Summary
Qui viene fornito un protocollo dettagliato per stabilire organoidi mammari umani da resezioni di tumore al seno derivate da pazienti o tessuto mammario normale. Il protocollo fornisce istruzioni dettagliate complete per la coltivazione, il congelamento e lo scongelamento degli organoidi mammari derivati dal paziente umano.
Abstract
Il cancro al seno è una malattia complessa che è stata classificata in diversi sottotipi istologici e molecolari. Gli organoidi del tumore mammario derivati dal paziente sviluppati nel nostro laboratorio consistono in un mix di più popolazioni cellulari derivate dal tumore e rappresentano quindi una migliore approssimazione della diversità e dell'ambiente delle cellule tumorali rispetto alle linee cellulari tumorali 2D stabilite. Gli organoidi fungono da modello ideale in vitro , consentendo interazioni cellula-matrice extracellulare, note per svolgere un ruolo importante nelle interazioni cellula-cellula e nella progressione del cancro. Gli organoidi derivati dal paziente hanno anche vantaggi rispetto ai modelli murini in quanto sono di origine umana. Inoltre, hanno dimostrato di ricapitolare l'eterogeneità genomica, trascrittomica e metabolica dei tumori dei pazienti; Pertanto, sono in grado di rappresentare la complessità del tumore e la diversità del paziente. Di conseguenza, sono pronti a fornire informazioni più accurate sulla scoperta e la convalida del target e sui saggi di sensibilità ai farmaci. In questo protocollo, forniamo una dimostrazione dettagliata di come gli organoidi mammari derivati dal paziente sono stabiliti da tumori al seno resecati (organoidi tumorali) o tessuto mammario derivato da mammoplastica riduttiva (organoidi normali). Questo è seguito da un resoconto completo della coltura di organoidi 3D, dell'espansione, del passaggio, del congelamento e dello scongelamento delle colture di organoidi mammari derivate dal paziente.
Introduction
Il cancro al seno (BC) è il tumore maligno più comune nelle donne, con 287.850 nuovi casi stimati per essere diagnosticati negli Stati Uniti nel 20221. Nonostante i recenti progressi nella diagnosi precoce con screening annuali, terapie mirate e una migliore comprensione della predisposizione genetica, prevale per essere la seconda causa di morte per cancro nelle donne negli Stati Uniti, con > 40.000 decessi attribuiti al cancro al seno ogni anno1. Il cancro al seno è attualmente classificato in più sottotipi sulla base della valutazione istopatologica e molecolare del tumore primario. Una migliore stratificazione dei sottotipi ha migliorato gli esiti dei pazienti con opzioni di trattamento specifiche per sottotipo2. Ad esempio, l'identificazione di HER2 come proto-oncogene3 ha portato allo sviluppo di Trastuzumab, che ha reso questo sottotipo altamente aggressivo gestibile nella maggior parte dei pazienti4. Ulteriori ricerche sulla genetica e la trascrittomica di questa complessa malattia in modo specifico per il paziente aiuteranno a sviluppare e prevedere migliori regimi di trattamento personalizzati specifici per il paziente 2,5. Gli organoidi derivati dal paziente (PDO) sono un nuovo modello promettente per ottenere informazioni sul cancro a livello molecolare, identificando nuovi bersagli o biomarcatori e progettando nuove strategie di trattamento 6,7,8.
Le DOP sono strutture multicellulari, tridimensionali (3D) derivate da campioni di tessuto primario appena resecati 8,9. Sono coltivati tridimensionalmente essendo incorporati in una matrice di idrogel, tipicamente composta da una combinazione di proteine della matrice extracellulare (ECM), e quindi possono essere utilizzati per studiare le interazioni cellula tumorale-ECM. Le DOP rappresentano la diversità dei pazienti e ricapitolano l'eterogeneità cellulare e le caratteristiche genetiche del tumore10,11,12. Essendo modelli in vitro, consentono la manipolazione genetica e screening farmacologici ad alto rendimento13,14,15. Inoltre, le PDO possono essere plausibilmente utilizzate per valutare la sensibilità ai farmaci del paziente e le strategie di trattamento in parallelo alla clinica e aiutare a prevedere gli esiti dei pazienti16,17,18. Oltre alla chemioterapia, alcuni modelli organoidi sono stati utilizzati anche per esaminare le risposte individuali dei pazienti alla chemioradioterapia19,20. Data la promettente applicabilità delle DOP per la ricerca e l'uso clinico, il National Cancer Institute ha avviato un consorzio internazionale, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, per generare e fornire questi nuovi modelli di cancro derivati dal tumore. Molti dei modelli organoidi di vari tipi di cancro sviluppati attraverso l'HCMI sono disponibili tramite l'American Type Culture Collection (ATCC)22.
È stato dimostrato che gli organoidi mammari normali sono composti da diverse popolazioni di cellule epiteliali presenti nella ghiandola mammaria 11,23 e quindi servono come grandi modelli per studiare i processi biologici di base, per analizzare le mutazioni driver che causano la tumorigenesi eper gli studi sulla linea delle cellule tumorali 6,15 . I modelli di organoidi del tumore al seno sono stati utilizzati per identificare nuovi bersagli che stanno incoraggiando le prospettive per lo sviluppo di nuove terapie, in particolare per i tumori resistenti24,25,26. Utilizzando modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e organoidi derivati da PDX (PDxO) abbinati di tumori al seno resistenti al trattamento, Guillen et al. hanno dimostrato che gli organoidi sono potenti modelli per la medicina di precisione, che possono essere sfruttati per valutare le risposte ai farmaci e indirizzare le decisioni terapeutiche parallelamente28. Inoltre, lo sviluppo di nuovi metodi di co-coltura per la coltura di DOP con varie cellule immunitarie27,28,29, fibroblasti 30,31 e microbi 32,33 offre l'opportunità di studiare l'impatto del microambiente tumorale sulla progressione del cancro. Mentre molti di questi metodi di co-coltura sono attivamente stabiliti per le DOP derivate da tumori pancreatici o del colon-retto, simili metodi di co-coltura stabiliti per le DOP mammarie sono stati riportati solo per le cellule natural killer34 e i fibroblasti35.
La prima biobanca di >100 organoidi derivati da pazienti che rappresentano diversi sottotipi di cancro al seno è stata sviluppata dal gruppo Hans Clevers36,37. Come parte di questo sforzo, il gruppo Clevers ha anche sviluppato il primo terreno di coltura complesso per la crescita degli organoidi mammari, che è attualmente ampiamente utilizzato36. Uno studio di follow-up ha fornito un resoconto completo della creazione e della cultura delle DOP mammarie e degli xenotrapianti organoidi derivati dal paziente (PDOX)38. Il laboratorio Welm ha sviluppato una vasta collezione di modelli BC PDX e PDxO che sono coltivati in un mezzo di crescita relativamente più semplice contenente siero bovino fetale (FBS) e meno fattori di crescita39,40. Abbiamo sviluppato e caratterizzato in modo indipendente una vasta gamma di modelli di organoidi di carcinoma mammario naïve derivati da pazienti11 e abbiamo partecipato allo sviluppo di modelli BC DOP come parte dell'iniziativa HCMI21. Qui, miriamo a fornire una guida pratica che descriva in dettaglio la metodologia da noi impiegata nella generazione di sistemi modello di organoidi mammari derivati dal paziente.
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Protocol
Le resezioni tumorali di pazienti con cancro al seno, insieme al tessuto normale distale e adiacente, sono state ottenute da Northwell Health in conformità con i protocolli dell'Institutional Review Board IRB-03-012 e IRB 20-0150 e con il consenso informato scritto delle pazienti.
NOTA: Tutte le procedure menzionate di seguito sono state eseguite in una sala BSL2 per la coltura di tessuti di mammiferi designata per i campioni dei pazienti previa approvazione del comitato di biosicurezza. Tutte le procedure devono essere eseguite seguendo i protocolli di sicurezza che mantengono le condizioni asettiche negli armadi di biosicurezza. Ogni fase di centrifugazione viene eseguita a temperatura ambiente (RT), salvo diversa indicazione. I tessuti / organoidi e le scorte di matrice della membrana basale sono sempre posti sul ghiaccio, salvo diversa indicazione. Le nuove piastre vengono incubate durante la notte per il preriscaldamento. La placcatura delle cupole su piastre preriscaldate garantisce i migliori risultati per ottenere cupole arrotondate che non si appiattiscono durante la placcatura o il sollevamento successivo dalla superficie della piastra.
1. Preparazione media e ricette
- Preparare i mezzi condizionati da R-spondina1 come descritto di seguito (in alternativa può essere acquistato commercialmente).
- Preparare due substrati di coltivazione separati composti dal terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), 10% FBS, 5% penicillina-streptomicina e con o senza 300 μg / mL di supplementazione di zeocina.
- Scongelare una fiala di cellule HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (ottenute dal laboratorio di Calvin Kuo alla Stanford University e disponibili anche in commercio) in un matraccio di coltura tissutale da 75 cm2 con 15 ml di terreno.
- Dividere le cellule in 2 palloni di coltura da 175 cm2 , ciascuno con 35 ml di terreno contenente zeocina.
- Far passare nuovamente le cellule per ottenere tutti i palloni necessari per generare il lotto desiderato di mezzo condizionato da R-spondina1. Utilizzare il terreno di coltura senza zeocin.
- Quando i matraccio contenenti terreno senza zeocin sono confluenti, rimuovere e sostituire il substrato di coltivazione con Ad-DF+++ (punto 1.2; Tabella 1). Mettere le celle in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 per 1 settimana.
- Ruotare il mezzo a 400 x g per 5 minuti per rimuovere eventuali celle non attaccate. Filtrare il fluido attraverso un filtro da 0,22 μm. Preparare 25 ml di aliquote e conservarle a -20 °C (possono essere conservate fino a 6 mesi).
- Utilizzando cellule HEK293T, eseguire un doppio test TOPFLASH41,42 della luciferasi utilizzando un reagente commerciale di trasfezione del DNA con un rapporto reagente 4,8: 1 / DNA con il diluente DMEM (alto glucosio, piruvato). Aggiungere 100 μL di terreno condizionato R-spondina1 (o mezzo basale per il controllo negativo) a 100 μL di cellule trasfettate. Quindi, eseguire il doppio test della luciferasi secondo il protocollo del produttore per verificare l'attività Wnt del mezzo condizionato R-spondina1.
NOTA: Il test utilizza un plasmide TOP con lettura dell'attività della luciferasi Firefly e il plasmide FOP viene utilizzato come controllo negativo.
- Preparare il mezzo basale (Ad-DF+++ medium, come precedentemente pubblicato da Sachs et al.36).
Reagente Concentrazione delle scorte Concentrazione finale DMEM/F12 avanzato 1x 1x GlutaMax 100x 1x HEPES 1 m 10 mM Penicillina-streptomicina 10.000 U/ml; 10.000 μg/ml 100 U/ml; 100 μg/mL
Tabella 1: Composizione media Ad-DF+++ basale. - Preparare il mezzo completo per organoidi mammari derivati dal paziente come precedentemente pubblicato da Sachs et al.36.
Reagente Concentrazione delle scorte Concentrazione finale Ad-DF+++ medio 1x 1x R-spondin in-house 100% 10% Supplemento B-27 50x 1x Nicotinammide 1 m 5 mM NAC 500 mM 1,25 mM Primocina 50 mg/ml 50 μg/mL Zucca 100 μg/mL 100 ng/mL FEG umano 5 μg/mL 5 ng/mL Heregulin umano β1/Neuregulin1 75 μg/mL 37,5 ng/mL Y-27632 Dicloridrato (Rho-chinasi) 100 mM 5 μM A83-01 5 mM 500 nM FGF-7 umano 100 μg/mL 5 ng/mL FGF-10 umano 1 mg/ml 20 ng/mL P38I 30 mM 498 nM
Tabella 2: Composizione completa del terreno per organoidi mammari derivati da pazienti. - Preparare 2 mg/mL di soluzione di collagenasi IV pesando la quantità necessaria di collagenasi IV in polvere e solubilizzandola in mezzo basale Ad-DF+++. Filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm prima dell'uso.
- Preparare una soluzione di albumina sierica bovina allo 0,5% (BSA) da una soluzione madre al 7,5% utilizzando 1x soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) come diluente. Filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm prima dell'uso.
2. Stabilire il tumore al seno/organoidi normali dal tessuto resecato (Figura 1)
- Trasportare un tumore al seno resecato chirurgicamente / campione di tessuto normale in laboratorio in un tubo conico da 50 mL contenente Ad-DF ++ +. Conservare il tubo sul ghiaccio fino all'inizio dell'isolamento.
- Scongelare una bottiglia di matrice di membrana basale sul ghiaccio o per una notte a 4 °C.
- Trasferire il tessuto resecato in una capsula di Petri sterile di 10 cm. Esaminare il tessuto macroscopicamente e prendere nota se appare morfologicamente grasso, vascolarizzato o necrotico. Inoltre, registrare le dimensioni e la forma del tessuto. Idealmente, scattare una foto del tessuto con un righello in vista (Figura 2).
- Tritare il tessuto in pezzi molto piccoli (~ 1 mm3) con un bisturi sterile n. 10 e trasferirlo in un tubo conico da 50 ml.
- Aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi IV da 2 mg/ml e sigillare il tubo con una pellicola trasparente. Posizionare il tubo su un agitatore orbitale a 37 °C a 140 giri/min per 30-90 minuti in posizione angolata (angolo ~30°).
- Durante l'incubazione, porre un'aliquota di terreno completo per preriscaldare in un bagnomaria a 37 °C.
- Ogni 15 minuti, risospendere il tessuto mescolando su e giù vigorosamente usando una pipetta sierologica sterile da 5 ml. Pre-rivestire la pipetta con una soluzione di BSA allo 0,5% per evitare la perdita di tessuto causata dall'adesione del campione alla pipetta. Monitorare la dissociazione nel tempo osservando il tubo conico al microscopio con un ingrandimento 5x o superiore.
- Una volta dissociato il tessuto, centrifugare a 400 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante, aggiungere 10 mL di Ad-DF+++ e centrifugare a 400 x g per 5 minuti.
- Scartare il surnatante con attenzione. I pellet di tessuto possono occasionalmente essere sciolti, quindi fai attenzione quando si aspira. Ripetere il passaggio ancora una volta.
- Se il pellet di tessuto è parzialmente rosso, aggiungere 2 ml di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Non incubare più a lungo, in quanto ciò ridurrà significativamente la vitalità cellulare.
- Aggiungere 10 mL di Ad-DF+++ alla provetta, centrifugare a 400 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 50-300 μL di matrice di membrana basale fredda non diluita e miscelare mediante pipettaggio accurato per evitare la formazione di bolle.
NOTA: Il volume della matrice della membrana basale aggiunta dipende dalla dimensione del pellet. Se non si è sicuri, placcare una piccola cupola di ~ 10 μL dal pellet risospeso e osservare la confluenza al microscopio. Regolare aggiungendo più matrice di membrana basale, se necessario. Fare riferimento alla Figura 3 (immagine del giorno 1) per una densità di semina di riferimento. - Piastra 300 μL di cupola a matrice di membrana basale contenente organoidi in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale preriscaldata, etichettata, a 6 pozzetti. Fare riferimento alla Tabella 3 per la matrice della membrana basale raccomandata e i volumi medi se si utilizzano piastre diverse.
Numero di pozzi per piastra Matrice della membrana basale per cupola (μL) Mezzo per pozzetto (μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (sospensione al posto della cupola) 100
Tabella 3: Quantità di matrice della membrana basale e terreno di crescita raccomandata per pozzetto in base alle dimensioni della piastra. - Lasciare la piastra indisturbata nella cappa per 5 minuti e quindi posizionare con cura nell'incubatore a 37 °C per 20-30 minuti affinché la cupola della matrice della membrana basale si solidifichi completamente.
- Aggiungere 3 ml di mezzo completo preriscaldato a goccia a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e collocare nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2. Scatta immagini degli organoidi usando un obiettivo 5x su un microscopio a campo luminoso invertito.
- Ricostituire il mezzo ogni 4-8 giorni in base alla crescita degli organoidi. Aspirare con cura il vecchio mezzo senza disturbare la cupola e aggiungere un mezzo fresco e preriscaldato a goccia.
NOTA: Il protocollo è lo stesso per stabilire organoidi di cancro al seno derivati dal tumore resecato e per organoidi normali derivati da tessuto mammario sano resecato (sia da tessuto mammario adiacente e normale della stessa paziente o tessuto mammario sano ottenuto da un intervento di mammoplastica riduttiva).
3. Passare ed espandere gli organoidi mammari derivati dal paziente in coltura
- Scongelare una bottiglia di matrice di membrana basale sul ghiaccio o per una notte a 4 °C.
- Sollevare la cupola della matrice della membrana basale nel mezzo nel pozzetto utilizzando un raschietto cellulare o una punta per pipetta da 1 ml.
- Pre-rivestire la punta della pipetta con soluzione di BSA allo 0,5% e quindi trasferire la cupola galleggiante degli organoidi con un mezzo a un tubo conico da 15 ml o 50 ml, a seconda del numero di pozzetti raccolti. Per più di due pozzetti contenenti 300 μL di cupole a matrice di membrana basale, utilizzare un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 1x DPBS per aumentare il volume ad almeno 5 ml.
- Girare i tubi a 400 x g per 5 minuti. La matrice della membrana basale con organoidi forma uno strato nella parte inferiore. Aspirare con attenzione per rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 5-20 ml di 1x DPBS, a seconda del numero di pozzetti raggruppati in un tubo. Pre-rivestire una pipetta monouso sterile con BSA allo 0,5% e mescolare uniformemente il pellet della matrice della membrana organoide-basale in DPBS mediante pipettaggio su e giù.
- Girare i tubi a 400 x g per 5 minuti. Aspirare con cautela e scartare il surnatante.
- Aggiungere il reagente di dissociazione cellulare a tre volte il volume della matrice della membrana basale al tubo. Utilizzando una punta per pipetta rivestita di BSA allo 0,5%, risospendere gli organoidi nel reagente di dissociazione cellulare.
- Posizionare il tubo su un agitatore orbitale a 37 °C a 140 giri/min per 8-15 minuti in posizione angolata. Monitorare il tubo osservandolo al microscopio ogni 5 minuti per assicurarsi che gli organoidi siano suddivisi in gruppi più piccoli.
- Aggiungere il mezzo basale (cioè Ad-DF+++) ad un volume uguale o superiore al reagente di dissociazione cellulare e pipettare per miscelare gli organoidi. Girare a 400 x g per 5 minuti a RT per ottenere un pellet organoide.
- Se il pellet contiene organoidi ancora incorporati nella matrice della membrana basale non disciolta, ripetere i passaggi 3,7-3,9 per ulteriori 5-8 minuti di tripsinizzazione.
- Una volta ottenuto un pellet organoide bianco senza matrice di membrana basale non disciolta, scartare il surnatante e aggiungere 1 mL di Ad-DF+++ per risospendere il pellet mediante pipettaggio. Quindi aggiungere più Ad-DF+++ fino a 10 ml.
- Girare a 400 x g per 5 minuti a RT per la fase di lavaggio. Aspirare e scartare il surnatante.
- Aggiungere la quantità richiesta di matrice di membrana basale agli organoidi digeriti in base al rapporto di divisione appropriato (questo varierà ampiamente per ogni linea organoide in base al tasso di crescita). Fare riferimento alla Figura 3 (immagine del giorno 1) per un esempio di densità di semina. Mescolare pipettando delicatamente su e giù per evitare di creare bolle. Mettere immediatamente sul ghiaccio.
- Aprire ed etichettare una piastra a 6 pozzetti preriscaldata. Si consiglia di placcare una cupola da 10-20 μL nell'angolo di un pozzo per osservare la confluenza al microscopio. Se gli organoidi sono confluenti, è possibile aggiungere più matrice di membrana basale per aumentare il rapporto di divisione.
- Cupole di organoidi da 300 μL risospese nella matrice della membrana basale. Assicurarsi di mantenere il tubo sul ghiaccio mentre si placcano più pozzetti in modo che la matrice della membrana basale rimanga in soluzione.
- Lasciare la piastra indisturbata nella cappa per 5 minuti e poi posizionare con cura in un'incubatrice a 37 °C con CO2 al 5% senza disturbare le cupole.
- Dopo 20-30 minuti, le cupole si solidificano. Aggiungere 3 ml di mezzo completo preriscaldato a ciascun pozzetto e riposizionare la piastra nell'incubatore. Aggiungere un mezzo completo fresco ogni 5-7 giorni. Eseguire test di routine delle colture per rilevare la contaminazione da micoplasma.
NOTA: Il protocollo per la coltura dei tumori al seno e degli organoidi normali è lo stesso. Tuttavia, nella nostra esperienza, gli organoidi normali tendono a crescere bene fino al passaggio 6-8 prima di rallentare. Si consiglia di effettuare il maggior numero possibile di scorte di passaggio precoce per la ricerca futura.
4. Congelamento di organoidi mammari derivati da pazienti
- Far passare pozzetti confluenti di organoidi per rimuovere qualsiasi matrice di membrana basale, come indicato nei passaggi 3.1-3.12.
- Risospendere il pellet di organoidi in mezzo di congelamento cellulare (scongelato durante la notte a 4 ºC) con 1 ml di terreno per 200-300 μL di volume della matrice della membrana basale prima del passaggio. Eseguire un conteggio delle celle prima del congelamento per riferimento. Aliquot un piccolo volume (almeno 100 μL) di cellule da sottoporre a ulteriore tripsinizzazione, se necessario, per ottenere singole cellule, e quindi contarle usando una macchina contatore di cellule.
- Trasferire 1 mL di cellule in 2 mL di crioviali etichettati con numero di linea organoide, data e numero di passaggio. Assicurati di etichettare i tubi con un pennarello permanente o utilizzare crioetichette.
- Spostare i flaconcini in un contenitore di congelamento cellulare e trasferire il contenitore in un congelatore a -80 °C. Dopo l'incubazione durante la notte, le fiale sono pronte per essere spostate in un congelatore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
5. Scongelamento degli organoidi mammari derivati dal paziente
- Scongelare una bottiglia di matrice di membrana basale sul ghiaccio o per una notte a 4 °C. Mezzo Ad-DF+++ pre-caldo a 37 °C. Aliquote 9 mL di mezzo preriscaldato in tubi conici da 15 mL per ciascun flaconcino congelato.
- Scongelare rapidamente il flaconcino congelato di organoidi ponendolo in un bagno di perline a 37 °C. Spruzzare etanolo al 70% e trasferire il tubo nell'armadio di biosicurezza.
- Risciacquare la punta della pipetta con una soluzione BSA allo 0,5% per evitare la perdita di organoidi. Mescolare delicatamente gli organoidi scongelati pipettando su e giù per mescolare eventuali organoidi sedimentati nel tubo.
- Trasferire delicatamente 1 mL di organoidi congelati a 9 mL di Ad-DF+++ preriscaldato in senso goccia. Ruotare le cellule a 400 x g per 5 minuti e poi scartare con attenzione il surnatante.
- Lavare il pellet aggiungendo 10 ml di Ad-DF+++ fresco preriscaldato al pellet organoide e mescolare delicatamente con una pipetta pre-rivestita con BSA allo 0,5% per risospendere il pellet. Ruotare le cellule a 400 x g per 5 minuti e scartare con attenzione il surnatante.
- Posizionare il pellet organoide sul ghiaccio e rimuovere con cautela eventuali residui di Ad-DF+++ utilizzando una punta per pipetta di volume inferiore. Risospendere il pellet in 300 μL di matrice di membrana basale e piastra in una piastra preriscaldata a 6 pozzetti. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
NOTA: Si consiglia di placcare una piccola cupola da 10 μL dal pellet risospeso in un angolo del pozzetto per discernere la confluenza al microscopio. Se gli organoidi sembrano confluenti, diluire aggiungendo 300 μL di matrice di membrana basale alla piastra in due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. - Dopo un'incubazione di 20-30 minuti, aggiungere 3 ml di mezzo completo preriscaldato alla cupola solidificata.
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Representative Results
Abbiamo creato una biobanca di organoidi di tumore mammario derivati da pazienti che comprende vari sottotipi11. Inoltre, abbiamo stabilito più linee organoidi mammarie normali derivate da campioni di tessuto di mammoplastica riduttiva o da mammelle normali adiacenti / distali da pazienti BC utilizzando l'approccio descritto nella Figura 1.
Le varie linee organoidi di tumore mammario derivate da pazienti differiscono nella loro morfologia (Figura 2) e nel tasso di crescita (Figura 3). Gli organoidi mammari normali e i pochi organoidi derivati dal carcinoma duttale precoce in situ (DCIS) che abbiamo stabilito, assomigliano alla normale struttura mammaria con un lume centrale circondato da cellule duttali (Figura 2A, B). Gli organoidi derivati da un carcinoma lobulare invasivo (Figura 2C) tendono a formare strutture simili a grappoli d'uva debolmente attaccate, come riportato in precedenza da altri laboratori36,43. Nel frattempo, gli organoidi derivati da carcinomi duttali invasivi (carcinoma mammario positivo al recettore ormonale e triplo negativo) tendono a formare organoidi densi, grandi e rotondi (Figura 2D,E). Gli organoidi sono stati fissati con paraformaldeide al 4% seguita da stampi di agarosio al 2%. Sono stati poi incorporati in paraffina e sezioni da 10 μm sono state colorate con ematossilina ed eosina (come descritto in Bhatia et al.11) per osservare la morfologia.
Per dimostrare le differenze nel tasso di crescita di diverse linee organoidi di tumore mammario derivate dal paziente, sono state placcate 1.000 singole cellule vitali in una soluzione di sospensione a matrice basale al 10% per piastra a 96 pozzetti, con sei repliche ciascuna per determinare la vitalità cellulare in diversi punti temporali per monitorare la crescita per un periodo di 12 giorni (Figura 3B ). La formazione di organoidi è stata misurata utilizzando un saggio di vitalità cellulare luminescente nei giorni 3, 6, 9 e 12, con una lettura basale il giorno 1 dopo la placcatura. La Figura 3A mostra immagini a campo chiaro degli stessi organoidi espansi in lastre a 6 pozzetti nel tempo. Alcune linee organoidi derivate dal paziente hanno un tempo di raddoppio di 2 giorni, mentre alcune impiegano 5 giorni (Figura 3B).
Figura 1: Determinazione degli organoidi mammari derivati da pazienti. (A) Rappresentazione schematica delle fasi principali nella determinazione di tumori mammari derivati da pazienti o organoidi normali. (B) Immagini rappresentative che mostrano la crescita degli organoidi del tumore mammario derivati da pazienti DS117T dall'istituzione (passaggio 0) alla coltura a lungo termine (passaggio 12). Frecce blu = materiale fibroso, frecce gialle = detriti / cellule morte e frecce rosse = tipi di cellule di supporto dal microambiente (principalmente fibroblasti). Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: organoidi mammari derivati da pazienti che rappresentano diversi sottotipi. Pannello superiore: differenze morfologiche tra linee organoidi derivate da tumori mammari di pazienti (B-E) di diversi sottotipi istopatologici e molecolari. (A) La figura rappresenta organoidi derivati da tessuto mammario umano normale ottenuto dopo chirurgia mammoplastica riduttiva. Barra di scala = 50 μm. Pannello inferiore: immagini colorate H&E delle stesse linee organoidi. Barra di scala = 100 μm. Abbreviazione: TNBC = carcinoma mammario triplo negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Crescita in coltura di diversi organoidi di tumore mammario derivati da pazienti. Immagini rappresentative in campo chiaro e curve di vitalità cellulare (A e B), misurate tramite un saggio luminescente di vitalità cellulare che mostra la crescita in coltura di diverse linee organoidi di tumore mammario derivate da pazienti nell'arco di 12 giorni. Barra di scala = 50 μm. Le barre di errore rappresentano SEM per n = 6. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il nostro laboratorio ha impiegato con successo i protocolli di cui sopra per stabilire organoidi da resezioni tumorali naïve o raschiamenti. Abbiamo anche utilizzato questo protocollo per sviluppare organoidi normali da tessuto mammario ottenuto tramite mammoplastica riduttiva o da tessuto mammario normale adiacente o distale di pazienti oncologici. Circa il 30% -40% dei tumori primari resecati ha portato a colture organoidi tumorali di successo a lungo termine (>passaggio 8). Le linee organoidi tumorali che si assottigliavano dopo pochi passaggi avevano una crescita di organoidi normali o cellule stromali, o consistevano principalmente di cellule tumorali non proliferative. Un'ulteriore valutazione e modifica dei componenti del terreno che attualmente favoriscono la crescita delle cellule epiteliali, o altri mezzi di preselezione delle popolazioni di cellule tumorali, dovrebbero migliorare il tasso di successo per l'istituzione e la coltura a lungo termine delle DOP. Inoltre, si consiglia vivamente di congelare diverse fiale di organoidi espansi con successo ed eseguire test di scongelamento su fiale congelate per ogni linea di organoidi stabilita per autenticare il loro successo a lungo termine in coltura.
Alcune linee organoidi di successo che rallentano a volte in coltura o lottano per riprendersi da un disgelo spesso beneficiano dell'aumento della densità di semina. Si osserva una maggiore confluenza per aiutare a stimolare una crescita più rapida per la maggior parte delle linee, probabilmente a causa di interazioni cellula-cellula o fattori secreti. Inoltre, filtrare gli organoidi (dopo tripsinizzazione) attraverso un filtro da 70-100 μm può aiutare a rimuovere i detriti accumulati dagli organoidi morti che a volte compaiono dopo lo scongelamento di alcune linee organoidi e tendono a ostacolarne la crescita. Tuttavia, va notato che alcuni materiali organoidi sani vengono persi anche nel processo di filtraggio. Alcune linee organoidi che esprimono il recettore degli estrogeni (ER +) possono essere coltivatori lenti rispetto al TNBC e potrebbero potenzialmente beneficiare dell'aggiunta di estradiolo al substrato. Si raccomanda che le linee organoidi consolidate del tumore mammario derivato dal paziente siano caratterizzate genomicamente e trascrittomicamente. Questo può essere fatto utilizzando diverse tecniche, come la valutazione immunoistochimica per le caratteristiche patologiche e genetiche dei tumori del paziente (espressione del recettore degli estrogeni, recettore del progesterone, fattore di crescita epidermico umano 2, caderina, Ki-67, ecc.), Sequenziamento dell'RNA, sequenziamento dell'RNA a singola cellula, sequenziamento del DNA per i geni driver del cancro, variazioni del numero di copie, ecc. Per gli studi meccanicistici e di risposta ai farmaci, è necessario considerare gli inibitori specifici che sono componenti del mezzo e qualsiasi trattamento precedente ricevuto dal paziente prima dell'intervento chirurgico.
Le linee organoidi tumorali derivate da diversi pazienti variano in mutazioni genomiche, trascrittomica, morfologia, tasso di crescita, capacità di formare organoidi di grandi dimensioni, presenza di popolazioni cellulari eterogenee, ecc. Queste differenze pongono sfide nello stabilirli e coltivarli, tuttavia, rendono anche gli organoidi modelli robusti che rappresentano sia la diversità del paziente che la complessità del tumore. Gli organoidi derivati dal tumore della mammella hanno dimostrato di ricapitolare i tumori originali del paziente ai livelli genomico, trascrittomico11,36 e metabolomico44. Tutti questi fattori li rendono potenti strumenti per lo screening farmacologico e l'oncologia di precisione39. Gli organoidi derivati dal paziente sono un nuovo entusiasmante sistema modello che servirà come modelli tridimensionali in vitro per studiare la biologia del cancro, oltre a esaminare questioni terapeuticamente importanti per far progredire il campo della medicina personalizzata. Gli organoidi mammari normali e tumorali possono essere geneticamente modificati tramite l'ingegneria CRISPR15,38, spingendo il loro uso favorevole per studi genetici meccanicistici per la tumorigenesi e la progressione del cancro. Gli organoidi del tumore al seno derivati dal paziente sono stati utilizzati anche per sviluppare modelli di xenotrapianto 11,38,39 che possono potenzialmente imitare la crescita tumorale nei pazienti. Inoltre, i sistemi di co-coltura organoide del tumore mammario derivati dal paziente rimangono un'area di ricerca poco esplorata che può fornire potenti intuizioni sull'importanza della diafonia tra cellule di cancro al seno e altre cellule, come fibroblasti associati al cancro stromale, cellule immunitarie, adipociti, ecc. nella progressione del tumore.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Spector per le discussioni critiche nel corso di questo lavoro. Ringraziamo Norman Sachs e Hans Clevers (Hubrecht Institute, Paesi Bassi) per averci fornito inizialmente il loro protocollo di coltura organoide. Riconosciamo le risorse condivise di istologia e microscopia del CSHL Cancer Center per i servizi e le competenze tecniche (NCI 2P3OCA45508). Ringraziamo il Dr. Qing Gao per l'assistenza nella preparazione del campione istologico. Siamo grati per il supporto della dottoressa Karen Kostroff (Northwell Health) per aver fornito campioni di tumore ai pazienti. Apprezziamo anche gli sforzi del team di Northwell Health Biobanking per l'acquisizione di campioni e ringraziamo i pazienti e le loro famiglie per aver donato tessuti per la ricerca. Questa ricerca è stata supportata da CSHL / Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) e Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson e D.L.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
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