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Cancer Research

रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स की स्थापना और संस्कृति

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64889
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2Genetics Graduate Program, Stony Brook University

Summary

रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर शोधन या सामान्य स्तन ऊतक से मानव स्तन ऑर्गेनोइड ्स स्थापित करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। प्रोटोकॉल मानव रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स की खेती, ठंड और पिघलने के लिए व्यापक चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है।

Abstract

स्तन कैंसर एक जटिल बीमारी है जिसे कई अलग-अलग हिस्टोलॉजिकल और आणविक उपप्रकारों में वर्गीकृत किया गया है। हमारी प्रयोगशाला में विकसित रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स में कई ट्यूमर-व्युत्पन्न सेल आबादी का मिश्रण होता है, और इस प्रकार स्थापित 2 डी कैंसर सेल लाइनों की तुलना में ट्यूमर सेल विविधता और परिवेश का बेहतर अनुमान होता है। ऑर्गेनोइड्स एक आदर्श इन विट्रो मॉडल के रूप में काम करते हैं, जो सेल-बाह्य मैट्रिक्स इंटरैक्शन की अनुमति देते हैं, जो सेल-सेल इंटरैक्शन और कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स में माउस मॉडल पर भी फायदे हैं क्योंकि वे मानव मूल के हैं। इसके अलावा, उन्हें रोगी ट्यूमर के जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक के साथ-साथ चयापचय विषमता को पुन: परिभाषित करने के लिए दिखाया गया है; इस प्रकार, वे ट्यूमर जटिलता के साथ-साथ रोगी विविधता का प्रतिनिधित्व करने में सक्षम हैं। नतीजतन, वे लक्ष्य खोज और सत्यापन और दवा संवेदनशीलता परख में अधिक सटीक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए तैयार हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम एक विस्तृत प्रदर्शन प्रदान करते हैं कि कैसे रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स को स्तन ट्यूमर (कैंसर ऑर्गेनोइड्स) या रिडक्टिव मैमोप्लास्टी-व्युत्पन्न स्तन ऊतक (सामान्य ऑर्गेनोइड्स) से स्थापित किया जाता है। इसके बाद 3 डी ऑर्गेनॉइड कल्चर, विस्तार, पासिंग, फ्रीजिंग, साथ ही रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के पिघलने का व्यापक विवरण है।

Introduction

स्तन कैंसर (बीसी) महिलाओं में सबसे अधिक होने वाली घातकता है, 2022 में संयुक्त राज्य अमेरिका में 287,850 नए मामलों का निदान होने का अनुमानहै। वार्षिक स्क्रीनिंग, लक्षित उपचारों और आनुवंशिक प्रवृत्ति की बेहतर समझ के साथ शुरुआती पहचान में हालिया प्रगति के बावजूद, यह संयुक्त राज्य अमेरिका में महिलाओं में कैंसर से होने वाली मौतों का दूसरा प्रमुख कारण है, जिसमेंसालाना स्तन कैंसर के लिए >40,000 मौतें होती हैं। स्तन कैंसर को वर्तमान में प्राथमिक ट्यूमर के हिस्टोपैथोलॉजिकल और आणविक मूल्यांकन के आधार पर कई उपप्रकारों में वर्गीकृत किया गया है। बेहतर उपप्रकार स्तरीकरण ने उपप्रकार-विशिष्ट उपचार विकल्पों के साथ रोगी के परिणामों में सुधार कियाहै। उदाहरण के लिए, प्रोटो-ऑन्कोजीन3 के रूप में एचईआर 2 की पहचान ने ट्रास्टुज़ुमाब के विकास को जन्म दिया है, जिसने इस अत्यधिक आक्रामक उपप्रकार कोअधिकांश रोगियों में प्रबंधनीय बना दिया है। रोगी-विशिष्ट तरीके से इस जटिल बीमारी के आनुवंशिकी और ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स में आगे के शोध से बेहतर रोगी-विशिष्ट व्यक्तिगत उपचार आहार 2,5 को विकसित करने और भविष्यवाणी करने में सहायता मिलेगी। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) आणविक स्तर पर कैंसर में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक आशाजनक नया मॉडल है, नए लक्ष्यों या बायोमाकर्स की पहचान करना और नई उपचार रणनीतियों को डिजाइन करना 6,7,8।

पीडीओ बहुकोशिकीय, त्रि-आयामी (3 डी) संरचनाएं हैं जो ताजा निकाले गए प्राथमिक ऊतकनमूने 8,9 से प्राप्त होती हैं। वे एक हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में एम्बेडेड होने के द्वारा त्रि-आयामी रूप से उगाए जाते हैं, आमतौर पर बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के संयोजन से बना होता है, और इसलिए ट्यूमर सेल-ईसीएम इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पीडीओ रोगी विविधता का प्रतिनिधित्व करते हैं और ट्यूमर 10,11,12 की सेलुलर विषमता और आनुवंशिक विशेषताओं को पुन: परिभाषित करते हैं। इन विट्रो मॉडल होने के नाते, वे आनुवंशिक हेरफेर और उच्च-थ्रूपुट ड्रग स्क्रीन 13,14,15 की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, क्लिनिक के समानांतर रोगी दवा संवेदनशीलता और उपचार रणनीतियों का मूल्यांकन करने औररोगी के परिणामों की भविष्यवाणी करने में मदद करने के लिए पीडीओ का उपयोग किया जा सकता है। कीमोथेरेपी के अलावा, कुछ ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग केमोरेडिएशन19,20 के लिए व्यक्तिगत रोगी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए भी किया गया है। अनुसंधान और नैदानिक उपयोग के लिए पीडीओ की आशाजनक प्रयोज्यता को देखते हुए, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान ने इन ट्यूमर-व्युत्पन्न उपन्यास कैंसर मॉडल को उत्पन्न करने और प्रदान करने के लिए एक अंतरराष्ट्रीय संघ, द ह्यूमन कैंसर मॉडल इनिशिएटिव (एचसीएमआई) 21 की शुरुआत की है। एचसीएमआई के माध्यम से विकसित विभिन्न कैंसर प्रकारों के कई ऑर्गेनॉइड मॉडल अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी) 22 के माध्यम से उपलब्ध हैं।

सामान्य स्तन ऑर्गेनोइड्स को स्तन ग्रंथि11,23 में मौजूद विभिन्न उपकला कोशिका आबादी से युक्त दिखाया गया है और इस प्रकार बुनियादी जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने, ट्यूमरजेनिसिस के कारण चालक उत्परिवर्तन का विश्लेषण करने और कैंसर सेल-ऑफ-ओरिजिन वंशअध्ययनों के लिए महान मॉडल के रूप में काम करते हैं। . स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग नए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया गया है जो नए उपचारों को विकसित करने के लिए उत्साहजनक संभावनाएं हैं, विशेष रूप से प्रतिरोधी ट्यूमर 24,25,26 के लिए। उपचार-प्रतिरोधी स्तन ट्यूमर के रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) और मिलान पीडीएक्स-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड (पीडीएक्सओ) मॉडल का उपयोग करते हुए, गुइलेन एट अल ने दिखाया कि ऑर्गेनोइड सटीक चिकित्सा के लिए शक्तिशाली मॉडल हैं, जिनका उपयोग दवा प्रतिक्रियाओं और प्रत्यक्ष चिकित्सा निर्णयों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकताहै। इसके अलावा, विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं27,28,29, फाइब्रोब्लास्ट30,31 और रोगाणुओं 32,33 के साथ पीडीओ की खेती के लिए नए सह-संस्कृतिविधियों का विकास कैंसर की प्रगति पर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के प्रभाव का अध्ययन करने का अवसर प्रस्तुत करता है। जबकि अग्नाशय या कोलोरेक्टल ट्यूमर से प्राप्त पीडीओ के लिए कई ऐसे सह-संस्कृति तरीके सक्रिय रूप से स्थापित किए जा रहे हैं, स्तन पीडीओ के लिए इसी तरह के स्थापित सह-संस्कृति विधियों को केवल प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं34 और फाइब्रोब्लास्ट35 के लिए रिपोर्ट किया गया है।

विभिन्न स्तन कैंसर उपप्रकारों का प्रतिनिधित्व करने वाले >100 रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का पहला बायोबैंक हंस क्लेवर्स समूह36,37 द्वारा विकसित किया गया था। इस प्रयास के हिस्से के रूप में, क्लेवर्स समूह ने स्तन ऑर्गेनॉइड विकास के लिए पहला जटिल संस्कृति माध्यम भी विकसित किया, जो वर्तमान में व्यापक रूप से उपयोग कियाजाता है। एक अनुवर्ती अध्ययन ने स्तन पीडीओ और रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड जेनोग्राफ्ट्स (पीडीओएक्स) 38 की स्थापना और संस्कृति का एक व्यापक विवरण प्रदान किया। वेल्म लैब ने बीसी पीडीएक्स मॉडल और पीडीएक्सओ का एक बड़ा संग्रह विकसित किया है जो भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और कम विकासकारकों 39,40 वाले तुलनात्मक रूप से सरल विकास माध्यम में सुसंस्कृत हैं। हमने स्वतंत्र रूप से भोले रोगी-व्युत्पन्न स्तन कैंसर ऑर्गेनॉइड मॉडल11 की एक बड़ी सरणी विकसित और विशेषता की है, और एचसीएमआई पहल21 के हिस्से के रूप में बीसी पीडीओ मॉडल विकसित करने में भाग लिया है। यहां, हम रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनॉइड मॉडल सिस्टम उत्पन्न करने में हमारे द्वारा नियोजित पद्धति का विवरण देते हुए एक व्यावहारिक मार्गदर्शिका प्रदान करना चाहते हैं।

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Protocol

संस्थागत समीक्षा बोर्ड प्रोटोकॉल आईआरबी-03-012 और आईआरबी 20-0150 के अनुसार और रोगियों से लिखित सूचित सहमति के साथ, डिस्टल और आसन्न सामान्य ऊतक के साथ स्तन कैंसर के रोगियों से ट्यूमर रिसेक्शन नॉर्थवेल हेल्थ से प्राप्त किए गए थे।

नोट: नीचे उल्लिखित सभी प्रक्रियाओं को जैव सुरक्षा समिति के अनुमोदन पर रोगी के नमूनों के लिए नामित स्तनधारी ऊतक संस्कृति बीएसएल 2 कमरे में किया गया था। जैव सुरक्षा कैबिनेट में सड़न रोकनेवाला स्थितियों को बनाए रखने वाले सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया जाना चाहिए। प्रत्येक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण कमरे के तापमान (आरटी) पर किया जाता है जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है। ऊतक / ऑर्गेनोइड्स और बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स स्टॉक हमेशा बर्फ पर रखे जाते हैं जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है। प्री-वार्मिंग के लिए नई प्लेटों को रात भर इनक्यूबेट किया जाता है। पूर्व-गर्म प्लेटों पर गुंबद चढ़ाना गोल गुंबदों को प्राप्त करने के लिए सर्वोत्तम परिणाम सुनिश्चित करता है जो प्लेट की सतह से बाद में चढ़ाना या उठाने के दौरान चपटा नहीं होते हैं।

1. मध्यम तैयारी और व्यंजनों

  1. नीचे वर्णित आर-स्पोंडिन 1 वातानुकूलित मीडिया तैयार करें (वैकल्पिक रूप से व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है)।
    1. डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम), 10% एफबीएस, 5% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 300 μg / mL ज़ियोसिन पूरकता के साथ या उसके बिना दो अलग-अलग बढ़ते मीडिया तैयार करें।
    2. 15 एमएल माध्यम के साथ 75 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में एचईके293 टी-एचए-आरएसपोंडिन 1-एफसी कोशिकाओं (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में केल्विन कुओ की प्रयोगशाला से प्राप्त और व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध) की एक शीशी को पिघलाएं।
    3. कोशिकाओं को 2 x 175 सेमी2 कल्चर फ्लास्क में विभाजित करें, प्रत्येक में 35 एमएल माध्यम होता है जिसमें जिओसिन होता है।
    4. आर-स्पोंडिन 1 वातानुकूलित माध्यम के वांछित बैच को उत्पन्न करने के लिए जितनी आवश्यक हो उतने फ्लास्क प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को फिर से पारित करें। जिओसिन के बिना विकास माध्यम का उपयोग करें।
    5. जब जिओसिन के बिना माध्यम युक्त फ्लास्क संकुचित होते हैं, तो बढ़ते माध्यम को Ad-DF+++ (चरण 1.2) के साथ हटा दें और प्रतिस्थापित करें। तालिका 1)। कोशिकाओं को 1 सप्ताह के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    6. किसी भी असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 400 x g पर माध्यम को घुमाएं। माध्यम को 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। 25 एमएल एलिकोट बनाएं और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (6 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है)।
    7. एचईके 293 टी कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, डिल्युएंट डीएमईएम (उच्च ग्लूकोज, पाइरूवेट) के साथ डीएनए अनुपात में 4.8: 1 अभिकर्मक पर वाणिज्यिक डीएनए अभिकर्मक का उपयोग करके एक दोहरी लूसिफेरस टॉपफ्लैश 41,42 परख का प्रदर्शन करें। 100 μL ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं में R-spondin1 वातानुकूलित माध्यम (या नकारात्मक नियंत्रण के लिए बेसल माध्यम) के 100 μL जोड़ें। फिर, आर-स्पोंडिन 1 वातानुकूलित माध्यम की डब्ल्यूएनटी गतिविधि को सत्यापित करने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार दोहरी लूसिफेरस परख करें।
      नोट: परख जुगनू लूसिफेरस गतिविधि रीड-आउट के साथ एक टीओपी प्लास्मिड का उपयोग करता है, और एफओपी प्लास्मिड का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
  2. बेसल माध्यम (Ad-DF+++ माध्यम, जैसा कि पहले सैक्स एट अल.36 द्वारा प्रकाशित किया गया था) तैयार करें।
    अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता
    उन्नत DMEM/F12 1x 1x
    GlutaMax 100x 1x
    HEPES 1 M 10 mM
    पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 10,000 यू / एमएल; 10,000 μg/mL 100 यू / एमएल; 100 μg/mL

    तालिका 1: बेसल एड-डीएफ +++ मध्यम संरचना।
  3. रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स के लिए पूर्ण माध्यम तैयार करें जैसा कि पहले सैक्स एट अल.36 द्वारा प्रकाशित किया गया था।
    अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता
    Ad-DF+++ माध्यम 1x 1x
    आर-स्पोंडिन इन-हाउस 100% 10%
    बी -27 पूरक 50x 1x
    निकोटिनामाइड 1 M 5 mM
    एनएसी 500 mM 1.25 mM
    Primocin 50 मिलीग्राम / 50 μg/mL
    नोगिन 100 μg/mL 100 ng/
    मानव EGF 5 μg/mL 5 ng/mL
    Human Heregulin β1/Neuregulin1 75 μg/mL 37.5 ng/
    वाई -27632 डायहाइड्रोक्लोराइड (Rho-Kinase) 100 mM 5 μM
    A83-01 5 mM 500 nM
    मानव FGF-7 100 μg/mL 5 ng/mL
    मानव FGF-10 1 mg/mL 20 ng/
    p38i 30 mM 498 nM

    तालिका 2: रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स के लिए पूर्ण मध्यम संरचना।
  4. कोलेजनेज IV पाउडर की आवश्यक मात्रा का वजन करके और इसे Ad-DF+++ बेसल माध्यम में घुलनशील करके 2 mg/ mL कोलेजनेज IV समाधान तैयार करें। उपयोग करने से पहले 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  5. 1x Dulbecco के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (DPBS) का उपयोग करके 7.5% स्टॉक समाधान से 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) समाधान तैयार करें। उपयोग करने से पहले 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।

2. कटे हुए ऊतक से स्तन ट्यूमर / सामान्य ऑर्गेनोइड्स की स्थापना (चित्रा 1)

  1. सामान्य ऊतक नमूने को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में प्रयोगशाला में ले जाएं जिसमें एडी-डीएफ +++ होता है। अलगाव की शुरुआत तक ट्यूब को बर्फ पर स्टोर करें।
  2. बर्फ पर या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की एक बोतल पिघलाएं।
  3. कटे हुए ऊतक को 10 सेमी बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। ऊतक मैक्रोस्कोपिक रूप से जांचें और एक नोट बनाएं यदि यह रूपात्मक रूप से फैटी, संवहनी या नेक्रोटिक दिखाई देता है। इसके अतिरिक्त, ऊतक के आकार और आकार को रिकॉर्ड करें। आदर्श रूप से, एक शासक के साथ ऊतक की एक तस्वीर लें (चित्रा 2)।
  4. ऊतक को बाँझ संख्या 10 स्केलपेल के साथ बहुत छोटे टुकड़ों (~ 1 मिमी3) में कीमा करें, और इसे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज IV समाधान के 10 एमएल जोड़ें और ट्यूब को एक पारदर्शी फिल्म के साथ सील करें। ट्यूब को एक कक्षीय शेकर पर 30-90 मिनट के लिए 140 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कोण स्थिति (~ 30 ° कोण) में रखें।
  6. इनक्यूबेशन के दौरान, 37 डिग्री सेल्सियस मोती / पानी के स्नान में पूर्ण मध्यम से पूर्व-गर्म का एक एलिकोट रखें।
  7. हर 15 मिनट में, 5 एमएल बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके ऊतक को जोर से ऊपर और नीचे मिलाकर पुन: निलंबित करें। पिपेट से चिपके हुए नमूने के कारण ऊतक हानि को रोकने के लिए पिपेट को 0.5% बीएसए समाधान के साथ प्री-कोट करें। माइक्रोस्कोप के नीचे शंक्वाकार ट्यूब को 5x या उच्च आवर्धन पर देखकर समय के साथ पृथक्करण की निगरानी करें।
  8. एक बार ऊतक अलग हो जाने के बाद, सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 400 x g पर। सुपरनैटेंट को एस्पायरेट करें, 5 मिनट के लिए 10 एमएल एडी-डीएफ +++ जोड़ें, और 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
  9. सुपरनैटेंट को सावधानी से छोड़ दें। ऊतक छर्रों कभी-कभी ढीले हो सकते हैं, इसलिए एस्पिरेटेड करते समय सावधान रहें। चरण को एक बार फिर दोहराएं।
  10. यदि ऊतक गोली आंशिक रूप से लाल है, तो 2 एमएल लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। लंबे समय तक इनक्यूबेट न करें, क्योंकि इससे सेल व्यवहार्यता में काफी कमी आएगी।
  11. ट्यूब में 10 एमएल ऐड-डीएफ +++ जोड़ें, 5 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। छर्रों को 50-300 μL के बिना पतला, ठंडे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में पुन: निलंबित करें और बुलबुले बनाने से बचने के लिए सावधानीपूर्वक पाइप करके मिलाएं।
    नोट: जोड़े गए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की मात्रा गोली के आकार पर निर्भर करती है। यदि अनिश्चित है, तो पुन: निलंबित गोली से ~ 10 μL का एक छोटा गुंबद प्लेट करें और माइक्रोस्कोप के नीचे कंफ्लुएंसी का निरीक्षण करें। यदि आवश्यक हो तो अधिक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़कर समायोजित करें। संदर्भ सीडिंग घनत्व के लिए चित्र 3 (दिन 1 छवि) देखें।
  12. प्लेट 300 μL बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स गुंबद जिसमें पूर्व-गर्म, लेबल, 6-वेल टिशू कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में ऑर्गेनोइड होते हैं। विभिन्न प्लेटों का उपयोग करते समय अनुशंसित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और मध्यम वॉल्यूम के लिए तालिका 3 देखें।
    प्रति प्लेट कुओं की संख्या बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स प्रति गुंबद (μL) मध्यम प्रति कुआं (μL)
    6 300 3000
    12 100 1000
    24 50 500
    48 25 250
    96 10 (गुंबद के बजाय निलंबन) 100

    तालिका 3: प्लेट आकार के आधार पर प्रति अच्छी तरह से अनुशंसित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और विकास माध्यम की मात्रा।
  13. प्लेट को 5 मिनट के लिए हुड में अबाधित छोड़ दें और फिर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबद को पूरी तरह से जमने के लिए 20-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में सावधानीपूर्वक रखें।
  14. 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 3 एमएल प्री-वार्मेड पूर्ण मध्यम ड्रॉपवाइज जोड़ें और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें। उल्टे ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप पर 5x उद्देश्य का उपयोग करके ऑर्गेनोइड्स की छवियां लें।
  15. ऑर्गेनोइड्स के विकास के आधार पर हर 4-8 दिनों में माध्यम को फिर से भरें। गुंबद को परेशान किए बिना पुराने माध्यम को सावधानीपूर्वक तैयार करें, और ताजा, पूर्व-गर्म मध्यम ड्रॉपवाइज जोड़ें।
    नोट: प्रोटोकॉल कटे हुए ट्यूमर से प्राप्त स्तन कैंसर ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के लिए समान है और स्वस्थ स्तन ऊतक से प्राप्त सामान्य ऑर्गेनोइड्स के लिए (या तो एक ही रोगी के आसन्न और सामान्य स्तन ऊतक से या रिडक्टिव मैमोप्लास्टी सर्जरी से प्राप्त स्वस्थ स्तन ऊतक)।

3. संस्कृति में रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स को पास करना और विस्तार करना

  1. बर्फ पर या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की एक बोतल पिघलाएं।
  2. बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स गुंबद को सेल स्क्रैपर या 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके कुएं में माध्यम में उठाएं।
  3. पिपेट टिप को 0.5% बीएसए समाधान के साथ प्री-कोट करें और फिर काटे जा रहे कुओं की संख्या के आधार पर ऑर्गेनोइड्स के फ्लोटिंग गुंबद को मध्यम से 15 एमएल या 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबदों के 300 μL वाले दो से अधिक कुओं के लिए, 50 mL शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें। वॉल्यूम को कम से कम 5 एमएल तक बढ़ाने के लिए 1x DPBS जोड़ें।
  4. ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 400 x g पर घुमाएं। ऑर्गेनोइड्स के साथ बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स नीचे एक परत बनाता है। सतह पर तैरने वाले को हटाने के लिए सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
  5. एक ट्यूब में पूल किए गए कुओं की संख्या के आधार पर 1x DPBS के 5-20 एमएल जोड़ें। 0.5% बीएसए के साथ एक बाँझ डिस्पोजेबल पिपेट को प्री-कोट करें और डीपीबीएस में ऑर्गेनॉइड-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स गोली को समान रूप से ऊपर और नीचे करके मिलाएं।
  6. ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 400 x g पर घुमाएं। सावधानी से तैरने वाले को चूसें और त्याग दें।
  7. ट्यूब में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की मात्रा से तीन गुना अधिक मात्रा में सेल पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें। 0.5% बीएसए-लेपित पिपेट टिप का उपयोग करके, सेल पृथक्करण अभिकर्मक में ऑर्गेनोइड्स को फिर से निलंबित करें।
  8. ट्यूब को एक कक्षीय शेकर पर 140 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 8-15 मिनट के लिए कोण स्थिति में रखें। हर 5 मिनट में माइक्रोस्कोप के नीचे देखकर ट्यूब की निगरानी करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ऑर्गेनोइड छोटे समूहों में टूट गए हैं।
  9. सेल पृथक्करण अभिकर्मक के बराबर या उससे अधिक आयतन पर बेसल माध्यम (यानी, एडी-डीएफ ++++ जोड़ें, और ऑर्गेनोइड्स को मिलाने के लिए पिपेट करें। ऑर्गेनॉइड गोली प्राप्त करने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए 400 x g पर स्पिन करें।
  10. यदि गोली में अभी भी अविघटित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड ऑर्गेनोइड होते हैं, तो ट्रिप्सिनाइजेशन के अतिरिक्त 5-8 मिनट के लिए चरण 3.7-3.9 दोहराएं।
  11. एक बार जब बिना किसी अघुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ एक सफेद ऑर्गेनॉइड गोली प्राप्त हो जाती है, तो सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और पिपेटिंग द्वारा गोली को फिर से निलंबित करने के लिए 1 एमएल एडी-डीएफ +++ जोड़ें। फिर 10 एमएल तक अधिक विज्ञापन-डीएफ +++ जोड़ें।
  12. वॉश स्टेप के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए 400 x g पर स्पिन करें। एस्पिरेटेड करें और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
  13. उपयुक्त विभाजन अनुपात के आधार पर पचने वाले ऑर्गेनोइड्स में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की आवश्यक मात्रा जोड़ें (यह विकास दर के आधार पर प्रत्येक ऑर्गेनोइड लाइन के लिए व्यापक रूप से भिन्न होगा)। सीडिंग घनत्व के एक उदाहरण के लिए चित्रा 3 (दिन 1 छवि) देखें। बुलबुले बनाने से बचने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। तुरंत बर्फ पर रखें।
  14. एक पूर्व-गर्म 6-वेल प्लेट खोलें और लेबल करें। माइक्रोस्कोप के नीचे कंफ्लुएंसी का निरीक्षण करने के लिए एक कुएं के कोने में 10-20 μL गुंबद को प्लेट करने की सिफारिश की जाती है। यदि ऑर्गेनोइड्स कंफ्लुएंट हैं, तो विभाजित अनुपात को बढ़ाने के लिए अधिक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ा जा सकता है।
  15. ऑर्गेनोइड्स के प्लेट 300 μL गुंबद बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में फिर से निलंबित हो जाते हैं। कई कुओं को चढ़ाते समय ट्यूब को बर्फ पर रखना सुनिश्चित करें ताकि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान में रहे।
  16. प्लेट को 5 मिनट के लिए हुड में अबाधित छोड़ दें और फिर गुंबदों को परेशान किए बिना 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सावधानीपूर्वक रखें।
  17. 20-30 मिनट के बाद, गुंबद जम जाते हैं। प्रत्येक कुएं में 3 एमएल पूर्व-गर्म पूर्ण माध्यम जोड़ें और प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें। हर 5-7 दिनों में ताजा पूर्ण माध्यम जोड़ें। माइकोप्लाज्मा संदूषण का पता लगाने के लिए संस्कृतियों का नियमित परीक्षण करें।
    नोट: स्तन ट्यूमर और सामान्य ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल समान है। हालांकि, हमारे अनुभव में, सामान्य ऑर्गेनोइड धीमा होने से पहले 6-8 तक अच्छी तरह से बढ़ते हैं। भविष्य के शोध के लिए जितना संभव हो उतने शुरुआती पैसेज स्टॉक बनाने की सलाह दी जाती है।

4. रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स को फ्रीज करना

  1. चरण 3.1-3.12 में बताए गए अनुसार, किसी भी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को हटाने के लिए ऑर्गेनोइड्स के कुओं को पारित करें।
  2. सेल फ्रीजिंग माध्यम में ऑर्गेनोइड्स की गोली को पुन: चार्ज करें (रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघला हुआ) प्रति 200-300 μL बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मात्रा के 1 एमएल माध्यम के साथ पासिंग से पहले। संदर्भ के लिए ठंड से पहले एक सेल गिनती करें। एलिकोट कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा (कम से कम 100 μL) को आगे ट्रिप्सिनाइजेशन से गुजरने के लिए, यदि आवश्यक हो, तो एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, और फिर सेल काउंटर मशीन का उपयोग करके उनकी गणना करें।
  3. ऑर्गेनॉइड लाइन नंबर, तिथि और मार्ग संख्या के साथ लेबल किए गए 2 एमएल क्रायोवियल्स में 1 एमएल कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। ट्यूबों को एक स्थायी मार्कर के साथ लेबल करना सुनिश्चित करें या क्रायोलेबल का उपयोग करें।
  4. शीशियों को सेल फ्रीजिंग कंटेनर में ले जाएं और कंटेनर को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें। रात भर इनक्यूबेशन के बाद, शीशियों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन भंडारण फ्रीजर में ले जाने के लिए तैयार किया जाता है।

5. रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स को पिघलाना

  1. बर्फ पर या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की एक बोतल पिघलाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म विज्ञापन-डीएफ +++ मध्यम। प्रत्येक जमे हुए शीशी के लिए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में पूर्व-गर्म माध्यम के 9 एमएल को एलिकोट करें।
  2. ऑर्गेनोइड्स की जमी हुई शीशी को 37 डिग्री सेल्सियस मोती स्नान में रखकर तेजी से पिघलाएं। 70% इथेनॉल स्प्रे करें और ट्यूब को जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें।
  3. ऑर्गेनोइड हानि से बचने के लिए पिपेट टिप को 0.5% बीएसए समाधान के साथ कुल्ला करें। ट्यूब में किसी भी स्थिर ऑर्गेनोइड को मिलाने के लिए ऊपर और नीचे पाइप करके पिघले हुए ऑर्गेनोइड्स को धीरे-धीरे मिलाएं।
  4. धीरे-धीरे 1 एमएल जमे हुए ऑर्गेनोइड्स को 9 एमएल प्री-वार्मेड ऐड-डीएफ +++ में ड्रॉपवाइज तरीके से स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 400 x g पर घुमाएं और फिर सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक छोड़ दें।
  5. ऑर्गेनॉइड पेलेट में 10 एमएल ताजा प्री-वार्मेड एडी-डीएफ +++ जोड़कर गोली को धोएं, और गोली को फिर से निलंबित करने के लिए 0.5% बीएसए के साथ पूर्व-लेपित पिपेट के साथ धीरे से मिलाएं। कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 400 x g पर घुमाएं और सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक छोड़ दें।
  6. ऑर्गेनॉइड गोली को बर्फ पर रखें और एक छोटी मात्रा पिपेट टिप का उपयोग करके किसी भी अवशेष एडी-डीएफ +++ को सावधानीपूर्वक हटा दें। पहले से गर्म 6-वेल प्लेट में 300 μL बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स और प्लेट में गोली को फिर से निलंबित करें। प्लेट को 5% CO2 के साथ 37 °C इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: माइक्रोस्कोप के नीचे कंफ्लुएंसी को समझने के लिए कुएं के एक कोने में पुन: निलंबित गोली से एक छोटा 10 μL गुंबद चढ़ाने की सिफारिश की जाती है। यदि ऑर्गेनोइड्स कंफ्लुएंट दिखते हैं, तो 6-वेल प्लेट के दो कुओं में प्लेट करने के लिए 300 μL बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स जोड़कर पतला करें।
  7. 20-30 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, ठोस गुंबद में 3 एमएल पूर्व-गर्म पूर्ण माध्यम जोड़ें।

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Representative Results

हमने रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स का एक बायोबैंक स्थापित किया है जिसमें विभिन्न उपप्रकारशामिल हैं। इसके अतिरिक्त, हमने चित्र 1 में उल्लिखित दृष्टिकोण का उपयोग करके बीसी रोगियों से रिडक्टिव मैमोप्लास्टी ऊतक नमूने या आसन्न / डिस्टल सामान्य स्तन से प्राप्त कई सामान्य स्तन ऑर्गेनॉइड लाइनों की स्थापना की है।

विभिन्न रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड लाइनें उनकी आकृति विज्ञान (चित्रा 2) और विकास दर (चित्रा 3) में भिन्न होती हैं। सामान्य स्तन ऑर्गेनोइड्स, और कुछ शुरुआती डक्टल कार्सिनोमा इन सीटू (डीसीआईएस) -व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स जो हमने स्थापित किए हैं, डक्टल कोशिकाओं से घिरे केंद्रीय लुमेन के साथ सामान्य स्तन संरचना से मिलते जुलते हैं (चित्रा 2 ए, बी)। एक आक्रामक लोब्यूलर कार्सिनोमा (चित्रा 2 सी) से प्राप्त ऑर्गेनोइड्स शिथिल रूप से संलग्न अंगूर गुच्छा जैसी संरचनाओं का निर्माण करते हैं, जैसा कि पहले अन्य प्रयोगशालाओं36,43 द्वारा रिपोर्ट किया गया था। इस बीच, इनवेसिव डक्टल कार्सिनोमा (हार्मोन रिसेप्टर-पॉजिटिव और ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर) से प्राप्त ऑर्गेनोइड घने, बड़े और गोल ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 2 डी, ई) बनाते हैं। ऑर्गेनोइड्स को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था, जिसके बाद 2% अगारोस मोल्ड्स में एम्बेडेड किया गया था। तब उन्हें पैराफिन एम्बेडेड किया गया था, और आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (जैसा कि भाटिया एट अल .11 में वर्णित है) के साथ 10 μm वर्गों को दाग दिया गया था।

विभिन्न रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड लाइनों के विकास की दर में अंतर को प्रदर्शित करने के लिए, 1,000 व्यवहार्य एकल कोशिकाओं को प्रति 96-वेल प्लेट में 10% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स निलंबन समाधान में चढ़ाया गया था, जिसमें 12 दिनों की अवधि में विकास की निगरानी के लिए अलग-अलग समय बिंदुओं पर सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए छह प्रतिकृतियां थीं (चित्रा 3 बी) ). ऑर्गेनॉइड गठन को 3, 6, 9 और 12 दिनों में एक ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके मापा गया था, जिसमें चढ़ाना के बाद दिन 1 पर बेसलाइन रीडिंग थी। चित्रा 3 ए समय के साथ 6-वेल प्लेटों में विस्तारित एक ही ऑर्गेनोइड्स की उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों को दर्शाता है। कुछ रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड लाइनों में 2 दिनों का दोगुना समय होता है, जबकि कुछ में 5 दिन लगते हैं (चित्रा 3 बी)।

Figure 1
चित्र 1: रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स की स्थापना। (ए) रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर या सामान्य ऑर्गेनोइड ्स स्थापित करने में प्रमुख चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) डीएस 117 टी रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की स्थापना (मार्ग 0) से दीर्घकालिक संस्कृति (मार्ग 12) तक वृद्धि दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां। नीले तीर = रेशेदार सामग्री, पीले तीर = मलबे / मृत कोशिकाएं, और लाल तीर = माइक्रोएन्वायरमेंट (मुख्य रूप से फाइब्रोब्लास्ट) से सेल प्रकारों का समर्थन करते हैं। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न उपप्रकारों का प्रतिनिधित्व करने वाले रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड। शीर्ष पैनल: विभिन्न हिस्टोपैथोलॉजिकल और आणविक उपप्रकारों के रोगी स्तन ट्यूमर (बी-ई) से प्राप्त ऑर्गेनोइड लाइनों के बीच रूपात्मक अंतर। (ए) यह आंकड़ा सामान्य मानव स्तन ऊतक से प्राप्त ऑर्गेनोइड्स का प्रतिनिधित्व करता है जो रिडक्टिव मैमोप्लास्टी सर्जरी के बाद प्राप्त होता है। स्केल बार = 50 μm. नीचे पैनल: एक ही ऑर्गनॉइड लाइनों की एच एंड ई दाग वाली छवियां। स्केल बार = 100 μm। संक्षिप्त नाम: टीएनबीसी = ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति में वृद्धि। प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां और सेल व्यवहार्यता वक्र (ए और बी), जैसा कि ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख के माध्यम से मापा जाता है, जो 12 दिनों में विभिन्न रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड लाइनों की संस्कृति में वृद्धि को दर्शाता है। स्केल बार = 50 μm. त्रुटि पट्टियाँ n = 6 के लिए SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमारी प्रयोगशाला ने भोले ट्यूमर रिसेक्शन या स्क्रैपिंग से ऑर्गेनोइड्स स्थापित करने के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक नियोजित किया है। हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग रिडक्टिव मैमोप्लास्टी के माध्यम से या कैंसर रोगियों के आसन्न या डिस्टल सामान्य स्तन ऊतक से प्राप्त स्तन ऊतक से सामान्य ऑर्गेनोइड विकसित करने के लिए भी किया है। लगभग 30% -40% प्राथमिक ट्यूमर के परिणामस्वरूप सफल दीर्घकालिक (>पेज 8) ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृतियां हुईं। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड लाइनें जो कुछ अंशों के बाद कम हो गईं, उनमें या तो सामान्य ऑर्गेनोइड्स या स्ट्रोमल कोशिकाओं का विस्तार था, या इसमें मुख्य रूप से गैर-प्रोलिफेरेटिव ट्यूमर कोशिकाएं शामिल थीं। मध्यम घटकों का आगे मूल्यांकन और संशोधन जो वर्तमान में उपकला कोशिका आउटग्रोथ, या ट्यूमर सेल आबादी का पूर्व-चयन करने के अन्य साधनों का समर्थन करते हैं, पीडीओ की स्थापना और दीर्घकालिक संस्कृति के लिए सफलता दर में सुधार करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, संस्कृति में उनकी दीर्घकालिक सफलता को प्रमाणित करने के लिए सफलतापूर्वक विस्तारित ऑर्गेनोइड्स की कई शीशियों को फ्रीज करने और प्रत्येक स्थापित ऑर्गनॉइड लाइन के लिए जमे हुए शीशियों पर पिघलने वाले परीक्षण करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

कुछ सफल ऑर्गेनॉइड लाइनें जो संस्कृति में कई बार धीमी हो जाती हैं या पिघलने से उबरने के लिए संघर्ष करती हैं, अक्सर बीजारोपण घनत्व को बढ़ाने से लाभान्वित होती हैं। अधिकांश लाइनों के लिए तेजी से विकास को उत्तेजित करने में सहायता के लिए उच्च संयोजन देखा जाता है, शायद सेल-सेल इंटरैक्शन या स्रावित कारकों के परिणामस्वरूप। इसके अतिरिक्त, 70-100 μm फ़िल्टर के माध्यम से ऑर्गेनोइड्स (ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद) को फ़िल्टर करने से मृत ऑर्गेनोइड्स से जमा मलबे को हटाने में मदद मिल सकती है जो कभी-कभी कुछ ऑर्गनॉइड लाइनों को पिघलाने के बाद दिखाई देते हैं और उनके विकास में बाधा डालते हैं। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि फ़िल्टरिंग की प्रक्रिया में कुछ स्वस्थ ऑर्गेनोइड सामग्री भी खो जाती है। एस्ट्रोजेन रिसेप्टर (ईआर +) को व्यक्त करने वाली कुछ ऑर्गनॉइड लाइनें टीएनबीसी की तुलना में धीमी गति से उत्पादक हो सकती हैं, और माध्यम में एस्ट्राडियोल को जोड़ने से संभावित रूप से लाभ उठा सकती हैं। हम अनुशंसा करते हैं कि स्थापित रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड लाइनों को जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक रूप से चित्रित किया जाए। यह कई तकनीकों का उपयोग करके किया जा सकता है, जैसे कि रोगी ट्यूमर की पैथोलॉजिकल और आनुवंशिक विशेषताओं के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री मूल्यांकन (एस्ट्रोजेन रिसेप्टर, प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर, मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर 2, कैडरिन, केआई -67, आदि), आरएनए-अनुक्रमण, एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण, कैंसर चालक जीन के लिए डीएनए अनुक्रमण, कॉपी नंबर विविधताएं, आदि। यांत्रिक और दवा प्रतिक्रिया अध्ययनों के लिए, किसी को विशिष्ट अवरोधकों पर विचार करना चाहिए जो माध्यम के घटक हैं और सर्जरी से पहले रोगी द्वारा प्राप्त किसी भी पूर्व उपचार।

विभिन्न रोगियों से प्राप्त ट्यूमर ऑर्गेनॉइड लाइनें जीनोमिक उत्परिवर्तन, ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स, आकृति विज्ञान, विकास दर, बड़े ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता, विषम कोशिका आबादी की उपस्थिति आदि में भिन्न होती हैं। ये अंतर उन्हें स्थापित करने और संवर्धन करने में चुनौतियां पैदा करते हैं, हालांकि, वे रोगी विविधता और ट्यूमर जटिलता दोनों का प्रतिनिधित्व करने वाले ऑर्गेनोइड्स को मजबूत मॉडल भी बनाते हैं। स्तन ट्यूमर-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स को जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक11,36 और मेटाबोलिक स्तर44 पर मूल रोगी ट्यूमर को पुन: उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है। ये सभी कारक उन्हें दवा स्क्रीनिंग और सटीक ऑन्कोलॉजी39 के लिए शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं। रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइडएक रोमांचक नई मॉडल प्रणाली है जो कैंसर जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए तीन आयामी इन विट्रो मॉडल के रूप में काम करेगी, साथ ही व्यक्तिगत चिकित्सा के क्षेत्र को आगे बढ़ाने के लिए चिकित्सीय रूप से महत्वपूर्ण प्रश्नों की जांच करेगी। सामान्य और ट्यूमर स्तन ऑर्गेनोइड्स को सीआरआईएसपीआर इंजीनियरिंग15,38 के माध्यम से आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है, जिससे ट्यूमरजेनिसिस और कैंसर की प्रगति के लिए यांत्रिक आनुवंशिक अध्ययन के लिए उनके अनुकूल उपयोग को प्रेरित किया जा सकता है। रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स का उपयोग जेनोग्राफ्ट मॉडल 11,38,39 विकसित करने के लिए भी किया गया है जो संभावित रूप से रोगियों में ट्यूमर के विकास की नकल कर सकते हैं। इसके अलावा, रोगी-व्युत्पन्न स्तन ट्यूमर ऑर्गेनॉइड सह-संस्कृति प्रणाली अनुसंधान का एक कम-खोजा क्षेत्र है जो स्तन कैंसर कोशिकाओं और अन्य कोशिकाओं, जैसे स्ट्रोमल कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एडिपोसाइट्स आदि के बीच क्रॉसस्टॉक के महत्व में शक्तिशाली अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। ट्यूमर की प्रगति में।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम इस काम के दौरान महत्वपूर्ण चर्चाओं के लिए स्पेक्टर लैब के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम नॉर्मन सैक्स और हंस क्लेवर्स (हबरेक्ट इंस्टीट्यूट, नीदरलैंड) को शुरू में हमें अपने ऑर्गेनोइड संवर्धन प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम सेवाओं और तकनीकी विशेषज्ञता (एनसीआई 2पी 3 ओसीए 45508) के लिए सीएसएचएल कैंसर सेंटर हिस्टोलॉजी और माइक्रोस्कोपी साझा संसाधनों को स्वीकार करते हैं। हम हिस्टोलॉजिकल नमूना तैयारी के साथ सहायता के लिए डॉ किंग गाओ को धन्यवाद देते हैं। हम रोगी ट्यूमर के नमूने प्रदान करने के लिए डॉ करेन कोस्ट्रोफ (नॉर्थवेल हेल्थ) के समर्थन के लिए आभारी हैं। हम नमूना अधिग्रहण के लिए नॉर्थवेल हेल्थ बायोबैंकिंग टीम के प्रयासों की भी सराहना करते हैं, और हम अनुसंधान के लिए ऊतकों को दान करने के लिए रोगियों और उनके परिवारों को धन्यवाद देते हैं। नॉर्थवेल हेल्थ (डीएलएस), एनसीआई 5पी01सीए013106-प्रोजेक्ट 3 (डीएलएस), और लीडोस बायोमेडिकल एचएचएसएन 26100008 (डेविड ट्यूवसन और डीएलएस) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tubes VWR 525-1068
175 cm2 tissue culture flask VWR (Corning) 29185-308
37 °C bead bath
37 °C CO2 incubator
50 mL conical tubes VWR 525-1077
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) Millipore Sigma SCGP00525 SCGP00525
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter Nalgene 566-0020
6-well culture plates  Greiner Cellstar 82050-842
75 cm2 tissue culture flask VWR (Corning) 29185-304
96-well opaque plates Corning 353296 For CTG assay
A83-01 Tocris 2939
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
B-27 supplement Life Technologies 12587010
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader Fisher Scientific (Agilent) For dual luciferase assay and CTG assay
BSA fraction V (7.5%) Thermo Fisher 15260037
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent Promega G9683 luminescent cell viability assay
Centrifuge  Eppendorf 5804
Collagenase from Clostridium histolyticum Millipore Sigma C5138 Type IV
Cryolabels Amazon DTCR-1000 Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5"
Cryovials  Simport Scientific Inc. T311-1
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher AMQAX2000
DMEM, high glucose, pyruvate Thermo Fisher (Gibco) 11995040
Dual Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) Gibco 14190-144 DPBS
Epidermal growth factor (hEGF) Peprotech AF-100-15
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
FGF-10 (human) Peprotech 100-26
FGF-7/KGF (human) Peprotech 100-19
GlutaMax Life Technologies 35050061
HEK293T cells ATCC CRL-3216  For TOPFlash Assay
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells R&D Systems 3710-001-01 Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPES Life Technologies 15630-080
Heregulinβ-1 (human) Peprotech 100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) Corning 356231 Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix
Mr. Frosty Cell Freezing Container Thermo Fisher 5100-0001
Mycoplasma detection kit Lonza LT07-418
N-acetyl-l-cysteine Millipore Sigma A9165
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes Thermo Fisher 166-0045 
Nicotinamide Millipore Sigma N0636
Noggin (human) Peprotech 120-10C
P1000, P200, P10 pipettes with tips
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 Millipore Sigma S7067
Parafilm transparent film
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140122
Plasmid1: pRL-SV40P Addgene 27163
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash Addgene 12457
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash Addgene 12456
pluriStrainer 200 µm pluriSelect 43-50200-01
Primocin Invivogen ANT-PM-1
Recovery Cell Culture Freezing Medium Thermo Fisher (Gibco) 12648-010 cell freezing medium
Red Blood Cell lysis buffer Millipore Sigma 11814389001
R-spondin conditioned media In-house or commercial from Peprotech 120-38
Scalpel (No.10) Sklar Instruments Jun-10
Shaker (Incu-shaker Mini) Benchmark H1001-M
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 Tocris 2939
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Life Technologies 12605028 cell dissociation reagent
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Millipore Sigma 6365779001
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) Abmole Bioscience Y-27632
Zeocin Thermo Fisher R25001

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References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
  3. di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
  4. Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
  5. Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
  6. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  7. Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
  8. Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
  9. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  10. Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. Á, Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
  11. Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
  12. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  13. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
  14. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  15. Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
  16. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  17. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
  18. Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
  19. Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
  20. Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  21. HCMI Catalog. , Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022).
  22. Search ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022).
  23. Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
  24. Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
  25. Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
  26. Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
  27. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  28. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  29. Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
  30. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
  31. Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
  32. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  33. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  34. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  35. Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
  36. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  37. HUB Organoids: Patient in the lab. , Available from: https://www.huborganoids.nl (2022).
  38. Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
  39. Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
  40. PDX Portal. , Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022).
  41. Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
  42. Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
  43. Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
  44. Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).

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वापसी अंक 192
रोगी-व्युत्पन्न स्तन ऑर्गेनोइड्स की स्थापना और संस्कृति
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Aggarwal, D., Russo, S., Naik, P., Bhatia, S., Spector, D. L. Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids. J. Vis. Exp. (192), e64889, doi:10.3791/64889 (2023).

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