Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Создание и культивирование органоидов молочной железы пациента

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64889
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2Genetics Graduate Program, Stony Brook University

Summary

Здесь приведен подробный протокол для определения органоидов молочной железы человека из резекций опухоли молочной железы пациента или нормальной ткани молочной железы. Протокол содержит исчерпывающие пошаговые инструкции по культивированию, замораживанию и размораживанию органоидов молочной железы, полученных от пациентов.

Abstract

Рак молочной железы является сложным заболеванием, которое было классифицировано на несколько различных гистологических и молекулярных подтипов. Органоиды опухолей молочной железы, полученные от пациентов, разработанные в нашей лаборатории, состоят из смеси нескольких популяций клеток, полученных из опухоли, и, таким образом, представляют собой лучшее приближение к разнообразию опухолевых клеток и среде, чем установленные 2D-линии раковых клеток. Органоиды служат идеальной моделью in vitro , позволяющей взаимодействовать между клетками и внеклеточным матриксом, которые, как известно, играют важную роль в межклеточных взаимодействиях и прогрессировании рака. Органоиды, полученные от пациентов, также имеют преимущества перед мышиными моделями, поскольку они имеют человеческое происхождение. Кроме того, было показано, что они повторяют геномную, транскриптомную, а также метаболическую гетерогенность опухолей пациентов; Таким образом, они способны представлять сложность опухоли, а также разнообразие пациентов. В результате они готовы предоставить более точную информацию об обнаружении и проверке мишеней, а также анализах чувствительности к лекарственным средствам. В этом протоколе мы предоставляем подробную демонстрацию того, как органоиды молочной железы, полученные от пациента, создаются из резецированных опухолей молочной железы (раковых органоидов) или ткани молочной железы, полученной из редуктивной маммопластики (нормальные органоиды). Затем следует всесторонний отчет о 3D-культуре органоидов, расширении, прохождении, замораживании, а также размораживании культур органоидов молочной железы, полученных от пациентов.

Introduction

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто встречающимся злокачественным новообразованием у женщин: по оценкам, в 2022 году в Соединенных Штатах будет диагностировано 287 850 новых случаев1. Несмотря на недавние достижения в области раннего выявления с ежегодными скринингами, таргетной терапией и лучшим пониманием генетической предрасположенности, он является второй по значимости причиной смерти от рака у женщин в Соединенных Штатах, с > 40 000 смертей ежегодно от рака молочной железы1. Рак молочной железы в настоящее время классифицируется на несколько подтипов на основе гистопатологической и молекулярной оценки первичной опухоли. Лучшая стратификация подтипов улучшила результаты лечения пациентов с вариантами лечения для конкретных подтипов2. Например, идентификация HER2 как протоонкогена3 привела к разработке трастузумаба, который сделал этот высокоагрессивный подтип управляемым у большинства пациентов4. Дальнейшие исследования генетики и транскриптомики этого сложного заболевания с учетом специфики пациента помогут в разработке и прогнозировании более эффективных персонализированных схем лечения для конкретного пациента 2,5. Органоиды, полученные от пациентов (PDO), являются многообещающей новой моделью для получения информации о раке на молекулярном уровне, выявления новых мишеней или биомаркеров и разработки новых стратегий лечения 6,7,8.

PDO представляют собой многоклеточные трехмерные (3D) структуры, полученные из недавно резецированных первичных образцов тканей 8,9. Они выращиваются трехмерно, будучи встроенными в гидрогелевую матрицу, обычно состоящую из комбинации белков внеклеточного матрикса (ECM), и, следовательно, могут использоваться для изучения взаимодействий опухолевой клетки с ECM. PDO представляют разнообразие пациентов и повторяют клеточную гетерогенность и генетические особенности опухоли10,11,12. Будучи моделями in vitro, они позволяют проводить генетические манипуляции и высокопроизводительные скрининги лекарств13,14,15. Кроме того, PDO могут быть правдоподобно использованы для оценки чувствительности пациента к лекарственным средствам и стратегий лечения параллельно с клиникой и помогают прогнозировать результаты лечения пациентов16,17,18. Помимо химиотерапии, некоторые органоидные модели также использовались для изучения индивидуальных реакций пациентов на химиолучевую терапию19,20. Учитывая многообещающую применимость PDO для исследований и клинического использования, Национальный институт рака инициировал международный консорциум The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21 для создания и предоставления этих новых моделей рака, полученных из опухолей. Многие из органоидных моделей различных типов рака, разработанных с помощью HCMI, доступны через Американскую коллекцию типовых культур (ATCC)22.

Было показано, что нормальные органоиды молочной железы состоят из различных популяций эпителиальных клеток, присутствующих в молочной железе 11,23, и, таким образом, служат отличными моделями для изучения основных биологических процессов, анализа мутаций-драйверов, вызывающих онкогенез, и для исследований происхождения раковых клеток 6,15 . Органоидные модели опухолей молочной железы были использованы для идентификации новых мишеней, которые обнадеживают перспективы для разработки новых методов лечения, особенно для резистентных опухолей24,25,26. Используя ксенотрансплантат пациента (PDX) и соответствующие модели органоидов, полученных из PDX (PDxO) резистентных к лечению опухолей молочной железы, Guillen et al. показали, что органоиды являются мощными моделями для точной медицины, которые могут быть использованы для параллельной оценки реакции на лекарства и принятия решений о прямой терапии28. Кроме того, разработка новых методов совместного культивирования ЗОП с различными иммунными клетками27,28,29, фибробластами 30,31 и микробами 32,33 дает возможность изучить влияние микроокружения опухоли на прогрессирование рака. В то время как многие такие методы совместного культивирования активно внедряются для PDO, полученных из опухолей поджелудочной железы или колоректальных опухолей, аналогичные установленные методы совместного культивирования PDO молочной железы были зарегистрированы только для естественных клеток-киллеров34 и фибробластов35.

Первый биобанк из >100 органоидов, полученных от пациентов, представляющих различные подтипы рака молочной железы, был разработан группой Ханса Клеверса36,37. В рамках этих усилий группа Clevers также разработала первую сложную питательную среду для роста органоидов молочной железы, которая в настоящее время широко используется36. Последующее исследование предоставило всесторонний отчет о создании и культивировании PDO молочной железы и органоидных ксенотрансплантатов, полученных от пациентов (PDOX)38. Лаборатория Welm разработала большую коллекцию моделей BC PDX и PDxO, которые культивируются в сравнительно более простой питательной среде, содержащей эмбриональную бычью сыворотку (FBS) и меньшее количество факторов роста39,40. Мы независимо разработали и охарактеризовали большой массив наивных моделей органоидов рака молочной железы11 и участвовали в разработке моделей BC PDO в рамках инициативыHCMI 21. Здесь мы стремимся предоставить практическое руководство с подробным описанием методологии, используемой нами при создании систем моделей органоидов молочной железы, полученных от пациентов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Резекции опухолей у пациентов с раком молочной железы вместе с дистальными и прилегающими нормальными тканями были получены от Northwell Health в соответствии с протоколами Институционального наблюдательного совета IRB-03-012 и IRB 20-0150 и с письменного информированного согласия пациентов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, упомянутые ниже, были выполнены в комнате культуры тканей млекопитающих BSL2, предназначенной для образцов пациентов, после одобрения комитета по биобезопасности. Все процедуры должны выполняться в соответствии с протоколами безопасности, поддерживающими асептические условия в шкафах биобезопасности. Каждая стадия центрифугирования выполняется при комнатной температуре (RT), если не указано иное. Ткани / органоиды и матричные запасы базальной мембраны всегда помещаются на лед, если не указано иное. Новые тарелки инкубируют в течение ночи для предварительного разогрева. Нанесение куполов на предварительно разогретые плиты обеспечивает наилучшие результаты для получения округлых куполов, которые не сплющиваются при нанесении покрытия или не отрываются позже от поверхности плиты.

1. Средняя подготовка и рецепты

  1. Подготовьте кондиционированную среду R-спондин1, как описано ниже (в качестве альтернативы можно купить в продаже).
    1. Приготовьте две отдельные питательные среды, состоящие из модифицированной среды орла (DMEM) Дульбекко, 10% FBS, 5% пенициллина-стрептомицина и с добавлением цеоцина 300 мкг / мл или без него.
    2. Разморозьте флакон с клетками HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (полученными в лаборатории Кельвина Куо в Стэнфордском университете, а также коммерчески доступными) в колбе для культуры тканей размером 75 см2 с 15 мл среды.
    3. Разделите клетки на 2 колбы для культивированияразмером 2 x 175 см, каждая из которых содержит 35 мл среды, содержащей цеоцин.
    4. Снова пройдите через ячейки, чтобы получить столько колб, сколько необходимо для получения желаемой партии кондиционированной среды R-спондина1. Используйте питательную среду без зеоцина.
    5. Когда колбы, содержащие среду без зеоцина, сливаются, удалите и замените питательную среду Ad-DF+++ (этап 1.2; Таблица 1). Поместите клетки в инкубатор с температурой 37 °C с 5%CO2 на 1 неделю.
    6. Открутите среду до 400 x g в течение 5 минут, чтобы удалить все неприкрепленные клетки. Отфильтруйте среду через фильтр 0,22 мкм. Сделайте аликвоты объемом 25 мл и храните их при температуре -20 °C (можно хранить до 6 месяцев).
    7. Используя клетки HEK293T, проведите двойной анализ люциферазы TOPFLASH41,42 с использованием коммерческого реагента для трансфекции ДНК с соотношением реагента к ДНК 4,8: 1 с разбавителем DMEM (высокое содержание глюкозы, пируват). Добавьте 100 мкл кондиционированной среды R-спондина1 (или базальной среды для отрицательного контроля) к 100 мкл трансфицированных клеток. Затем выполните двойной анализ люциферазы в соответствии с протоколом производителя, чтобы проверить активность Wnt кондиционированной среды R-спондин1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В анализе используется плазмида TOP со считыванием активности люциферазы Firefly, а плазмида FOP используется в качестве отрицательного контроля.
  2. Подготовьте базальную среду (среда Ad-DF+++, как ранее было опубликовано Sachs et al.36).
    Реагент Концентрация запасов Окончательная концентрация
    Усовершенствованный DMEM/F12 1x 1x
    ГлутаМакс В 100 раз 1x
    ХЕПЕС 1 м 10 мМ
    Пенициллин-стрептомицин 10 000 ЕД/мл; 10 000 мкг/мл 100 ЕД/мл; 100 мкг/мл

    Таблица 1: Базальный состав среды Ad-DF+++.
  3. Подготовьте полную среду для органоидов молочной железы, полученных от пациента, как ранее было опубликовано Sachs et al.36.
    Реагент Концентрация запасов Окончательная концентрация
    Среда Ad-DF+++ 1x 1x
    Р-спондин на собственном производстве 100% 10%
    Дополнение B-27 В 50 раз 1x
    Никотинамид 1 м 5 мМ
    НАК 500 мМ 1,25 мМ
    Примоцин 50 мг/мл 50 мкг/мл
    Башка 100 мкг/мл 100 нг/мл
    ЭФР человека 5 мкг/мл 5 нг/мл
    Герегулин человека β1/Неврегулин1 75 мкг/мл 37,5 нг/мл
    Y-27632 дигидрохлорид (Rho-киназа) 100 мМ 5 мкМ
    А83-01 5 мМ 500 нМ
    Человеческий FGF-7 100 мкг/мл 5 нг/мл
    Человеческий FGF-10 1 мг/мл 20 нг/мл
    П38И 30 мМ 498 нМ

    Таблица 2: Полный состав среды для органоидов молочной железы пациента.
  4. Приготовьте 2 мг/мл раствора коллагеназы внутривенно, взвесив необходимое количество порошка коллагеназы IV и солюбилизировав его в базальной среде Ad-DF+++. Перед использованием фильтр процедите через фильтр 0,22 мкм.
  5. Приготовьте 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) из 7,5% исходного раствора, используя 1x фосфатный буферный физиологический раствор Dulbecco (DPBS) в качестве разбавителя. Перед использованием фильтр процедите через фильтр 0,22 мкм.

2. Определение опухоли молочной железы / нормальных органоидов из резецированной ткани (рис. 1)

  1. Транспортируйте хирургически резецированный образец опухоли молочной железы / нормальной ткани в лабораторию в конической пробирке объемом 50 мл, содержащей Ad-DF+++. Храните пробирку на льду до начала изоляции.
  2. Разморозьте бутылку матрицы базальной мембраны на льду или на ночь при температуре 4 °C.
  3. Перенесите резецированную ткань в стерильную чашку Петри диаметром 10 см. Осмотрите ткань макроскопически и отметьте, кажется ли она морфологически жирной, васкуляризированной или некротической. Дополнительно запишите размер и форму ткани. В идеале сфотографируйте ткань с линейкой в поле зрения (рисунок 2).
  4. Измельчите ткань на очень мелкие кусочки (~ 1 мм3) стерильным скальпелем No 10 и перенесите ее в коническую пробирку объемом 50 мл.
  5. Добавьте 10 мл 2 мг / мл раствора коллагеназы для внутривенного введения и запечатайте пробирку прозрачной пленкой. Поместите трубку на орбитальный шейкер при 37 °C при 140 об/мин на 30-90 мин под углом (угол ~30°).
  6. Во время инкубации поместите аликвоту полной среды для предварительного нагрева на водяной бане с температурой 37 °C.
  7. Каждые 15 минут ресуспендируйте ткань, энергично перемешивая вверх и вниз стерильной серологической пипеткой объемом 5 мл. Предварительно покройте пипетку 0,5% раствором BSA, чтобы предотвратить потерю ткани, вызванную прилипанием образца к пипетке. Отслеживайте диссоциацию с течением времени, наблюдая за конической трубкой под микроскопом при 5-кратном или более увеличении.
  8. После диссоциации ткани центрифугу при 400 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость, добавьте 10 мл Ad-DF+++ и центрифугу при 400 x g в течение 5 мин.
  9. Тщательно выбросьте надосадочную жидкость. Гранулы ткани иногда могут быть рыхлыми, поэтому будьте осторожны при аспирации. Повторите этот шаг еще раз.
  10. Если тканевая гранула частично красная, добавьте 2 мл буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Не стоит инкубировать дольше, так как это значительно снизит жизнеспособность клеток.
  11. Добавьте 10 мл Ad-DF+++ в пробирку, центрифугу при 400 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулы в 50-300 мкл неразбавленной холодной матрицы базальной мембраны и тщательно перемешайте пипеткой, чтобы избежать образования пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем добавляемой матрицы базальной мембраны зависит от размера гранул. Если вы не уверены, поместите небольшой купол ~ 10 мкл из ресуспендированной гранулы и наблюдайте за слиянием под микроскопом. Отрегулируйте, добавив больше матрицы базальной мембраны, если это необходимо. На рисунке 3 (изображение 1-го дня) приведена эталонная плотность посева.
  12. Пластина 300 мкл матричного купола базальной мембраны, содержащего органоиды в каждой лунке предварительно разогретой, меченой, 6-луночной пластины для культивирования тканей. В таблице 3 приведены рекомендуемые матрицы базальной мембраны и средние объемы при использовании разных пластин.
    Количество лунок на плиту Матрица базальной мембраны на купол (мкл) Среда на лунку (мкл)
    6 300 3000
    12 100 1000
    24 50 500
    48 25 250
    96 10 (подвеска вместо купола) 100

    Таблица 3: Рекомендуемое количество матрицы базальной мембраны и питательной среды на скважину в зависимости от размера пластины.
  13. Оставьте пластину нетронутой в колпаке на 5 минут, а затем осторожно поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 20-30 минут, чтобы купол матрицы базальной мембраны полностью затвердел.
  14. Добавьте 3 мл предварительно подогретой полной среды по каплям в каждую лунку 6-луночной пластины и поместите в инкубатор при температуре 37 ° C и 5% CO2. Сделайте снимки органоидов с помощью 5-кратного объектива на инвертированном светлопольном микроскопе.
  15. Пополняют среду каждые 4-8 дней исходя из роста органоидов. Тщательно аспирируйте старую среду, не нарушая купола, и добавьте свежую, предварительно разогретую среду по каплям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол одинаков для установления органоидов рака молочной железы, полученных из резецированной опухоли, и для нормальных органоидов, полученных из резецированной здоровой ткани молочной железы (либо из соседней и нормальной ткани молочной железы той же пациентки, либо из здоровой ткани молочной железы, полученной в результате операции редукционной маммопластики).

3. Пассирование и расширение органоидов молочной железы, полученных от пациентов, в культуре

  1. Разморозьте бутылку матрицы базальной мембраны на льду или на ночь при температуре 4 °C.
  2. Поднимите матричный купол базальной мембраны в среду в лунке с помощью клеточного скребка или наконечника пипетки объемом 1 мл.
  3. Предварительно покройте наконечник пипетки 0,5% раствором BSA, а затем перенесите плавающий купол органоидов со средой в коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл, в зависимости от количества собираемых лунок. Для более чем двух скважин, содержащих 300 мкл матричных куполов базальной мембраны, используйте коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 1x DPBS, чтобы увеличить объем как минимум до 5 мл.
  4. Отжимайте тюбики при дозе 400 х г в течение 5 мин. Матрикс базальной мембраны с органоидами образует слой на дне. Тщательно аспирируйте, чтобы удалить надосадочную жидкость.
  5. Добавьте 5-20 мл 1x DPBS, в зависимости от количества лунок, объединенных в пробирку. Предварительно покройте стерильную одноразовую пипетку 0,5% BSA и равномерно перемешайте гранулы матрицы органоидно-базальной мембраны в DPBS путем пипетки вверх и вниз.
  6. Отжимайте тюбики при дозе 400 х г в течение 5 мин. Тщательно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
  7. Добавьте в пробирку реагент для диссоциации клеток, в три раза превышающий объем матрицы базальной мембраны. Используя наконечник пипетки, покрытый 0,5% BSA, ресуспендируйте органоиды в реагенте для диссоциации клеток.
  8. Поместите трубку на орбитальный шейкер при 37 °C при 140 об/мин на 8-15 мин в угловом положении. Контролируйте пробирку, наблюдая за ней под микроскопом каждые 5 минут, чтобы убедиться, что органоиды разбиты на более мелкие кластеры.
  9. Добавьте базальную среду (т.е. Ad-DF+++) в объеме, равном или превышающем реагент для диссоциации клеток, и пипетку смешайте органоиды. Отжим при 400 x g в течение 5 мин при RT для получения органоидной гранулы.
  10. Если гранула содержит органоиды, все еще встроенные в нерастворенную матрицу базальной мембраны, повторите шаги 3,7-3,9 для дополнительных 5-8 минут трипсинизации.
  11. Как только будет получена белая органоидная гранула без нерастворенной матрицы базальной мембраны, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл Ad-DF+++, чтобы ресуспендировать гранулу путем пипетирования. Затем добавьте больше Ad-DF+++ до 10 мл.
  12. Отжим при 400 x g в течение 5 минут при RT для этапа стирки. Аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.
  13. Добавьте необходимое количество матрицы базальной мембраны к расщепленным органоидам на основе соответствующего коэффициента расщепления (это будет широко варьироваться для каждой линии органоидов в зависимости от скорости роста). На рисунке 3 (изображение 1-го дня) приведен пример плотности посева. Перемешайте, аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков. Сразу же выложите на лед.
  14. Откройте и пометьте предварительно разогретую 6-луночную тарелку. Рекомендуется установить купол объемом 10-20 мкл в углу лунки, чтобы наблюдать слияние под микроскопом. Если органоиды сливаются, можно добавить больше матрицы базальной мембраны, чтобы увеличить коэффициент расщепления.
  15. Пластинчатые купола органоидов объемом 300 мкл, ресуспендированные в матрице базальной мембраны. Убедитесь, что трубка остается на льду при обшивке нескольких лунок, чтобы матрица базальной мембраны оставалась в растворе.
  16. Оставьте тарелку нетронутой в вытяжке на 5 минут, а затем осторожно поместите в инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO2 , не нарушая купола.
  17. Через 20-30 мин купола затвердевают. Добавьте по 3 мл предварительно подогретой полной среды в каждую лунку и поместите тарелку обратно в инкубатор. Добавляйте свежую полноценную среду каждые 5-7 дней. Проведите рутинное тестирование культур на предмет выявления микоплазменного загрязнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол культивирования опухолей молочной железы и нормальных органоидов одинаков. Однако, по нашему опыту, нормальные органоиды, как правило, хорошо растут до прохода 6-8, прежде чем замедлиться. Желательно сделать как можно больше запасов раннего прохода для будущих исследований.

4. Замораживание органоидов молочной железы, полученных от пациента

  1. Проход сливающихся лунок органоидов для удаления любой базальной мембраны матрицы, как указано в шагах 3.1-3.12.
  2. Ресуспендируют гранулы органоидов в среде для замораживания клеток (размороженной в течение ночи при 4 ºC) с 1 мл среды на 200-300 мкл объема матрикса базальной мембраны перед пассажем. Выполните подсчет ячеек перед замораживанием для справки. Аликвотируйте небольшой объем (не менее 100 мкл) клеток для дальнейшей трипсинизации, если это необходимо, чтобы получить единичные клетки, а затем подсчитайте их с помощью счетчика клеток.
  3. Перенесите 1 мл клеток в криовиалы объемом 2 мл, помеченные номером органоидной линии, датой и номером прохода. Обязательно пометьте пробирки перманентным маркером или используйте криометки.
  4. Переместите флаконы в контейнер для замораживания клеток и перенесите контейнер в морозильную камеру с температурой -80 °C. После инкубации в течение ночи флаконы готовы к перемещению в морозильную камеру для хранения жидкого азота для длительного хранения.

5. Размораживание органоидов молочной железы, полученных от пациента

  1. Разморозьте бутылку матрицы базальной мембраны на льду или на ночь при температуре 4 °C. Предварительно разогрейте среду Ad-DF+++ при температуре 37 °C. Аликвот 9 мл предварительно подогретой среды в конические пробирки по 15 мл для каждого замороженного флакона.
  2. Быстро разморозьте замороженный флакон с органоидами, поместив его в ванну с шариками при температуре 37 °C. Распылите 70% этанол и перенесите трубку в шкаф биобезопасности.
  3. Промойте наконечник пипетки 0,5% раствором BSA, чтобы избежать потери органоидов. Аккуратно перемешайте размороженные органоиды, пипеткой вверх и вниз, чтобы смешать все осевшие органоиды в пробирке.
  4. Аккуратно перенесите 1 мл замороженных органоидов в 9 мл предварительно подогретого Ad-DF+++ по каплям. Отжимайте клетки при 400 x g в течение 5 мин, а затем осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Вымойте гранулы, добавив 10 мл свежего предварительно подогретого Ad-DF+++ в органоидную гранулу, и аккуратно перемешайте пипеткой, предварительно покрытой 0,5% BSA, чтобы ресуспендировать гранулы. Закрутите клетки при 400 х г в течение 5 мин и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Поместите органоидную гранулу на лед и осторожно удалите остатки Ad-DF+++, используя наконечник пипетки меньшего объема. Ресуспендировать гранулу в 300 мкл матрицы базальной мембраны и пластины в предварительно разогретой 6-луночной пластине. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C с 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется поместить небольшой купол объемом 10 мкл из ресуспендированной гранулы в углу лунки, чтобы различить слияние под микроскопом. Если органоиды выглядят сливающимися, разбавьте, добавив 300 мкл матрицы базальной мембраны на пластину в две лунки 6-луночной пластины.
  7. После 20-30-минутной инкубации добавьте 3 мл предварительно подогретой полной среды в затвердевший купол.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы создали биобанк органоидов опухолей молочной железы, полученных от пациентов, включающий различные подтипы11. Кроме того, мы установили несколько нормальных органоидных линий молочной железы, полученных из образцов тканей редуктивной маммопластики или смежной/дистальной нормальной груди у пациентов с РМЖ, используя подход, описанный на рисунке 1.

Различные органоидные линии опухолей молочной железы, полученные от пациентов, различаются по морфологии (рис. 2) и скорости роста (рис. 3). Нормальные органоиды молочной железы и несколько установленных нами органоидов, полученных из ранней протоковой карциномы in situ (DCIS), напоминают нормальную структуру молочной железы с центральным просветом, окруженным протоковыми клетками (рис. 2A, B). Органоиды, полученные из инвазивной лобулярной карциномы (рис. 2C), имеют тенденцию образовывать слабо прикрепленные виноградные грозди, как сообщалось ранее в других лабораториях36,43. Между тем, органоиды, полученные из инвазивных протоковых карцином (гормональный рецептор-положительный и тройной отрицательный рак молочной железы), имеют тенденцию образовывать плотные, большие и круглые органоиды (рис. 2D, E). Органоиды фиксировали 4% параформальдегидом с последующим встраиванием в 2% агарозные формы. Затем в них вставляли парафин, а срезы размером 10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (как описано в Bhatia et al.11) для наблюдения за морфологией.

Чтобы продемонстрировать различия в скорости роста различных органоидных линий опухоли молочной железы, полученных от пациентов, 1000 жизнеспособных одиночных клеток были помещены в 10% суспензионный раствор матричного матрикса базальной мембраны на 96-луночную пластину, с шестью репликами для определения жизнеспособности клеток в разные моменты времени для мониторинга роста в течение 12 дней (рис. 3B ). Образование органоидов измеряли с помощью анализа жизнеспособности люминесцентных клеток на 3, 6, 9 и 12-й дни с базовым показанием на 1-й день после нанесения покрытия. На рисунке 3А показаны изображения в светлом поле тех же органоидов, расширенных в 6-луночных пластинах с течением времени. Некоторые линии органоидов, полученные от пациентов, имеют время удвоения 2 дня, в то время как некоторые занимают 5 дней (рис. 3B).

Figure 1
Рисунок 1: Установление органоидов молочной железы, полученных от пациента. (A) Схематическое изображение основных этапов в установлении опухолей молочной железы или нормальных органоидов, полученных от пациентов. (B) Репрезентативные изображения, показывающие рост органоидов опухоли молочной железы, полученных от пациентов DS117T, от укоренения (отрывок 0) до долгосрочного культивирования (пассаж 12). Синие стрелки = волокнистый материал, желтые стрелки = мусор / мертвые клетки, а красные стрелки = поддерживающие типы клеток из микроокружения (в основном фибробласты). Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Органоиды молочной железы, полученные от пациентов, представляющие различные подтипы. Верхняя панель: морфологические различия между органоидными линиями, полученными из опухолей молочной железы пациенток (B-E) различных гистопатологических и молекулярных подтипов. (A) На рисунке представлены органоиды, полученные из нормальной ткани молочной железы человека, полученной после операции по восстановительной маммопластике. Масштабная линейка = 50 мкм. Нижняя панель: окрашенные H&E изображения тех же линий органоидов. Масштабная линейка = 100 мкм. Аббревиатура: TNBC = тройной негативный рак молочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Рост в культуре различных органоидов опухолей молочной железы, полученных от пациентов. Репрезентативные изображения яркого поля и кривые жизнеспособности клеток (A и B), измеренные с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток, показывающего рост в культуре различных органоидных линий опухоли молочной железы пациента в течение 12 дней. Масштабная линейка = 50 мкм. Полосы погрешностей представляют собой SEM для n = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наша лаборатория успешно использовала вышеуказанные протоколы для создания органоидов из наивных опухолевых резекций или соскобов. Мы также использовали этот протокол для разработки нормальных органоидов из ткани молочной железы, полученной с помощью восстановительной маммопластики, или из прилегающей или дистальной нормальной ткани молочной железы больных раком. Около 30-40% резецированных первичных опухолей привели к успешным долгосрочным (>пассаж 8) опухолевым органоидным культурам. Опухолевые органоидные линии, которые сужались после нескольких проходов, либо имели рост нормальных органоидов или стромальных клеток, либо состояли в основном из непролиферативных опухолевых клеток. Дальнейшая оценка и модификация компонентов среды, которые в настоящее время благоприятствуют росту эпителиальных клеток, или другие средства предварительного отбора популяций опухолевых клеток, должны повысить вероятность успеха в создании и долгосрочном культивировании PDO. Кроме того, настоятельно рекомендуется заморозить несколько флаконов с успешно расширенными органоидами и провести испытания на размораживание замороженных флаконов для каждой установленной линии органоидов, чтобы подтвердить их долгосрочный успех в культуре.

Некоторые успешные органоидные линии, которые время от времени замедляются в культуре или изо всех сил пытаются восстановиться после оттепели, часто выигрывают от увеличения плотности посева. Наблюдается, что более высокая конфлюенция помогает стимулировать более быстрый рост для большинства линий, вероятно, в результате межклеточных взаимодействий или секретируемых факторов. Кроме того, фильтрация органоидов (после трипсинизации) через фильтр 70-100 мкм может помочь удалить мусор, накопленный из мертвых органоидов, которые иногда появляются после оттаивания некоторых органоидных линий и, как правило, препятствуют их росту. Однако следует отметить, что в процессе фильтрации также теряется некоторый здоровый органоидный материал. Некоторые органоидные линии, экспрессирующие рецептор эстрогена (ER +), могут быть медленными по сравнению с TNBC и потенциально могут извлечь выгоду из добавления эстрадиола в среду. Мы рекомендуем, чтобы установленные органоидные линии опухолей молочной железы, полученные от пациентов, были охарактеризованы геномно и транскриптомически. Это можно сделать с помощью нескольких методов, таких как иммуногистохимическая оценка патологических и генетических особенностей опухолей пациента (экспрессия рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эпидермального фактора роста человека 2, кадгерина, Ki-67 и т. д.), секвенирование РНК, секвенирование РНК одной клетки, секвенирование ДНК генов-драйверов рака, вариации числа копий и т. д. Для механистических исследований и исследований лекарственного ответа необходимо учитывать специфические ингибиторы, которые являются компонентами среды, и любое предшествующее лечение, полученное пациентом перед операцией.

Линии опухолевых органоидов, полученные от разных пациентов, различаются по геномным мутациям, транскриптомике, морфологии, скорости роста, способности образовывать большие органоиды, наличию гетерогенных клеточных популяций и т. д. Эти различия создают проблемы при их установлении и культивировании, однако они также делают органоиды надежными моделями, представляющими как разнообразие пациентов, так и сложность опухоли. Было показано, что органоиды, полученные из опухолей молочной железы, повторяют исходные опухоли пациентов на геномном, транскриптомном11,36 и метаболомном уровнях44. Все эти факторы делают их мощными инструментами для скрининга лекарств и прецизионной онкологии39. Органоиды, полученные от пациентов, представляют собой захватывающую новую модельную систему, которая будет служить трехмерными моделями in vitro для изучения биологии рака, а также для изучения терапевтически важных вопросов для развития области персонализированной медицины. Нормальные и опухолевые органоиды молочной железы могут быть генетически модифицированы с помощью инженерии CRISPR15,38, что приводит к их благоприятному использованию для механистических генетических исследований онкогенеза и прогрессирования рака. Органоиды опухолей молочной железы, полученные от пациентов, также использовались для разработки моделей ксенотрансплантатов 11,38,39, которые потенциально могут имитировать рост опухоли у пациентов. Кроме того, системы совместного культивирования органоидов опухолей молочной железы, полученные от пациентов, остаются малоизученной областью исследований, которая может дать мощное представление о важности перекрестных помех между клетками рака молочной железы и другими клетками, такими как фибробласты, связанные со стромальным раком, иммунные клетки, адипоциты и т. д. при опухолевом прогрессировании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Спектора за критические дискуссии на протяжении всей этой работы. Мы благодарим Нормана Сакса и Ханса Клеверса (Hans Clevers) из Института Хубрехта, Нидерланды за то, что они изначально предоставили нам свой протокол культивирования органоидов. Мы выражаем признательность Совместным ресурсам по гистологии и микроскопии Онкологического центра CSHL за услуги и техническую экспертизу (NCI 2P3OCA45508). Мы благодарим доктора Цин Гао за помощь в подготовке гистологического образца. Мы благодарны за поддержку доктору Карен Кострофф (Northwell Health) за предоставление пациентам образцов опухолей. Мы также высоко ценим усилия команды Northwell Health Biobanking по сбору образцов и благодарим пациентов и их семьи за пожертвование тканей для исследований. Это исследование было поддержано CSHL / Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) и Leidos Biomedical HHSN26100008 (Дэвид Тувесон и D.L.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tubes VWR 525-1068
175 cm2 tissue culture flask VWR (Corning) 29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conical tubes VWR 525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) Millipore Sigma SCGP00525 SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter Nalgene 566-0020
6-well culture plates  Greiner Cellstar 82050-842
75 cm2 tissue culture flask VWR (Corning) 29185-304
96-well opaque plates Corning 353296 For CTG assay
A83-01 Tocris 2939
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
B-27 supplement Life Technologies 12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader Fisher Scientific (Agilent) For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%) Thermo Fisher 15260037
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent Promega G9683 luminescent cell viability assay
Centrifuge  Eppendorf 5804
Collagenase from Clostridium histolyticum Millipore Sigma C5138 Type IV
Cryolabels Amazon DTCR-1000 Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials  Simport Scientific Inc. T311-1
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher AMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvate Thermo Fisher (Gibco) 11995040
Dual Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Gibco 14190-144 DPBS
Epidermal growth factor (hEGF) Peprotech AF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
FGF-10 (human) Peprotech 100-26
FGF-7/KGF (human) Peprotech 100-19
GlutaMax Life Technologies 35050061
HEK293T cells ATCC CRL-3216  For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells R&D Systems 3710-001-01 Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPES Life Technologies 15630-080
Heregulinβ-1 (human) Peprotech 100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) Corning 356231 Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing Container Thermo Fisher 5100-0001
Mycoplasma detection kit Lonza LT07-418
N-acetyl-l-cysteine Millipore Sigma A9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes Thermo Fisher 166-0045 
Nicotinamide Millipore Sigma N0636
Noggin (human) Peprotech 120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 Millipore Sigma S7067
Parafilm transparent film
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140122
Plasmid1: pRL-SV40P Addgene 27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash Addgene 12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash Addgene 12456
pluriStrainer 200 µm pluriSelect 43-50200-01
Primocin Invivogen ANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing Medium Thermo Fisher (Gibco) 12648-010 cell freezing medium
Red Blood Cell lysis buffer Millipore Sigma 11814389001
R-spondin conditioned media In-house or commercial from Peprotech 120-38
Scalpel (No.10) Sklar Instruments Jun-10
Shaker (Incu-shaker Mini) Benchmark H1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 Tocris 2939
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Life Technologies 12605028 cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Millipore Sigma 6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) Abmole Bioscience Y-27632
Zeocin Thermo Fisher R25001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
  3. di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
  4. Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
  5. Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
  6. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  7. Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
  8. Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
  9. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  10. Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. Á, Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
  11. Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  13. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
  14. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  15. Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
  16. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
  18. Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
  19. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
  20. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  21. HCMI Catalog. , Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022).
  22. Search ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022).
  23. Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  24. Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
  25. Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
  26. Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
  27. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  28. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  29. Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
  30. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
  31. Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
  32. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  33. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  34. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  35. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
  36. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  37. HUB Organoids: Patient in the lab. , Available from: https://www.huborganoids.nl (2022).
  38. Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
  39. Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
  40. PDX Portal. , Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022).
  41. Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
  42. Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
  43. Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
  44. Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).

Tags

Опровержение выпуск 192
Создание и культивирование органоидов молочной железы пациента
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aggarwal, D., Russo, S., Naik, P.,… More

Aggarwal, D., Russo, S., Naik, P., Bhatia, S., Spector, D. L. Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids. J. Vis. Exp. (192), e64889, doi:10.3791/64889 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter