é seguido por um relato abrangente de cultura de organoides 3D, expansão, passagem, congelamento, bem como descongelamento de culturas de organoides mamários derivadas de pacientes.
Introduction
O câncer de mama (CM) é a neoplasia maligna mais comum no sexo feminino, estimando-se que 287.850 novos casos sejam diagnosticados nos Estados Unidos em 20221. Apesar dos recentes avanços na detecção precoce com rastreios anuais, terapias-alvo e melhor compreensão da predisposição genética, ela prevalece como a segunda principal causa de mortes por câncer em mulheres nos Estados Unidos, com >40.000 mortes atribuídas ao câncer de mama anualmente1. Atualmente, o câncer de mama é classificado em múltiplos subtipos, com base na avaliação histopatológica e molecular do tumor primário. Uma melhor estratificação de subtipos melhorou os resultados dos pacientes com opções de tratamento específicas para subtipos2. Por exemplo, a identificação do HER2 como um proto-oncogene3 levou ao desenvolvimento do trastuzumabe, o que tornou esse subtipo altamente agressivo manejável na maioria dos pacientes4. Pesquisas adicionais sobre a genética e a transcriptômica dessa complexa doença de maneira específica do paciente ajudarão a desenvolver e prever melhores regimes de tratamento personalizados específicos para o paciente 2,5. Os organoides derivados do paciente (DOPs) são um novo modelo promissor para obter informações sobre o câncer em nível molecular, identificando novos alvos ou biomarcadores e desenhando novas estratégias de tratamento 6,7,8.
As DOPs são estruturas multicelulares, tridimensionais (3D), derivadas de amostras de tecido primário recém-ressecadas 8,9. Eles são cultivados tridimensionalmente por estarem embutidos em uma matriz de hidrogel, tipicamente composta por uma combinação de proteínas da matriz extracelular (MEC) e, portanto, podem ser usados para estudar interações célula-MEC tumoral. As DOPs representam a diversidade de pacientes e recapitulam a heterogeneidade celular e as características genéticas do tumor10,11,12. Por serem modelos in vitro, permitem a manipulação genética e a triagem de fármacos de alto rendimento13,14,15. Além disso, as DOPs podem ser utilizadas de forma plausível para avaliar a sensibilidade medicamentosa e as estratégias de tratamento do paciente em paralelo à clínica e ajudar a prever os resultados dos pacientes16,17,18. Além da quimioterapia, alguns modelos organoides também têm sido utilizados para examinar as respostas individuais dos pacientes à quimiorradiação19,20. Dada a promissora aplicabilidade das DOPs para pesquisa e uso clínico, o Instituto Nacional do Câncer iniciou um consórcio internacional, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, para gerar e fornecer esses novos modelos de câncer derivados de tumores. Muitos dos modelos organoides de vários tipos de câncer desenvolvidos através do HCMI estão disponíveis através da American Type Culture Collection (ATCC)22.
Os organoides mamários normais têm se mostrado compostos por diferentes populações de células epiteliais presentes na glândula mamária 11,23 e, portanto, servem como ótimos modelos para o estudo de processos biológicos básicos, para a análise de mutações condutoras causadoras da tumorigênese e para estudos de linhagens de células cancerígenasde origem 6,15 . Modelos organoides de tumores de mama têm sido utilizados para identificar novos alvos que encorajam as perspectivas para o desenvolvimento de novas terapias, particularmente para tumores resistentes24,25,26. Guillen e col. mostraram que os organoides são modelos poderosos para a medicina de precisão, que podem ser aproveitados para avaliar respostas a drogas e direcionar decisões terapêuticas paralelamente28. Além disso, o desenvolvimento de novos métodos de co-cultura para cultivo de DOPs com várias células imunes27,28,29, fibroblastos30,31 e micróbios32,33 representa uma oportunidade para estudar o impacto do microambiente tumoral na progressão do câncer. Enquanto muitos desses métodos de co-cultura estão sendo ativamente estabelecidos para DOPs derivadas de tumores pancreáticos ou colorretais, métodos similares estabelecidos de co-cultura para DOPs de mama só foram relatados para células natural killer34 e fibroblastos35.
O primeiro biobanco de >100 organoides derivados de pacientes, representando diferentes subtipos de câncer de mama, foi desenvolvido pelo grupo de Hans Clevers36,37. Como parte desse esforço, o grupo Clevers também desenvolveu o primeiro meio de cultura complexo para o crescimento organoide mamário, que atualmente é amplamente utilizado36. Um estudo de seguimento forneceu um relato abrangente do estabelecimento e cultura de DOPs mamárias e xenoenxertos organoides derivados da paciente (PDOXs)38. O laboratório de Welm desenvolveu uma grande coleção de modelos BC PDX e PDxOs que são cultivados em um meio de crescimento comparativamente mais simples contendo soro fetal bovino (SFB) e menos fatores de crescimento 39,40. Desenvolvemos e caracterizamos independentemente uma grande variedade de modelos organoides de câncer de mama derivados de pacientes virgens11 e participamos do desenvolvimento de modelos de DOP de BC como parte da iniciativa HCMI21. Aqui, pretendemos fornecer um guia prático detalhando a metodologia empregada por nós na geração de sistemas de modelos organoides mamários derivados de pacientes.
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Protocol
As ressecções tumorais de pacientes com câncer de mama, juntamente com o tecido normal distal e adjacente, foram obtidas da Northwell Health de acordo com os protocolos do Comitê de Ética em Pesquisa IRB-03-012 e IRB 20-0150, e com consentimento informado das pacientes.
NOTA: Todos os procedimentos mencionados abaixo foram realizados em uma sala BSL2 de cultura de tecidos de mamíferos designada para amostras de pacientes após aprovação do comitê de biossegurança. Todos os procedimentos devem ser realizados seguindo protocolos de segurança mantendo condições assépticas em armários de biossegurança. Cada etapa de centrifugação é realizada à temperatura ambiente (RT), salvo indicação em contrário. Os estoques de tecidos/organoides e matrizes de membrana basal são sempre colocados no gelo, salvo indicação em contrário. Novas placas são incubadas durante a noite para pré-aquecimento. Chapear cúpulas em placas pré-aquecidas garante os melhores resultados para obter cúpulas arredondadas que não se achatam durante o revestimento ou decolagem mais tarde da superfície da placa.
1. Preparo médio e receitas
- Prepare a mídia R-spondin1 condicionada conforme descrito abaixo (alternativamente pode ser comprado comercialmente).
- Preparar dois meios de cultivo separados compostos por meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), FBS a 10%, penicilina-estreptomicina a 5% e com ou sem suplementação de 300 μg/mL de zeocina.
- Descongelar um frasco de células HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (obtido do laboratório de Calvin Kuo na Universidade de Stanford e também disponível comercialmente) em um frasco de cultura de tecidos de 75 cm 2 com 15 mLde meio.
- Dividir as células em frascos de cultura 2 x 175cm2 , cada um com 35 mL de meio contendo zeocina.
- Passar novamente pelas células para obter quantos frascos forem necessários para gerar o lote desejado de meio R-espondina1 condicionado. Use meio de crescimento sem zeocina.
- Quando os frascos contendo meio sem zeocina estiverem confluentes, retirar e substituir o meio de cultura por Ad-DF+++ (passo 1.2; Tabela 1). Colocar as células numa estufa a 37 °C com 5% de CO2 durante 1 semana.
- Gire o meio a 400 x g por 5 min para remover as células desconectadas. Filtrar o meio através de um filtro de 0,22 μm. Faça alíquotas de 25 mL e guarde-as a -20 °C (pode ser armazenada por até 6 meses).
- Usando células HEK293T, realizar um ensaio duplo de luciferase TOPFLASH41,42 usando um reagente comercial de transfecção de DNA em uma proporção de 4,8:1 reagente para DNA com o diluente DMEM (alta glicose, piruvato). Adicionar 100 μL de meio R-spondin1 condicionado (ou meio basal para o controle negativo) a 100 μL de células transfectadas. Em seguida, realizar o ensaio de luciferase dupla de acordo com o protocolo do fabricante para verificar a atividade Wnt do meio R-spondin1 condicionado.
NOTA: O ensaio usa um plasmídeo TOP com leitura da atividade da luciferase Firefly e o plasmídeo FOP é usado como um controle negativo.
- Preparar meio basal (meio Ad-DF+++, conforme publicado anteriormente por Sachs et al.36).
Reagente Concentração de Estoques Concentração Final DMEM/F12 avançado 1x 1x GlutaMax 100x 1x HEPES 1 milh 10 mM Penicilina-estreptomicina 10.000 U/mL; 10.000 μg/mL 100 U/mL; 100 μg/mL
Tabela 1: Composição basal do meio Ad-DF+++. - Preparar meio completo para organoides mamários derivados de pacientes, conforme publicado anteriormente por Sachs et al.36.
Reagente Concentração de Estoques Concentração Final Mídia Ad-DF+++ 1x 1x R-spondin em casa 100% 10% Suplemento B-27 50x 1x Nicotinamida 1 milh 5 mM NAC 500 mM 1,25 mM Primocina 50 mg/mL 50 μg/mL Cabeça 100 μg/mL 100 ng/mL EGF Humano 5 μg/mL 5 ng/mL Heregulina β1/Neuregulina humana1 75 μg/mL 37,5 ng/mL Y-27632 Dicloridrato (Rho-Quinase) 100 mM 5 μM A83-01 5 mM 500 nM FGF-7 humano 100 μg/mL 5 ng/mL FGF-10 humano 1 mg/mL 20 ng/mL p38i 30 mM 498 nM
Tabela 2: Composição completa do meio para organoides mamários derivados da paciente. - Preparar 2 mg/mL de solução de colagenase IV pesando a quantidade necessária de colagenase IV em pó e solubilizando-a em meio basal Ad-DF+++. Filtrar através de um filtro de 0,22 μm antes da utilização.
- Preparar solução de albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% a partir de solução-estoque a 7,5% usando 1x solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco como diluente. Filtrar através de um filtro de 0,22 μm antes da utilização.
2. Estabelecimento do tumor de mama/organoides normais a partir do tecido ressecado (Figura 1)
- Transporte laboratorial de tumor de mama ressecado cirurgicamente/espécime de tecido normal para o laboratório em tubo cônico de 50 mL contendo Ad-DF+++. Conservar o tubo no gelo até ao início do isolamento.
- Descongelar uma garrafa de matriz de membrana basal no gelo ou durante a noite a 4 °C.
- Transfira o tecido ressecado para uma placa de Petri estéril de 10 cm. Examine macroscopicamente o tecido e anote se ele parece morfologicamente gorduroso, vascularizado ou necrótico. Além disso, registre o tamanho e a forma do tecido. O ideal é tirar uma foto do tecido com uma régua à vista (Figura 2).
- Pique o tecido em pedaços muito pequenos (~1 mm3) com um bisturi estéril nº 10 e transfira-o para um tubo cônico de 50 mL.
- Adicionar 10 mL de solução de colagenase IV 2 mg/mL e selar o tubo com um filme transparente. Coloque o tubo num agitador orbital a 37 °C a 140 rpm durante 30-90 minutos numa posição angulada (ângulo de ~30°).
- Durante a incubação, colocar uma alíquota de meio completo para pré-aquecer em um talão/banho-maria de 37 °C.
- A cada 15 min, ressuspenda o tecido misturando vigorosamente para cima e para baixo usando uma pipeta sorológica estéril de 5 mL. Pré-revestir a pipeta com solução de BSA a 0,5% para evitar a perda de tecido causada pela aderência da amostra à pipeta. Monitorar a dissociação ao longo do tempo observando o tubo cônico sob o microscópio em um aumento de 5x ou mais.
- Uma vez dissociado o tecido, centrifugar a 400 x g por 5 min. Aspirar o sobrenadante, adicionar 10 mL de Ad-DF+++ e centrifugar a 400 x g por 5 min.
- Descarte o sobrenadante com cuidado. Os pellets de tecido podem ocasionalmente estar soltos, por isso tenha cuidado ao aspirar. Repita a etapa mais uma vez.
- Se o pellet de tecido estiver parcialmente vermelho, adicionar 2 mL de tampão de lise de hemácias e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Não incube por mais tempo, pois isso reduzirá significativamente a viabilidade celular.
- Adicionar 10 mL de Ad-DF+++ ao tubo, centrifugar a 400 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 50-300 μL de matriz de membrana basal fria não diluída e misturar pipetando cuidadosamente para evitar a formação de bolhas.
NOTA: O volume da matriz de membrana basal adicionado depende do tamanho do pellet. Se não tiver certeza, plaqueie uma pequena cúpula de ~10 μL do pellet ressuspendido e observe a confluência sob o microscópio. Ajuste adicionando mais matriz de membrana basal, se necessário. Consulte a Figura 3 (imagem do dia 1) para obter uma densidade de semeadura de referência. - Placa de 300 μL de cúpula de matriz de membrana basal contendo organoides em cada poço de uma placa de cultura de tecidos pré-aquecida, marcada e de 6 poços. Consulte a Tabela 3 para obter a matriz de membrana basal recomendada e os volumes médios se usar placas diferentes.
Número de poços por placa Matriz de membrana basal por cúpula (μL) Meio por poço (μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (suspensão em vez de cúpula) 100
Tabela 3: Quantidade de matriz de membrana basal e meio de crescimento recomendado por poço com base no tamanho da placa. - Deixe a placa intacta no exaustor durante 5 minutos e, em seguida, coloque cuidadosamente na incubadora a 37 °C durante 20-30 minutos para que a cúpula da matriz da membrana basal se solidifique completamente.
- Adicionar 3 mL de meio pré-aquecido completo gota a gota a cada poço de uma placa de 6 poços e colocar na incubadora a 37 °C e 5% CO2. Tire imagens dos organoides usando uma objetiva de 5x em um microscópio de campo claro invertido.
- Reabastecer o meio a cada 4-8 dias com base no crescimento de organoides. Aspirar cuidadosamente o meio velho sem perturbar a cúpula e adicionar meio fresco e pré-aquecido gota a gota.
NOTA: O protocolo é o mesmo para estabelecer organoides de câncer de mama derivados do tumor ressecado e para organoides normais derivados de tecido mamário saudável ressecado (seja de tecido mamário adjacente e normal da mesma paciente ou tecido mamário saudável obtido de uma cirurgia de mamoplastia redutora).
3. Passaging e expansão de organoides mamários derivados da paciente em cultura
- Descongelar uma garrafa de matriz de membrana basal no gelo ou durante a noite a 4 °C.
- Levante a cúpula da matriz da membrana basal para o meio no poço usando um raspador de células ou uma ponta de pipeta de 1 mL.
- Pré-revestir a ponta da pipeta com solução de BSA a 0,5% e, em seguida, transferir a cúpula flutuante dos organoides com meio para um tubo cônico de 15 mL ou 50 mL, dependendo do número de poços a serem colhidos. Para mais de dois poços contendo 300 μL de cúpulas de matriz de membrana basal, utilizar um tubo cônico de 50 mL. Adicione 1x DPBS para aumentar o volume para pelo menos 5 mL.
- Gire os tubos a 400 x g por 5 min. A matriz da membrana basal com organoides forma uma camada no fundo. Aspirar cuidadosamente para remover o sobrenadante.
- Adicione 5-20 mL de 1x DPBS, dependendo do número de poços agrupados em um tubo. Pré-revestir uma pipeta descartável estéril com BSA 0,5% e misturar o pellet de matriz de membrana organóide-basal em DPBS uniformemente por pipetagem para cima e para baixo.
- Gire os tubos a 400 x g por 5 min. Aspirar e descartar cuidadosamente o sobrenadante.
- Adicionar ao tubo o reagente de dissociação celular três vezes o volume da matriz da membrana basal. Usando uma ponta de pipeta revestida com BSA a 0,5%, ressuspenda os organoides no reagente de dissociação celular.
- Colocar o tubo num agitador orbital a 37 °C a 140 rpm durante 8-15 minutos numa posição angulada. Monitore o tubo observando-o sob o microscópio a cada 5 min para garantir que os organoides sejam divididos em grupos menores.
- Adicione o meio basal (isto é, Ad-DF+++) em um volume igual ou maior que o reagente de dissociação celular e pipeta para misturar os organoides. Gire a 400 x g por 5 min em TR para obter uma pastilha organoide.
- Se o pellet contiver organoides ainda embutidos na matriz da membrana basal não dissolvida, repita as etapas 3,7-3,9 para um adicional de 5-8 minutos de tripsinização.
- Uma vez obtido um pellet organoide branco sem matriz de membrana basal não dissolvida, descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de Ad-DF+++ para ressuspender o pellet por pipetagem. Em seguida, adicione mais Ad-DF+++ até 10 mL.
- Gire a 400 x g por 5 min em RT para a etapa de lavagem. Aspirar e descartar o sobrenadante.
- Adicione a quantidade necessária de matriz de membrana basal aos organoides digeridos com base na razão de divisão apropriada (isso irá variar amplamente para cada linha organoide com base na taxa de crescimento). Consulte a Figura 3 (imagem do dia 1) para obter um exemplo de densidade de semeadura. Misture pipetando suavemente para cima e para baixo para evitar a criação de bolhas. Coloque imediatamente no gelo.
- Abra e rotule uma placa de 6 poços pré-aquecida. Recomenda-se plaquear uma cúpula de 10-20 μL no canto de um poço para observar a confluência sob o microscópio. Se os organoides forem confluentes, mais matriz de membrana basal pode ser adicionada para aumentar a razão de divisão.
- Placa de 300 μL cúpulas de organoides ressuspensas em matriz de membrana basal. Certifique-se de manter o tubo no gelo enquanto chapeia vários poços para que a matriz da membrana basal permaneça em solução.
- Deixe a placa intacta no exaustor durante 5 minutos e, em seguida, coloque cuidadosamente numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2 sem perturbar as cúpulas.
- Após 20-30 min, as cúpulas se solidificam. Adicionar 3 mL de meio completo pré-aquecido a cada poço e colocar a placa de volta na incubadora. Adicione meio fresco completo a cada 5-7 dias. Realizar testes de rotina das culturas para detecção de contaminação por micoplasma.
OBS: O protocolo para cultura de tumores de mama e organoides normais é o mesmo. No entanto, em nossa experiência, organoides normais tendem a crescer bem até a passagem 6-8 antes de desacelerar. É aconselhável fazer o maior número possível de estoques de passagem antecipada para pesquisas futuras.
4. Congelamento de organoides mamários derivados da paciente
- Passagem de poços confluentes de organoides para remoção de qualquer matriz de membrana basal, conforme indicado nos passos 3.1-3.12.
- Ressuspender o pellet de organoides em meio de congelamento celular (descongelado durante a noite a 4 ºC) com 1 mL de meio por 200-300 μL de volume de matriz da membrana basal antes da passagem. Execute uma contagem de células antes de congelar para referência. Aliquota um pequeno volume (pelo menos 100 μL) de células para passar por tripsinização adicional, se necessário, para obter células únicas, e depois contá-las usando uma máquina de contador de células.
- Transfira 1 mL de células para crióvios de 2 mL marcados com número de linha organoide, data e número de passagem. Certifique-se de rotular os tubos com um marcador permanente ou use criorótulos.
- Mova os frascos para injetáveis para um recipiente de congelação de células e transfira o recipiente para um congelador de -80 °C. Após a incubação durante a noite, os frascos estão prontos para serem movidos para um freezer de armazenamento de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
5. Descongelamento de organoides mamários derivados da paciente
- Descongelar uma garrafa de matriz de membrana basal no gelo ou durante a noite a 4 °C. Pré-aquecer o meio Ad-DF+++ a 37 °C. Alíquota 9 mL de meio pré-aquecido em tubos cônicos de 15 mL para cada frasco congelado.
- Descongelar rapidamente o frasco congelado de organoides, colocando-o num banho de contas a 37 °C. Borrifar etanol 70% e transferir o tubo para o gabinete de biossegurança.
- Enxaguar a ponta da pipeta com solução de BSA a 0,5% para evitar perda de organoides. Misture os organoides descongelados suavemente pipetando para cima e para baixo para misturar quaisquer organoides assentados no tubo.
- Transfira suavemente 1 mL de organoides congelados para 9 mL de Ad-DF+++ pré-aquecido de forma gota a gota. Gire as células a 400 x g por 5 min e, em seguida, descarte cuidadosamente o sobrenadante.
- Lave o pellet adicionando 10 mL de Ad-DF+++ pré-aquecido fresco ao pellet organoide e misture suavemente com uma pipeta pré-revestida com BSA a 0,5% para ressuspender o pellet. Gire as células a 400 x g por 5 min e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
- Coloque o pellet organoide no gelo e remova qualquer remanescente Ad-DF+++ cuidadosamente usando uma ponta de pipeta de volume menor. Ressuspender o pellet em 300 μL de matriz e placa de membrana basal em uma placa pré-aquecida de 6 poços. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
NOTA: Recomenda-se plaquear uma pequena cúpula de 10 μL do pellet ressuspendido em um canto do poço para discernir a confluência sob o microscópio. Se os organoides parecerem confluentes, diluir adicionando 300 μL de matriz de membrana basal à placa em dois poços de uma placa de 6 poços. - Após uma incubação de 20-30 min, adicionar 3 mL de meio completo pré-aquecido à cúpula solidificada.
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Representative Results
Estabelecemos um biobanco de organoides de tumor de mama derivados de pacientes compreendendo váriossubtipos11. Além disso, estabelecemos múltiplas linhagens organoides mamárias normais derivadas de amostras de tecido de mamoplastia redutora ou mama normal adjacente/distal de pacientes com CB usando a abordagem descrita na Figura 1.
As várias linhagens organoides de tumor de mama derivadas da paciente diferem em sua morfologia (Figura 2) e taxa de crescimento (Figura 3). Os organoides mamários normais e os poucos organoides derivados do carcinoma ductal in situ (CDIS) que estabelecemos assemelham-se à estrutura normal da mama, com luz central circundada por células ductais (Figura 2A,B). Organoides derivados de um carcinoma lobular invasivo (Figura 2C) tendem a formar estruturas frouxamente aderidas ao cacho de uva, como relatado anteriormente por outroslaboratórios36,43. Enquanto isso, organoides derivados de carcinomas ductais invasivos (câncer de mama positivo para receptor hormonal e triplo negativo) tendem a formar organoides densos, grandes e redondos (Figura 2D,E). Os organoides foram fixados com paraformaldeído a 4% seguido de inclusão em moldes de agarose a 2%. Em seguida, foram incluídos em parafina e cortes de 10 μm foram corados com hematoxilina e eosina (conforme descrito em Bhatia et al.11) para observação da morfologia.
Para demonstrar as diferenças na taxa de crescimento de diferentes linhagens organoides de tumor de mama derivadas de pacientes, 1.000 células únicas viáveis foram plaqueadas em solução de suspensão de matriz de membrana basal a 10% por placa de 96 poços, com seis repetições cada para determinar a viabilidade celular em diferentes momentos para monitorar o crescimento durante um período de 12 dias (Figura 3B ). A formação organoide foi medida usando um ensaio de viabilidade celular luminescente nos dias 3, 6, 9 e 12, com uma leitura basal no dia 1 após o plaqueamento. A Figura 3A mostra imagens de campo claro dos mesmos organoides expandidos em placas de 6 poços ao longo do tempo. Algumas linhas organoides derivadas do paciente têm um tempo de duplicação de 2 dias, enquanto outras levam 5 dias (Figura 3B).
Figura 1: Estabelecimento dos organoides mamários derivados da paciente. (A) Representação esquemática dos principais passos no estabelecimento de tumores mamários derivados da paciente ou organoides normais. (B) Imagens representativas mostrando o crescimento de organoides de tumor de mama derivados de pacientes com DS117T desde o estabelecimento (passagem 0) até a cultura de longo prazo (passagem 12). Setas azuis = material fibroso, setas amarelas = detritos/células mortas e setas vermelhas = tipos celulares de suporte do microambiente (principalmente fibroblastos). Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Organoides mamários derivados da paciente representando diferentes subtipos. Painel superior: diferenças morfológicas entre linhagens organoides derivadas de pacientes com tumores de mama (B-E) de diferentes subtipos histopatológicos e moleculares. (A) A figura representa organoides derivados de tecido mamário humano normal obtido pós-mamoplastia redutora. Barra de escala = 50 μm. Painel inferior: imagens coradas por H&E das mesmas linhas organoides. Barra de escala = 100 μm. Abreviação: TNBC = câncer de mama triplo negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Crescimento em cultura de diferentes organoides de tumor de mama derivados de pacientes. Imagens representativas de campo claro e curvas de viabilidade celular (A e B), medidas através de um ensaio de viabilidade celular luminescente, mostrando o crescimento em cultura de diferentes linhagens organoides de tumor de mama derivadas de pacientes ao longo de 12 dias. Barra de escala = 50 μm. As barras de erro representam MEV para n = 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso laboratório tem empregado com sucesso os protocolos acima para estabelecer organoides a partir de ressecções ou raspagens tumorais virgens. Também utilizamos este protocolo para desenvolver organoides normais a partir de tecido mamário obtido por mamoplastias redutoras ou de tecido mamário normal adjacente ou distal de pacientes com câncer. Cerca de 30%-40% dos tumores primários ressecados resultaram em culturas de organoides tumorais bem-sucedidas a longo prazo (>passagem 8). As linhagens organoides tumorais que diminuíram após algumas passagens ou tinham um crescimento de organoides normais ou células estromais, ou consistiam principalmente de células tumorais não proliferativas. Uma avaliação e modificação adicionais dos componentes do meio que atualmente favorecem o crescimento de células epiteliais, ou outros meios de pré-seleção das populações de células tumorais, devem melhorar a taxa de sucesso para o estabelecimento e cultivo a longo prazo de DOPs. Além disso, é altamente recomendável congelar vários frascos de organoides expandidos com sucesso e realizar testes de descongelamento em frascos congelados para cada linha de organoides estabelecida para autenticar seu sucesso a longo prazo em cultura.
Algumas linhagens organoides bem-sucedidas que diminuem às vezes na cultura ou lutam para se recuperar de um degelo muitas vezes se beneficiam do aumento da densidade de semeadura. Observa-se maior confluência para ajudar a estimular o crescimento mais rápido para a maioria das linhagens, provavelmente como resultado de interações célula-célula ou fatores secretados. Além disso, filtrar os organoides (após a tripsinização) através de um filtro de 70-100 μm pode ajudar a remover detritos acumulados de organoides mortos que às vezes aparecem após o descongelamento de algumas linhas organoides e tendem a dificultar seu crescimento. No entanto, deve-se notar que algum material organoide saudável também é perdido no processo de filtragem. Certas linhagens de organoides que expressam o receptor de estrogênio (ER+) podem ser de crescimento lento em comparação com o TNBC, e poderiam potencialmente se beneficiar da adição de estradiol ao meio. Recomendamos que as linhagens organoides de tumor de mama derivadas de pacientes estabelecidas sejam caracterizadas genoma e transcriptologicamente. Isso pode ser feito utilizando várias técnicas, tais como avaliação imunohistoquímica para as características patológicas e genéticas dos tumores dos pacientes (expressão do receptor de estrogênio, receptor de progesterona, fator de crescimento epidérmico humano 2, Caderina, Ki-67, etc.), sequenciamento de RNA, sequenciamento de RNA de célula única, sequenciamento de DNA para genes condutores de câncer, variações no número de cópias, etc. Para estudos mecanísticos e de resposta a drogas, deve-se considerar os inibidores específicos que são componentes do meio e quaisquer tratamentos prévios recebidos pelo paciente antes da cirurgia.
Linhagens de organoides tumorais derivadas de diferentes pacientes variam em mutações genômicas, transcriptômica, morfologia, taxa de crescimento, capacidade de formar grandes organoides, presença de populações celulares heterogêneas, etc. Essas diferenças representam desafios para estabelecê-las e cultivá-las, no entanto, elas também tornam os organoides modelos robustos que representam tanto a diversidade de pacientes quanto a complexidade tumoral. Demonstrou-se que organoides derivados de tumores de mama recapitulam os tumores originais da paciente nos níveis genômico, transcriptômico11,36 e metabolômico44. Todos esses fatores os tornam ferramentas poderosas para triagem de drogas e precisão oncológica39. Os organoides derivados do paciente são um novo e excitante sistema modelo que servirá como modelos tridimensionais in vitro para estudar a biologia do câncer, bem como examinar questões terapeuticamente importantes para o avanço do campo da medicina personalizada. Organoides mamários normais e tumorais podem ser geneticamente modificados via engenharia CRISPR15,38, o que favorece seu uso para estudos genéticos mecanísticos para tumorigênese e progressão do câncer. Organoides tumorais de mama derivados de pacientes também têm sido usados para desenvolver modelos de xenoenxerto11,38,39 que podem potencialmente mimetizar o crescimento tumoral em pacientes. Além disso, os sistemas de co-cultura organoide de tumor de mama derivados de pacientes permanecem uma área de pesquisa pouco explorada que pode fornecer insights poderosos sobre a importância do crosstalk entre células de câncer de mama e outras células, como fibroblastos associados ao câncer estromal, células imunológicas, adipócitos, etc. na progressão tumoral.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Spector pelas discussões críticas ao longo deste trabalho. Agradecemos a Norman Sachs e Hans Clevers (Instituto Hubrecht, Holanda) por inicialmente nos fornecerem seu protocolo de cultura de organoides. Agradecemos aos Recursos Compartilhados de Histologia e Microscopia do CSHL Cancer Center pelos serviços e conhecimento técnico (NCI 2P3OCA45508). Agradecemos ao Dr. Qing Gao pela assistência na preparação da amostra histológica. Somos gratos pelo apoio da Dra. Karen Kostroff (Northwell Health) por fornecer amostras de tumores de pacientes. Também agradecemos os esforços da equipe do Northwell Health Biobanking para a aquisição de amostras e agradecemos aos pacientes e suas famílias pela doação de tecidos para pesquisa. Esta pesquisa foi apoiada por CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) e Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson e D.L.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
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