Summary
Un protocole détaillé est fourni ici pour établir des organoïdes mammaires humains à partir de résections de tumeurs mammaires dérivées de patientes ou de tissu mammaire normal. Le protocole fournit des instructions complètes étape par étape pour la culture, la congélation et la décongélation d’organoïdes mammaires humains dérivés de patientes.
Abstract
Le cancer du sein est une maladie complexe qui a été classée en plusieurs sous-types histologiques et moléculaires différents. Les organoïdes tumoraux mammaires dérivés de patients développés dans notre laboratoire consistent en un mélange de plusieurs populations cellulaires dérivées de tumeurs et représentent donc une meilleure approximation de la diversité et du milieu des cellules tumorales que les lignées cellulaires cancéreuses 2D établies. Les organoïdes servent de modèle in vitro idéal, permettant des interactions de matrice cellule-extracellulaire, connues pour jouer un rôle important dans les interactions cellule-cellule et la progression du cancer. Les organoïdes dérivés de patients présentent également des avantages par rapport aux modèles murins car ils sont d’origine humaine. En outre, il a été démontré qu’ils récapitulent l’hétérogénéité génomique, transcriptomique et métabolique des tumeurs des patients; Ainsi, ils sont capables de représenter la complexité tumorale ainsi que la diversité des patients. En conséquence, ils sont prêts à fournir des informations plus précises sur la découverte et la validation des cibles et les tests de sensibilité aux médicaments. Dans ce protocole, nous fournissons une démonstration détaillée de la façon dont les organoïdes mammaires dérivés de patients sont établis à partir de tumeurs mammaires réséquées (organoïdes cancéreux) ou de tissus mammaires dérivés de mammoplasties réductrices (organoïdes normaux). Ceci est suivi d’un compte rendu complet de la culture organoïde 3D, de l’expansion, du passage, de la congélation, ainsi que de la décongélation de cultures organoïdes mammaires dérivées de patientes.
Introduction
Le cancer du sein (BC) est la tumeur maligne la plus fréquente chez les femmes, avec 287 850 nouveaux cas estimés diagnostiqués aux États-Unis en 20221. Malgré les progrès récents de la détection précoce avec des dépistages annuels, des thérapies ciblées et une meilleure compréhension de la prédisposition génétique, il prévaut être la deuxième cause de décès par cancer chez les femmes aux États-Unis, avec > 40 000 décès attribués au cancer du sein chaque année1. Le cancer du sein est actuellement classé en plusieurs sous-types basés sur l’évaluation histopathologique et moléculaire de la tumeur primaire. Une meilleure stratification des sous-types a amélioré les résultats pour les patients grâce à des options de traitement spécifiques au sous-type2. Par exemple, l’identification de HER2 en tant que proto-oncogène3 a conduit au développement du trastuzumab, ce qui a rendu ce sous-type très agressif gérable chez la plupart des patients4. D’autres recherches sur la génétique et la transcriptomique de cette maladie complexe d’une manière spécifique au patient aideront à développer et à prédire de meilleurs schémas thérapeutiques personnalisés spécifiques au patient 2,5. Les organoïdes dérivés de patients (AOP) sont un nouveau modèle prometteur pour mieux comprendre le cancer au niveau moléculaire, identifier de nouvelles cibles ou biomarqueurs et concevoir de nouvelles stratégies de traitement 6,7,8.
Les AOP sont des structures multicellulaires tridimensionnelles (3D) dérivées d’échantillons de tissus primaires fraîchement réséqués 8,9. Ils sont cultivés en trois dimensions en étant incorporés dans une matrice d’hydrogel, généralement composée d’une combinaison de protéines de la matrice extracellulaire (ECM), et peuvent donc être utilisés pour étudier les interactions cellule-ECM tumorale. Les AOP représentent la diversité des patients et récapitulent l’hétérogénéité cellulaire et les caractéristiques génétiques de la tumeur10,11,12. Étant des modèles in vitro, ils permettent la manipulation génétique et les criblages de médicaments à haut débit13,14,15. De plus, les AOP peuvent être utilisées de manière plausible pour évaluer la sensibilité des patients aux médicaments et les stratégies de traitement parallèlement à la clinique et aider à prédire les résultats pour les patients16,17,18. Outre la chimiothérapie, certains modèles organoïdes ont également été utilisés pour examiner les réponses individuelles des patients à la chimioradiothérapie19,20. Compte tenu de l’applicabilité prometteuse des AOP pour la recherche et l’utilisation clinique, le National Cancer Institute a lancé un consortium international, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, pour générer et fournir ces nouveaux modèles de cancer dérivés de tumeurs. Bon nombre des modèles organoïdes de divers types de cancer développés par l’intermédiaire de l’ICMH sont disponibles via l’American Type Culture Collection (ATCC)22.
Il a été démontré que les organoïdes mammaires normaux sont composés de différentes populations de cellules épithéliales présentes dans la glande mammaire 11,23 et servent donc d’excellents modèles pour étudier les processus biologiques de base, pour analyser les mutations conductrices causant la tumorigenèse et pour les études de lignée cancéreuse 6,15 . Des modèles organoïdes de tumeurs mammaires ont été utilisés pour identifier de nouvelles cibles qui ouvrent des perspectives encourageantes pour le développement de nouvelles thérapies, en particulier pour les tumeurs résistantes24,25,26. En utilisant des xénogreffes dérivées de patients (PDX) et des modèles organoïdes dérivés de PDX appariés (PDxO) de tumeurs mammaires résistantes au traitement, Guillen et al. ont montré que les organoïdes sont des modèles puissants pour la médecine de précision, qui peuvent être exploités pour évaluer les réponses aux médicaments et diriger les décisions thérapeutiques en parallèle28. De plus, le développement de nouvelles méthodes de co-culture pour la culture d’AOP avec diverses cellules immunitaires27,28,29, fibroblastes 30,31 et microbes 32,33 présente une opportunité d’étudier l’impact du microenvironnement tumoral sur la progression du cancer. Alors que de nombreuses méthodes de co-culture de ce type sont activement établies pour les AOP dérivées de tumeurs pancréatiques ou colorectales, des méthodes de co-culture similaires établies pour les AOP mammaires n’ont été signalées que pour les cellules tueuses naturelles34 et les fibroblastes35.
La première biobanque de >100 organoïdes dérivés de patients représentant différents sous-types de cancer du sein a été développée par le groupe Hans Clevers36,37. Dans le cadre de cet effort, le groupe Clevers a également développé le premier milieu de culture complexe pour la croissance organoïde mammaire, qui est actuellement largement utilisé36. Une étude de suivi a fourni un compte rendu complet de l’établissement et de la culture des AOP mammaires et des xénogreffes organoïdes dérivées de patientes (PDOX)38. Le laboratoire Welm a développé une vaste collection de modèles BC PDX et PDxO qui sont cultivés dans un milieu de croissance comparativement plus simple contenant du sérum bovin fœtal (FBS) et moins de facteurs de croissance39,40. Nous avons indépendamment développé et caractérisé un large éventail de modèles organoïdes de cancer du sein naïfs dérivés de patientes11, et participé à l’élaboration de modèles PDO BC dans le cadre de l’initiative HCMI21. Ici, nous visons à fournir un guide pratique détaillant la méthodologie que nous employons pour générer des systèmes modèles organoïdes mammaires dérivés de patientes.
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Protocol
Les résections tumorales de patientes atteintes d’un cancer du sein, ainsi que les tissus normaux distaux et adjacents, ont été obtenues auprès de Northwell Health conformément aux protocoles IRB-03-012 et IRB 20-0150 du comité d’examen institutionnel, et avec le consentement éclairé écrit des patientes.
REMARQUE : Toutes les interventions mentionnées ci-dessous ont été effectuées dans une salle de culture tissulaire de mammifères BSL2 désignée pour les échantillons de patients après approbation du comité de biosécurité. Toutes les procédures doivent être effectuées en suivant les protocoles de sécurité en maintenant des conditions aseptiques dans les enceintes de biosécurité. Chaque étape de centrifugation est effectuée à température ambiante (RT), sauf indication contraire. Les tissus/organoïdes et les stocks de matrice membranaire basale sont toujours placés sur de la glace, sauf indication contraire. Les nouvelles plaques sont incubées pendant la nuit pour le préchauffage. Les dômes de placage sur des plaques préchauffées garantissent les meilleurs résultats pour obtenir des dômes arrondis qui ne s’aplatissent pas lors du placage ou du décollage ultérieur de la surface de la plaque.
1. Préparation moyenne et recettes
- Préparer les milieux conditionnés par R-spondin1 comme décrit ci-dessous (peut également être acheté dans le commerce).
- Préparer deux milieux de culture distincts composés du milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, de 10 % de FBS, de 5 % de pénicilline-streptomycine et avec ou sans supplémentation en zéocine de 300 μg/mL.
- Décongeler un flacon de cellules HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (obtenues dans le laboratoire de Calvin Kuo à l’Université de Stanford et également disponibles dans le commerce) dans une fiole de culture tissulaire de 75cm2 contenant 15 ml de milieu.
- Diviser les cellules en 2 flacons de culture de 175 cm2 , chacun contenant 35 mL de milieu contenant de la zéocine.
- Repasser les cellules pour obtenir autant de flacons que nécessaire pour générer le lot souhaité de milieu conditionné à la R-spondine1. Utilisez un milieu de croissance sans zéocine.
- Lorsque les fioles contenant un milieu sans zéocine sont confluentes, retirer et remplacer le milieu de culture par Ad-DF+++ (étape 1.2 ; Tableau 1). Placez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 1 semaine.
- Faire tourner le milieu à 400 x g pendant 5 minutes pour enlever toutes les cellules non attachées. Filtrer le milieu à travers un filtre de 0,22 μm. Fabriquer des aliquotes de 25 mL et les conserver à -20 °C (peut être conservé jusqu’à 6 mois).
- À l’aide de cellules HEK293T, effectuer un double dosage de luciférase TOPFLASH41,42 en utilisant un réactif de transfection d’ADN commercial à un rapport réactif/ADN de 4,8:1 avec le diluant DMEM (glucose élevé, pyruvate). Ajouter 100 μL de milieu conditionné à la R-spondine1 (ou milieu basal pour le témoin négatif) à 100 μL de cellules transfectées. Ensuite, effectuez le double test de luciférase selon le protocole du fabricant pour vérifier l’activité Wnt du milieu conditionné à la R-spondine1.
REMARQUE: Le test utilise un plasmide TOP avec lecture de l’activité luciférase Firefly, et le plasmide FOP est utilisé comme témoin négatif.
- Préparer le milieu basal (milieu Ad-DF+++, tel que publié précédemment par Sachs et al.36).
Réactif Concentration des stocks Concentration finale DMEM/F12 avancé 1x 1x GlutaMax 100x 1x HEPES 2 . 10 mM Pénicilline-streptomycine 10 000 U/mL; 10 000 μg/mL 100 U/mL; 100 μg/mL
Tableau 1 : Composition basale du milieu Ad-DF+++. - Préparer un milieu complet pour les organoïdes mammaires dérivés de patientes, tel que publié précédemment par Sachs et al.36.
Réactif Concentration des stocks Concentration finale Ad-DF+++ moyen 1x 1x R-spondin en interne 100% 10% Supplément B-27 50x 1x Nicotinamide 2 . 5 mM CNA 500 mM 1,25 mM Primocin 50 mg/mL 50 μg/mL Noggin 100 μg/mL 100 ng/mL EGF humain 5 μg/mL 5 ng/mL Héréguline humaine β1/Neuréguline1 75 μg/mL 37,5 ng/mL Y-27632 Dichlorhydrate (Rho-kinase) 100 mM 5 μM A83-01 5 mM 500 nM FGF-7 humain 100 μg/mL 5 ng/mL FGF-10 humain 1 mg/mL 20 ng/mL p38i 30 mM 498 nM
Tableau 2 : Composition moyenne complète pour les organoïdes mammaires dérivés de patientes. - Préparer 2 mg/mL de solution de collagénase IV en pesant la quantité requise de collagénase IV en poudre et en la solubilisant dans un milieu basal Ad-DF+++. Filtrer à travers un filtre de 0,22 μm avant utilisation.
- Préparer une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,5 % à partir d’une solution mère à 7,5 % en utilisant 1x la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco comme diluant. Filtrer à travers un filtre de 0,22 μm avant utilisation.
2. Établissement d’une tumeur du sein/organoïdes normaux à partir de tissus réséqués (Figure 1)
- Transporter une tumeur mammaire réséquée chirurgicalement ou un échantillon de tissu normal au laboratoire dans un tube conique de 50 ml contenant Ad-DF+++. Rangez le tube sur de la glace jusqu’au début de l’isolement.
- Décongeler une bouteille de matrice membranaire basale sur de la glace ou pendant la nuit à 4 °C.
- Transférer le tissu réséqué dans une boîte de Petri stérile de 10 cm. Examinez le tissu macroscopiquement et notez s’il semble morphologiquement gras, vascularisé ou nécrotique. De plus, notez la taille et la forme du tissu. Idéalement, prenez une photo du tissu avec une règle en vue (Figure 2).
- Hacher le tissu en très petits morceaux (~1 mm3) avec un scalpel stérile no 10 et le transférer dans un tube conique de 50 mL.
- Ajouter 10 mL de solution de collagénase IV à 2 mg/mL et sceller le tube avec un film transparent. Placer le tube sur un agitateur orbital à 37 °C à 140 tr/min pendant 30-90 min en position inclinée (angle ~30°).
- Pendant l’incubation, placer une partie aliquote de milieu complet à préchauffer dans un bain-marie à 37 °C.
- Toutes les 15 minutes, remettre le tissu en suspension en mélangeant vigoureusement de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 5 mL. Pré-enduire la pipette d’une solution de BSA à 0,5 % pour éviter la perte de tissu causée par l’adhérence de l’échantillon à la pipette. Surveillez la dissociation au fil du temps en observant le tube conique au microscope à un grossissement de 5x ou plus.
- Une fois le tissu dissocié, centrifuger à 400 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant, ajouter 10 mL d’Ad-DF+++ et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
- Jetez soigneusement le surnageant. Les granulés de tissu peuvent parfois être lâches, alors soyez prudent lorsque vous aspirez. Répétez l’étape une fois de plus.
- Si la pastille tissulaire est partiellement rouge, ajouter 2 mL de tampon de lyse des globules rouges et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. N’incuber pas plus longtemps, car cela réduirait considérablement la viabilité cellulaire.
- Ajouter 10 mL d’Ad-DF+++ dans le tube, centrifuger à 400 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 50 à 300 μL de matrice membranaire basale froide non diluée et mélangez en pipetant soigneusement pour éviter de former des bulles.
REMARQUE : Le volume de la matrice membranaire basale ajoutée dépend de la taille des granulés. En cas de doute, placez un petit dôme de ~10 μL à partir de la pastille remise en suspension et observez la confluence au microscope. Ajustez en ajoutant plus de matrice membranaire basale si nécessaire. Reportez-vous à la figure 3 (image du jour 1) pour connaître la densité de semis de référence. - Plaque de 300 μL de dôme à matrice membranaire basale contenant des organoïdes dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire préchauffée et marquée à 6 puits. Se reporter au tableau 3 pour connaître la matrice de membrane basale recommandée et les volumes moyens si vous utilisez différentes plaques.
Nombre de puits par plaque Matrice de membrane basale par dôme (μL) Milieu par puits (μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (suspension au lieu de dôme) 100
Tableau 3 : Quantité de matrice membranaire basale et de milieu de croissance recommandée par puits en fonction de la taille de la plaque. - Laisser la plaque intacte dans la hotte pendant 5 minutes, puis placer soigneusement dans l’incubateur à 37 °C pendant 20-30 min pour que le dôme à matrice membranaire basale se solidifie complètement.
- Ajouter 3 mL de milieu complet préchauffé goutte à goutte dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et placer dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Prenez des images des organoïdes à l’aide d’un objectif 5x sur un microscope à fond clair inversé.
- Reconstituer le milieu tous les 4-8 jours en fonction de la croissance des organoïdes. Aspirez soigneusement l’ancien milieu sans déranger le dôme et ajoutez un milieu frais et préchauffé goutte à goutte.
REMARQUE: Le protocole est le même pour l’établissement d’organoïdes du cancer du sein dérivés de la tumeur réséquée et pour les organoïdes normaux dérivés de tissus mammaires sains réséqués (soit à partir de tissu mammaire adjacent et normal du même patient, soit à partir de tissu mammaire sain obtenu à partir d’une mammoplastie réductrice).
3. Passage et expansion des organoïdes mammaires dérivés de patientes en culture
- Décongeler une bouteille de matrice membranaire basale sur de la glace ou pendant la nuit à 4 °C.
- Soulevez le dôme de matrice membranaire du socle dans le milieu du puits à l’aide d’un racleur de cellule ou d’une pointe de pipette de 1 mL.
- Pré-enduire l’extrémité de la pipette avec une solution de BSA à 0,5%, puis transférer le dôme flottant des organoïdes avec un tube conique de 15 ml ou 50 ml, selon le nombre de puits récoltés. Pour plus de deux puits contenant 300 μL de dômes matriciels à membrane basale, utilisez un tube conique de 50 mL. Ajouter 1x DPBS pour augmenter le volume à au moins 5 mL.
- Faire tourner les tubes à 400 x g pendant 5 min. La matrice membranaire basale avec organoïdes forme une couche au fond. Aspirer soigneusement pour enlever le surnageant.
- Ajouter 5 à 20 ml de 1x DPBS, selon le nombre de puits regroupés dans un tube. Pré-enduire une pipette jetable stérile de 0,5% de BSA et mélanger uniformément la pastille de matrice membranaire basale organoïde dans DPBS en pipetant de haut en bas.
- Faire tourner les tubes à 400 x g pendant 5 min. Aspirer soigneusement et jeter le surnageant.
- Ajouter le réactif de dissociation cellulaire à trois fois le volume de la matrice membranaire basale au tube. À l’aide d’une pointe de pipette recouverte de BSA à 0,5 %, remettre en suspension les organoïdes dans le réactif de dissociation cellulaire.
- Placer le tube sur un agitateur orbital à 37 °C à 140 tr/min pendant 8 à 15 min en position inclinée. Surveillez le tube en l’observant au microscope toutes les 5 minutes pour vous assurer que les organoïdes sont décomposés en grappes plus petites.
- Ajouter un milieu basal (c.-à-d. Ad-DF+++) à un volume égal ou supérieur au réactif de dissociation cellulaire et une pipette pour mélanger les organoïdes. Faire tourner à 400 x g pendant 5 min à TA pour obtenir une pastille organoïde.
- Si la pastille contient des organoïdes encore incorporés dans la matrice membranaire basale non dissoute, répétez les étapes 3.7-3.9 pendant 5-8 minutes supplémentaires de trypsinisation.
- Une fois qu’une pastille organoïde blanche sans matrice membranaire basale non dissoute est obtenue, jeter le surnageant et ajouter 1 mL d’Ad-DF+++ pour remettre la pastille en suspension par pipetage. Ajoutez ensuite plus d’Ad-DF+++ jusqu’à 10 mL.
- Faire tourner à 400 x g pendant 5 min à TA pour l’étape de lavage. Aspirer et jeter le surnageant.
- Ajouter la quantité requise de matrice membranaire basale aux organoïdes digérés en fonction du rapport de division approprié (cela variera considérablement pour chaque lignée organoïde en fonction du taux de croissance). Reportez-vous à la figure 3 (image du jour 1) pour un exemple de densité de semis. Mélanger en pipitant doucement de haut en bas pour éviter de créer des bulles. Placer immédiatement sur la glace.
- Ouvrez et étiquetez une plaque préchauffée à 6 puits. Il est recommandé de plaquer un dôme de 10 à 20 μL dans le coin d’un puits pour observer la confluence au microscope. Si les organoïdes sont confluents, plus de matrice membranaire basale peut être ajoutée pour augmenter le rapport de division.
- Dômes de 300 μL d’organoïdes remis en suspension dans la matrice membranaire basale. Assurez-vous de garder le tube sur la glace tout en plaquant plusieurs puits afin que la matrice de membrane basale reste en solution.
- Laisser la plaque intacte dans la hotte pendant 5 min, puis placer délicatement dans un incubateur à 37 °C contenant 5% de CO2 sans déranger les dômes.
- Après 20-30 min, les dômes se solidifient. Ajouter 3 mL de milieu complet préchauffé à chaque puits et remettre la plaque dans l’incubateur. Ajouter le milieu complet frais tous les 5-7 jours. Effectuer des tests de routine des cultures pour détecter la contamination par les mycoplasmes.
REMARQUE: Le protocole pour la culture des tumeurs du sein et des organoïdes normaux est le même. Cependant, selon notre expérience, les organoïdes normaux ont tendance à bien croître jusqu’au passage 6-8 avant de ralentir. Il est conseillé de constituer autant de stocks de passage précoce que possible pour les recherches futures.
4. Congélation d’organoïdes mammaires dérivés de patientes
- Passage des puits confluents d’organoïdes pour éliminer toute matrice membranaire basale, comme indiqué aux étapes 3.1-3.12.
- Resuspendre la pastille d’organoïdes dans un milieu de congélation cellulaire (décongelée pendant une nuit à 4 ºC) avec 1 mL de milieu par 200-300 μL de volume de matrice membranaire basale avant passage. Effectuez un comptage de cellules avant de geler pour référence. Aliquote un petit volume (au moins 100 μL) de cellules pour subir une trypsinisation supplémentaire, si nécessaire, pour obtenir des cellules individuelles, puis les compter à l’aide d’une machine de compteur de cellules.
- Transférer 1 mL de cellules dans des cryoviales de 2 mL marquées avec le numéro de ligne organoïde, la date et le numéro de passage. Assurez-vous d’étiqueter les tubes avec un marqueur permanent ou d’utiliser des cryoétiquettes.
- Déplacer les flacons dans un récipient de congélation cellulaire et transférer le contenant dans un congélateur à -80 °C. Après l’incubation pendant la nuit, les flacons sont prêts à être déplacés vers un congélateur de stockage d’azote liquide pour un stockage à long terme.
5. Décongélation des organoïdes mammaires dérivés de patientes
- Décongeler une bouteille de matrice membranaire basale sur de la glace ou pendant la nuit à 4 °C. Préchauffer Ad-DF+++ à 37 °C. Aliquote 9 mL de milieu préchauffé dans des tubes coniques de 15 mL pour chaque flacon congelé.
- Décongeler rapidement le flacon congelé d’organoïdes en le plaçant dans un bain de perles à 37 °C. Pulvériser de l’éthanol à 70% et transférer le tube dans l’enceinte de biosécurité.
- Rincer l’embout de la pipette avec une solution de BSA à 0,5 % pour éviter la perte d’organoïdes. Mélanger doucement les organoïdes décongelés en pipetant de haut en bas pour mélanger les organoïdes déposés dans le tube.
- Transférer doucement 1 mL d’organoïdes congelés à 9 mL d’Ad-DF+++ préchauffé goutte à goutte. Faites tourner les cellules à 400 x g pendant 5 minutes, puis jetez soigneusement le surnageant.
- Lavez la pastille en ajoutant 10 ml d’Ad-DF+++ frais préchauffé à la pastille organoïde et mélangez doucement avec une pipette pré-enduite de BSA à 0,5 % pour remettre la pastille en suspension. Faites tourner les cellules à 400 x g pendant 5 min et jetez soigneusement le surnageant.
- Placez la pastille organoïde sur de la glace et retirez soigneusement tout Ad-DF+++ restant à l’aide d’une pointe de pipette de plus petit volume. Resuspendre la pastille dans 300 μL de matrice membranaire basale et plaque dans une plaque préchauffée à 6 puits. Placer la plaque dans un incubateur à 37 °C contenant 5% de CO2.
NOTE: Il est recommandé de plaquer un petit dôme de 10 μL de la pastille remise en suspension dans un coin du puits pour discerner la confluence au microscope. Si les organoïdes semblent confluents, diluer en ajoutant 300 μL de matrice membranaire basale à la plaque dans deux puits d’une plaque de 6 puits. - Après une incubation de 20 à 30 minutes, ajouter 3 mL de milieu complet préchauffé au dôme solidifié.
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Representative Results
Nous avons établi une biobanque d’organoïdes tumoraux mammaires dérivés de patientes comprenant divers sous-types11. De plus, nous avons établi plusieurs lignées organoïdes mammaires normales dérivées d’échantillons de tissus de mammoplastie réductrice ou de seins normaux adjacents/distaux de patientes de la Colombie-Britannique en utilisant l’approche décrite à la figure 1.
Les différentes lignées organoïdes de tumeurs mammaires dérivées de patients diffèrent par leur morphologie (Figure 2) et leur taux de croissance (Figure 3). Les organoïdes mammaires normaux et les quelques organoïdes dérivés du carcinome canalaire in situ précoce (CCIS) que nous avons établis, ressemblent à la structure mammaire normale avec une lumière centrale entourée de cellules canalaires (Figure 2A,B). Les organoïdes dérivés d’un carcinome lobulaire invasif (figure 2C) ont tendance à former des structures en forme de grappes de raisin faiblement attachées, comme indiqué précédemment par d’autres laboratoires36,43. Pendant ce temps, les organoïdes dérivés de carcinomes canalaires invasifs (cancer du sein à récepteurs hormonaux positifs et triple négatif) ont tendance à former des organoïdes denses, grands et ronds (Figure 2D,E). Les organoïdes ont été fixés avec 4% de paraformaldéhyde suivi d’être incorporés dans des moules à 2% d’agarose. Ils ont ensuite été incorporés de paraffine, et des sections de 10 μm ont été colorées avec de l’hématoxyline et de l’éosine (comme décrit dans Bhatia et al.11) pour observer la morphologie.
Pour démontrer les différences dans le taux de croissance de différentes lignées organoïdes de tumeurs mammaires dérivées de patientes, 1 000 cellules individuelles viables ont été plaquées dans une solution de suspension matricielle membranaire basale à 10 % par plaque de 96 puits, avec six réplications chacune pour déterminer la viabilité cellulaire à différents moments afin de surveiller la croissance sur une période de 12 jours (Figure 3B ). La formation d’organoïdes a été mesurée à l’aide d’un essai de viabilité cellulaire luminescente aux jours 3, 6, 9 et 12, avec une lecture de base le jour 1 après le placage. La figure 3A montre des images en champ clair des mêmes organoïdes développés dans des plaques à 6 puits au fil du temps. Certaines lignées organoïdes dérivées de patients ont un temps de doublement de 2 jours, tandis que d’autres prennent 5 jours (Figure 3B).
Figure 1 : Établissement d’organoïdes mammaires dérivés de patientes. (A) Représentation schématique des principales étapes de l’établissement de tumeurs mammaires dérivées de patientes ou d’organoïdes normaux. (B) Images représentatives montrant la croissance des organoïdes tumoraux mammaires dérivés de patients DS117T depuis l’établissement (passage 0) jusqu’à la culture à long terme (passage 12). Flèches bleues = matière fibreuse, flèches jaunes = débris/cellules mortes et flèches rouges = types de cellules de soutien du microenvironnement (principalement des fibroblastes). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Organoïdes mammaires dérivés de patientes représentant différents sous-types. Panneau supérieur: différences morphologiques entre les lignées organoïdes dérivées de tumeurs mammaires de patients (B-E) de différents sous-types histopathologiques et moléculaires. (A) La figure représente les organoïdes dérivés du tissu mammaire humain normal obtenu après une mammoplastie réductrice. Barre d’échelle = 50 μm. Panneau inférieur: images colorées H & E des mêmes lignes organoïdes. Barre d’échelle = 100 μm. Abréviation : CSTN = cancer du sein triple négatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Croissance en culture de différents organoïdes tumoraux du sein dérivés de patientes. Images représentatives en champ clair et courbes de viabilité cellulaire (A et B), mesurées par un test de viabilité cellulaire luminescente montrant la croissance en culture de différentes lignées organoïdes de tumeurs mammaires dérivées de patientes sur 12 jours. Barre d’échelle = 50 μm. Les barres d’erreur représentent SEM pour n = 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Notre laboratoire a utilisé avec succès les protocoles ci-dessus pour établir des organoïdes à partir de résections ou de raclages de tumeurs naïves. Nous avons également utilisé ce protocole pour développer des organoïdes normaux à partir de tissu mammaire obtenu par mammomoplasties réductrices ou à partir du tissu mammaire normal adjacent ou distal des patientes cancéreuses. Environ 30% à 40% des tumeurs primaires réséquées ont abouti à des cultures organoïdes tumorales réussies à long terme (passage >passage 8). Les lignées organoïdes tumorales qui se sont estompées après quelques passages avaient soit une excroissance des organoïdes normaux ou des cellules stromales, soit consistaient principalement en des cellules tumorales non prolifératives. Une évaluation plus poussée et une modification des composants du milieu qui favorisent actuellement la croissance des cellules épithéliales, ou d’autres moyens de présélection des populations de cellules tumorales, devraient améliorer le taux de réussite pour l’établissement et la culture à long terme des AOP. De plus, il est fortement recommandé de congeler plusieurs flacons d’organoïdes expansés avec succès et d’effectuer des tests de décongélation sur des flacons congelés pour chaque lignée d’organoïdes établie afin d’authentifier leur succès à long terme en culture.
Certaines lignées organoïdes réussies qui ralentissent parfois en culture ou qui ont du mal à se remettre d’un dégel bénéficient souvent de l’augmentation de la densité de semis. Une confluence plus élevée est observée pour aider à stimuler une croissance plus rapide pour la plupart des lignées, probablement à la suite d’interactions cellule-cellule ou de facteurs sécrétés. De plus, filtrer les organoïdes (après trypsinisation) à travers un filtre de 70 à 100 μm peut aider à éliminer les débris accumulés par les organoïdes morts qui apparaissent parfois après la décongélation de certaines lignées organoïdes et ont tendance à entraver leur croissance. Cependant, il convient de noter que certains matériaux organoïdes sains sont également perdus dans le processus de filtrage. Certaines lignées organoïdes exprimant le récepteur des œstrogènes (ER+) peuvent croître lentement par rapport au CSTN et pourraient potentiellement bénéficier de l’ajout d’œstradiol au milieu. Nous recommandons que les lignées organoïdes de tumeurs mammaires établies dérivées du patient soient caractérisées génomiquement et transcriptomiquement. Cela peut être fait en utilisant plusieurs techniques, telles que l’évaluation immunohistochimique des caractéristiques pathologiques et génétiques des tumeurs des patients (expression du récepteur des œstrogènes, récepteur de la progestérone, facteur de croissance épidermique humain 2, cadhérine, Ki-67, etc.), séquençage de l’ARN, séquençage de l’ARN unicellulaire, séquençage de l’ADN pour les gènes conducteurs du cancer, variations du nombre de copies, etc. Pour les études mécanistes et de réponse aux médicaments, il faut tenir compte des inhibiteurs spécifiques qui sont des composants du milieu et de tout traitement antérieur reçu par le patient avant la chirurgie.
Les lignées organoïdes tumorales dérivées de différents patients varient en termes de mutations génomiques, de transcriptomique, de morphologie, de taux de croissance, de capacité à former de grands organoïdes, de présence de populations cellulaires hétérogènes, etc. Ces différences posent des défis pour les établir et les cultiver, mais elles font également des organoïdes des modèles robustes représentant à la fois la diversité des patients et la complexité tumorale. Il a été démontré que les organoïdes dérivés de tumeurs mammaires récapitulent les tumeurs originales des patientes aux niveaux génomique, transcriptomique11,36 et métabolomique44. Tous ces facteurs en font des outils puissants pour le dépistage de médicaments et l’oncologie de précision39. Les organoïdes dérivés de patients sont un nouveau système modèle passionnant qui servira de modèles in vitro tridimensionnels pour étudier la biologie du cancer, ainsi que pour examiner des questions thérapeutiques importantes pour faire progresser le domaine de la médecine personnalisée. Les organoïdes mammaires normaux et tumoraux peuvent être génétiquement modifiés via l’ingénierie CRISPR15,38, ce qui incite à leur utilisation favorable pour les études génétiques mécanistes pour la tumorigenèse et la progression du cancer. Des organoïdes tumoraux mammaires dérivés de patients ont également été utilisés pour développer des modèles de xénogreffes 11,38,39 qui peuvent potentiellement imiter la croissance tumorale chez les patientes. En outre, les systèmes de co-culture organoïde de tumeurs mammaires dérivés de patients restent un domaine de recherche sous-exploré qui peut fournir des informations puissantes sur l’importance de la diaphonie entre les cellules cancéreuses du sein et d’autres cellules, telles que les fibroblastes associés au cancer du stroma, les cellules immunitaires, les adipocytes, etc. dans la progression tumorale.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Spector pour les discussions critiques tout au long de ce travail. Nous remercions Norman Sachs et Hans Clevers (Hubrecht Institute, Pays-Bas) de nous avoir initialement fourni leur protocole de culture organoïde. Nous remercions les ressources partagées en histologie et microscopie du CSHL Cancer Center pour leurs services et leur expertise technique (NCI 2P3OCA45508). Nous remercions le Dr Qing Gao pour son aide dans la préparation des échantillons histologiques. Nous sommes reconnaissants du soutien de la Dre Karen Kostroff (Northwell Health) pour avoir fourni des échantillons de tumeurs aux patients. Nous apprécions également les efforts de l’équipe de Northwell Health Biobanking pour l’acquisition d’échantillons, et nous remercions les patients et leurs familles d’avoir fait don de tissus pour la recherche. Cette recherche a été financée par CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) et Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson et D.L.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
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