Summary
환자 유래 유방 종양 절제술 또는 정상 유방 조직에서 인간 유방 오가노이드를 확립하기 위한 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 이 프로토콜은 인간 환자 유래 유방 오가노이드의 배양, 동결 및 해동에 대한 포괄적인 단계별 지침을 제공합니다.
Abstract
유방암은 여러 가지 조직학적 및 분자적 아형으로 분류되는 복잡한 질병입니다. 우리 실험실에서 개발된 환자 유래 유방 종양 오가노이드는 여러 종양 유래 세포 집단의 혼합으로 구성되므로 확립된 2D 암 세포주보다 종양 세포 다양성과 환경에 대한 더 나은 근사치를 나타냅니다. 오가노이드는 이상적인 체외 모델로 작용하여 세포-세포 상호작용 및 암 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 세포-세포 외 기질 상호작용을 가능하게 합니다. 환자 유래 오가노이드는 또한 인간 유래이기 때문에 마우스 모델에 비해 장점이 있습니다. 또한, 그들은 환자 종양의 게놈, 전사체 및 대사 이질성을 요약하는 것으로 나타났습니다. 따라서 종양 복잡성과 환자 다양성을 나타낼 수 있습니다. 그 결과, 표적 발견 및 검증과 약물 민감도 분석에 대한 보다 정확한 통찰력을 제공할 준비가 되어 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 절제된 유방 종양(암 오가노이드) 또는 환원성 유방 성형술 유래 유방 조직(정상 오가노이드)에서 환자 유래 유방 오가노이드가 어떻게 확립되는지에 대한 자세한 시연을 제공합니다. 그 다음에는 3D 오가노이드 배양, 확장, 계대, 동결 및 환자 유래 유방 오가노이드 배양의 해동에 대한 포괄적인 설명이 이어집니다.
Introduction
유방암(BC)은 여성에서 가장 흔하게 발생하는 악성 종양으로, 2022년 미국에서 287,850건의 새로운 사례가 진단된 것으로 추정됩니다1. 최근 연례 검진, 표적 치료 및 유전적 소인에 대한 더 나은 이해를 통한 조기 발견의 발전에도 불구하고 유방암은 미국 여성의 암 사망의 두 번째 주요 원인으로 우세하며 매년 >40,000명이 유방암으로 사망합니다1. 유방암은 현재 원발성 종양의 조직병리학적 및 분자적 평가에 기초하여 여러 아형으로 분류된다. 더 나은 아형 계층화는 아형별 치료 옵션으로 환자 결과를 개선했습니다2. 예를 들어, HER2를 원발암유전자(proto-oncogene)3로 식별함으로써 트라스투주맙(Trastuzumab)이 개발되었고, 이로 인해 대부분의 환자에서 매우 공격적인 아형을 관리할 수 있게 되었다4. 환자 특이적 방식으로 이 복잡한 질병의 유전학 및 전사체학에 대한 추가 연구는 더 나은 환자 맞춤형 치료 요법을 개발하고 예측하는 데 도움이 될 것이다 2,5. 환자 유래 오가노이드(PDO)는 분자 수준에서 암에 대한 통찰력을 얻고, 새로운 표적 또는 바이오마커를 식별하고, 새로운 치료 전략을 설계할 수 있는 유망한 새로운 모델입니다 6,7,8.
PDO는 갓 절제된 일차 조직 샘플로부터 유래된 다세포, 3차원(3D) 구조이다 8,9. 이들은 일반적으로 세포외 기질(ECM) 단백질의 조합으로 구성된 하이드로겔 매트릭스에 내장되어 3차원적으로 성장하므로 종양 세포-ECM 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. PDO는 환자 다양성을 나타내고 종양의 세포 이질성 및 유전적 특징을 요약한다10,11,12. 시험관 내 모델이기 때문에 유전자 조작 및 고처리량 약물 스크리닝이 가능합니다13,14,15. 또한, PDO는 임상과 병행하여 환자의 약물 감수성 및 치료 전략을 평가하고 환자 결과를 예측하는 데 그럴듯하게 활용될 수 있다(16,17,18). 화학요법 외에, 화학방사선 요법에 대한 개별 환자의 반응을 조사하기 위해 특정 오가노이드 모델이 사용되었다19,20. 연구 및 임상 사용을 위한 PDO의 유망한 적용 가능성을 감안하여 국립 암 연구소(National Cancer Institute)는 이러한 종양 유래 새로운 암 모델을 생성하고 제공하기 위해 국제 컨소시엄인 HCMI(Human Cancer Models Initiative)21를 시작했습니다. HCMI를 통해 개발된 다양한 암 유형의 많은 오가노이드 모델은 ATCC(American Type Culture Collection)22를 통해 사용할 수 있습니다.
정상 유방 오가노이드는 유선에 존재하는 다양한 상피 세포 집단으로 구성되는 것으로 나타났으며11,23 따라서 기본적인 생물학적 과정을 연구하고, 종양 형성을 유발하는 드라이버 돌연변이를 분석하고, 암세포 기원 계통 연구를 위한 훌륭한 모델 역할을 합니다 6,15 . 유방 종양 오가노이드 모델은 특히 내성 종양에 대한 새로운 치료법 개발에 대한 전망을 장려하는 새로운 표적을 식별하는 데 사용되었습니다24,25,26. Guillen et al.은 치료 저항성 유방 종양의 환자 유래 이종이식(PDX) 및 일치하는 PDX 유래 오가노이드(PDxO) 모델을 사용하여 오가노이드가 정밀 의학을 위한 강력한 모델이며, 약물 반응과 직접 치료 결정을 병렬로 평가하는 데 활용할 수 있음을 보여주었습니다28. 또한, 다양한 면역 세포27,28,29, 섬유아세포30,31 및 미생물 32,33을 가진 PDO를 배양하기 위한 새로운 공동 배양 방법의 개발은 종양 미세 환경이 암 진행에 미치는 영향을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 췌장 종양 또는 결장직장 종양으로부터 유래된 PDO에 대해 많은 이러한 공동배양 방법이 활발히 확립되고 있는 반면, 유방 PDO에 대해 확립된 유사한 공동배양 방법은 자연 살해 세포(34) 및 섬유아세포(35)에 대해서만 보고되었다.
다양한 유방암 아형을 대표하는 >100개의 환자 유래 오가노이드의 첫 번째 바이오뱅크는 Hans Clevers 그룹36,37에 의해 개발되었습니다. 이러한 노력의 일환으로, Clevers 그룹은 유방 오가노이드 성장을 위한 최초의 복합 배양 배지를 개발했으며, 이는 현재 널리 사용되고 있다36. 후속 연구는 유방 PDO 및 환자 유래 오가노이드 이종이식편(PDOX)의 확립 및 배양에 대한 포괄적인 설명을 제공했습니다38. Welm 연구실은 태아 소 혈청(FBS)과 더 적은 성장 인자를 포함하는 비교적 단순한 성장 배지에서 배양된 BC PDX 모델 및 PDxO의 대규모 컬렉션을 개발했습니다39,40. 우리는 순진한 환자 유래 유방암 오가노이드 모델11을 독립적으로 개발하고 특성화했으며 HCMI 이니셔티브21의 일환으로 BC PDO 모델 개발에 참여했습니다. 여기에서 우리는 환자 유래 유방 오가노이드 모델 시스템을 생성하는 데 사용하는 방법론을 자세히 설명하는 실용적인 가이드를 제공하는 것을 목표로 합니다.
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Protocol
원위 및 인접 정상 조직과 함께 유방암 환자의 종양 절제술은 기관 검토 위원회 프로토콜 IRB-03-012 및 IRB 20-0150에 따라 환자의 서면 동의 하에 Northwell Health에서 얻었습니다.
참고: 아래에 언급된 모든 절차는 생물안전 위원회의 승인에 따라 환자 샘플을 위해 지정된 포유류 조직 배양 BSL2 방에서 수행되었습니다. 모든 절차는 생물 안전 캐비닛에서 무균 상태를 유지하는 안전 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다. 각 원심분리 단계는 달리 명시되지 않는 한 실온(RT)에서 수행된다. 조직/오가노이드 및 기저막 매트릭스 스톡은 달리 명시되지 않는 한 항상 얼음 위에 놓입니다. 새로운 플레이트는 예열을 위해 밤새 배양됩니다. 예열된 플레이트에 돔을 도금하면 플레이트 표면에서 나중에 도금하거나 들어 올리는 동안 평평해지지 않는 둥근 돔을 얻을 수 있는 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.
1. 중간 준비 및 조리법
- 아래에 설명된 대로 R-spondin1 조절 배지를 준비합니다(또는 상업적으로 구입할 수 있음).
- Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM), 10% FBS, 5% 페니실린-스트렙토마이신 및 300μg/mL 제오신 보충제 유무에 관계없이 구성된 두 개의 별도 성장 배지를 준비합니다.
- HEK293T-HA-Rspondin1-Fc 세포 바이알(스탠포드 대학의 Calvin Kuo 연구실에서 구입하고 상업적으로도 이용 가능)을 15mL의 배지가 있는 75cm2 조직 배양 플라스크에서 해동합니다.
- 세포를 2 x 175cm2 배양 플라스크로 분할하고, 각각 제오신을 함유하는 배지 35mL를 가진다.
- 세포를 다시 계대배양하여 원하는 배치의 R-spondin1 조건화 배지를 생성하는 데 필요한 만큼의 플라스크를 얻습니다. 제오신이 없는 성장 배지를 사용하십시오.
- 제오신이 없는 배지를 함유한 플라스크가 합류하면 성장 배지를 제거하고 Ad-DF+++로 교체합니다(단계 1.2; 표 1). 세포를 1주일 동안 5%CO2 가 있는 37°C 인큐베이터에 넣는다.
- 배지를 400 x g 에서 5분 동안 회전시켜 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 0.22μm 필터를 통해 배지를 여과합니다. 25mL 분취량을 만들어 -20°C에서 보관합니다(최대 6개월 보관 가능).
- HEK293T 세포를 사용하여 희석제 DMEM(고포도당, 피루브산)과 함께 4.8:1 시약 대 DNA 비율로 상용 DNA 형질주입 시약을 사용하여 이중 루시페라제 TOPFLASH41,42 분석을 수행합니다. 100 μL의 R-spondin1 컨디셔닝 배지(또는 음성 대조군의 경우 기본 배지)를 100 μL의 형질주입된 세포에 추가합니다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 이중 루시페라아제 분석을 수행하여 R-spondin1 조절 배지의 Wnt 활성을 확인합니다.
참고: 분석은 반딧불이 루시페라아제 활성 판독값이 있는 TOP 플라스미드를 사용하고 FOP 플라스미드는 음성 대조군으로 사용됩니다.
- 기본 배지(Ad-DF++++ 배지, 이전에 Sachs et al.36에 의해 발표됨)를 준비합니다.
시약 재고 집중 최종 농도 고급 DMEM/F12 1배 1배 글루타맥스 100배 1배 헤페스 1 미터 10 밀리엠 페니실린-스트렙토마이신 10,000 U/mL; 10,000 μg/mL 100 U/mL; 100μg/mL
표 1: 기초 Ad-DF+++ 배지 조성. - 이전에 Sachs et al.36에 의해 발표된 바와 같이 환자 유래 유방 오가노이드에 대한 완전한 배지를 준비합니다.
시약 재고 집중 최종 농도 Ad-DF+++ 매체 1배 1배 R-spondin 사내 100% 10% B-27 보충 교재 50배 1배 니코틴 아미드 1 미터 5 밀리엠 증권 시세 표시기 500 밀리엠 1.25 밀리엠 프리모신 50 밀리그램/mL 50 μg/mL 머리 100μg/mL 100ng/mL 인간 EGF 5 μg/mL 5ng/mL 인간 헤레귤린 β1/뉴레굴린1 75μg/mL 37.5ng/mL Y-27632 디히드로클로라이드 (Rho-Kinase) 100 밀리엠 5 마이크로미터 A83-01 (영문) 5 밀리엠 500 나노미터 인간 FGF-7 100μg/mL 5ng/mL 인간 FGF-10 1 밀리그램/mL 20ng/mL P38i 30 밀리엠 498 나노미터
표 2: 환자 유래 유방 오가노이드에 대한 완전한 배지 조성. - 필요한 양의 콜라게나제 IV 분말을 칭량하고 Ad-DF++++ 기본 배지에 가용화하여 2mg/mL 콜라게나제 IV 용액을 준비합니다. 사용하기 전에 0.22μm 필터를 통해 필터링하십시오.
- 희석제로 1x Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS)을 사용하여 7.5% 원액에서 0.5% 소혈청알부민(BSA) 용액을 준비합니다. 사용하기 전에 0.22μm 필터를 통해 필터링하십시오.
2. 절제된 조직에서 유방 종양/정상 오가노이드 확립(그림 1)
- 외과적으로 절제된 유방 종양/정상 조직 표본을 Ad-DF+++가 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣어 실험실로 운반합니다. 격리가 시작될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
- 기저막 매트릭스 한 병을 얼음 위에서 또는 4°C에서 밤새 해동합니다.
- 절제된 조직을 10cm 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. 조직을 거시적으로 검사하고 형태학적으로 지방이 있거나, 혈관이 있거나, 괴사된 것처럼 보이는지 기록해 두십시오. 또한 조직의 크기와 모양을 기록하십시오. 이상적으로는 눈금자가 보이는 상태에서 조직 사진을 찍습니다(그림 2).
- 멸균 10번 메스로 조직을 매우 작은 조각(~1mm3)으로 다지고 50mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다.
- 2mg/mL 콜라게나제 IV 용액 10mL를 넣고 투명 필름으로 튜브를 밀봉합니다. 튜브를 37°C의 오비탈 셰이커에 140rpm에서 30-90분 동안 비스듬한 위치(~30° 각도)로 놓습니다.
- 인큐베이션 동안, 37°C 비드/수조에서 예열하기 위해 완전 배지의 분취량을 놓는다.
- 15분마다 5mL 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 세게 혼합하여 조직을 재현탁합니다. 샘플이 피펫에 달라붙어 발생하는 조직 손실을 방지하기 위해 0.5% BSA 용액으로 피펫을 미리 코팅합니다. 현미경으로 원뿔형 튜브를 5x 이상의 배율로 관찰하여 시간 경과에 따른 해리를 모니터링합니다.
- 조직이 해리되면 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 Ad-DF+++ 10mL를 넣고 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 조심스럽게 버리십시오. 조직 펠릿은 때때로 느슨할 수 있으므로 흡인할 때 주의하십시오. 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 조직 펠릿이 부분적으로 빨간색이면 적혈구 용해 완충액 2mL를 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 세포 생존력을 현저히 감소시킬 수 있으므로 더 오래 배양하지 마십시오.
- Ad-DF+++ 10mL를 튜브에 넣고 400 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 펠릿을 50-300 μL의 희석되지 않은 차가운 기저막 매트릭스에 재현탁하고 기포가 형성되지 않도록 조심스럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
참고: 추가된 기저막 매트릭스의 부피는 펠릿 크기에 따라 다릅니다. 확실하지 않은 경우 재현탁 펠릿에서 ~10μL의 작은 돔을 플레이트하고 현미경으로 합류도를 관찰합니다. 필요한 경우 기저막 매트릭스를 더 추가하여 조정합니다. 참조 시딩 밀도는 그림 3 (1일차 이미지)을 참조하십시오. - 오가노이드를 함유한 기저막 매트릭스 돔 300μL를 미리 예열되고 표지된 6웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 플레이트합니다. 표 3 을 참조하여 권장되는 기저막 매트릭스와 다른 플레이트를 사용하는 경우 중간 부피를 확인하십시오.
플레이트 당 우물 수 돔당 기저막 매트릭스(μL) 웰당 배지(μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (돔 대신 서스펜션) 100
표 3: 플레이트 크기에 기초하여 웰당 권장되는 기저막 매트릭스 및 성장 배지의 양. - 플레이트를 후드에 5분 동안 그대로 둔 다음 기저막 매트릭스 돔이 완전히 굳을 때까지 37°C의 인큐베이터에 20-30분 동안 조심스럽게 놓습니다.
- 예열된 완전 배지 3 mL를 6-웰 플레이트의 각 웰에 적가하고 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣는다. 도립 명시야 현미경에서 5x 대물렌즈를 사용하여 오가노이드의 이미지를 촬영합니다.
- 오가노이드의 성장에 따라 4-8일마다 배지를 보충하십시오. 돔을 방해하지 않고 오래된 매체를 조심스럽게 흡인하고 신선하고 예열 된 매체를 한 방울 씩 추가합니다.
참고: 프로토콜은 절제된 종양에서 파생된 유방암 오가노이드와 절제된 건강한 유방 조직(동일한 환자의 인접 및 정상 유방 조직 또는 축소 유방 성형술에서 얻은 건강한 유방 조직)에서 파생된 정상 오가노이드에 대해 동일합니다.
3. 배양에서 환자 유래 유방 오가노이드의 계대 및 확장
- 기저막 매트릭스 한 병을 얼음 위에서 또는 4°C에서 밤새 해동합니다.
- 세포 스크레이퍼 또는 1 mL 피펫 팁을 사용하여 웰 내의 배지 내로 기저막 매트릭스 돔을 들어 올립니다.
- 피펫 팁을 0.5% BSA 용액으로 미리 코팅한 다음 수확되는 웰 수에 따라 배지가 있는 오가노이드의 플로팅 돔을 15mL 또는 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 300 μL의 기저막 매트릭스 돔을 포함하는 2개 이상의 웰의 경우 50 mL 원뿔형 튜브를 사용하십시오. 1x DPBS를 추가하여 부피를 최소 5mL로 늘립니다.
- 튜브를 400 x g 에서 5분 동안 돌립니다. 오가노이드가 있는 기저막 매트릭스는 바닥에 층을 형성합니다. 상층액을 제거하기 위해 조심스럽게 흡인합니다.
- 튜브에 풀링된 웰 수에 따라 5-20mL의 1x DPBS를 추가합니다. 멸균 일회용 피펫을 0.5% BSA로 미리 코팅하고 오가노이드-기저막 매트릭스 펠릿을 DPBS에 위아래로 피펫팅하여 균일하게 혼합합니다.
- 튜브를 400 x g 에서 5분 동안 돌립니다. 상청액을 조심스럽게 흡인하고 버립니다.
- 세포 해리 시약을 기저막 매트릭스 부피의 3배로 튜브에 추가합니다. 0.5% BSA 코팅 피펫 팁을 사용하여 세포 해리 시약에 오가노이드를 재현탁합니다.
- 튜브를 37°C에서 140rpm으로 8-15분 동안 비스듬한 위치로 궤도 셰이커에 놓습니다. 오가노이드가 더 작은 클러스터로 분해되는지 확인하기 위해 5분마다 현미경으로 튜브를 관찰하여 모니터링합니다.
- 세포 해리 시약과 같거나 더 큰 부피의 기본 배지(즉, Ad-DF+++)를 추가하고 피펫으로 오가노이드를 혼합합니다. RT에서 400 x g 에서 5분 동안 회전하여 오가노이드 펠릿을 얻습니다.
- 펠릿에 용해되지 않은 기저막 매트릭스 내에 여전히 내장된 오가노이드가 포함되어 있는 경우 3.7-3.9단계를 반복하여 추가로 5-8분의 트립신 처리를 합니다.
- 용해되지 않은 기저막 매트릭스가 없는 흰색 오가노이드 펠릿이 얻어지면 상층액을 버리고 Ad-DF+++ 1mL를 추가하여 피펫팅으로 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 Ad-DF+++를 최대 10mL까지 추가합니다.
- 세척 단계를 위해 RT에서 400 x g 에서 5분 동안 회전합니다. 상층액을 흡인하고 버립니다.
- 적절한 분할 비율에 따라 소화된 오가노이드에 필요한 양의 기저막 매트릭스를 추가합니다(이는 성장률에 따라 각 오가노이드 라인에 따라 크게 다름). 그림 3 (Day 1 이미지)의 예를 참조하십시오.amp파종 밀도의 le. 거품이 생기지 않도록 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 즉시 얼음 위에 놓으십시오.
- 예열된 6웰 플레이트를 열고 라벨을 붙입니다. 현미경으로 밀도를 관찰하기 위해 웰 모서리에 10-20 μL 돔을 플레이트하는 것이 좋습니다. 오가노이드가 합류하면 분할 비율을 높이기 위해 더 많은 기저막 매트릭스를 추가할 수 있습니다.
- 플레이트 300 μL 돔의 오가노이드를 기저막 매트릭스에 재현탁합니다. 기저막 매트릭스가 용액에 남아 있도록 여러 개의 웰을 도금하는 동안 튜브를 얼음 위에 유지하십시오.
- 플레이트를 후드에 방해하지 않고 5분 동안 그대로 둔 다음 돔을 방해하지 않고 5%CO2 가 있는 37°C 인큐베이터에 조심스럽게 놓습니다.
- 20-30 분 후에 돔이 굳어집니다. 3 mL의 예열된 완전 배지를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣는다. 5-7 일마다 신선한 완전한 배지를 추가하십시오. 마이코플라스마 오염을 검출하기 위해 배양에 대한 일상적인 테스트를 수행합니다.
참고: 유방 종양 및 정상 오가노이드의 배양을 위한 프로토콜은 동일합니다. 그러나 우리의 경험에 따르면 정상적인 오가노이드는 속도가 느려지기 전에 계대 6-8까지 잘 자라는 경향이 있습니다. 향후 연구를 위해 가능한 한 많은 초기 통과 주식을 만드는 것이 좋습니다.
4. 환자 유래 유방 오가노이드 동결
- 오가노이드의 합류 웰을 통과시켜 단계 3.1-3.12에 명시된 바와 같이 기저막 매트릭스를 제거합니다.
- 계대배양 전에 기저막 매트릭스 부피 200-300μL당 배지 1mL를 사용하여 세포 동결 배지(4ºC에서 밤새 해동)에 오가노이드 펠릿을 재현탁합니다. 참조를 위해 동결하기 전에 셀 카운트를 수행하십시오. 필요한 경우 추가 트립신 처리를 거친 소량(최소 100μL)의 세포를 분취하여 단일 세포를 얻은 다음 세포 계수기를 사용하여 계수합니다.
- 1mL의 세포를 오가노이드 라인 번호, 날짜 및 통로 번호로 표지된 2mL 극저온 아기에 옮깁니다. 튜브에 영구 마커로 라벨을 붙이거나 냉동 라벨을 사용하십시오.
- 바이알을 세포 냉동 용기로 옮기고 용기를 -80°C 냉동고로 옮깁니다. 밤새 배양한 후 바이알을 장기 보관을 위해 액체 질소 저장 냉동고로 이동할 준비가 되었습니다.
5. 환자 유래 유방 오가노이드 해동
- 기저막 매트릭스 한 병을 얼음 위에서 또는 4°C에서 밤새 해동합니다. Ad-DF++++ 배지를 37°C에서 예열합니다. 각 냉동 바이알에 대해 9mL의 예열 배지를 15mL 원뿔형 튜브에 분취합니다.
- 오가노이드의 냉동 바이알을 37°C 비드 배스에 넣어 빠르게 해동합니다. 70% 에탄올을 뿌리고 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
- 오가노이드 손실을 방지하기 위해 피펫 팁을 0.5% BSA 용액으로 헹굽니다. 해동된 오가노이드를 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하여 튜브에 침전된 오가노이드를 혼합합니다.
- 냉동 오가노이드 1mL를 예열된 Ad-DF+++ 9mL에 적가하여 부드럽게 옮깁니다. 세포를 400 x g 에서 5분 동안 회전시킨 다음 상층액을 조심스럽게 버립니다.
- 오가노이드 펠릿에 미리 데워진 신선한 Ad-DF+++ 10mL를 추가하여 펠릿을 세척하고 0.5% BSA로 미리 코팅된 피펫과 부드럽게 혼합하여 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 400 x g 에서 5분 동안 회전시키고 상층액을 조심스럽게 버립니다.
- 오가노이드 펠릿을 얼음 위에 놓고 더 작은 부피의 피펫 팁을 사용하여 잔여 Ad-DF+++를 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 300μL의 기저막 매트릭스에 재현탁하고 미리 예열된 6웰 플레이트에 플레이트를 재현탁합니다. 플레이트를 5%CO2가 있는 37°C 인큐베이터에 놓습니다.
알림: 현미경으로 합류성을 식별하기 위해 웰 모서리에 있는 재현탁 펠릿에서 작은 10μL 돔을 도금하는 것이 좋습니다. 오가노이드가 합류하는 것처럼 보이면 300μL의 기저막 매트릭스를 플레이트에 추가하여 6웰 플레이트의 두 웰에 희석합니다. - 20-30분 배양 후 예열된 완전 배지 3mL를 응고된 돔에 추가합니다.
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Representative Results
우리는 다양한 아형11을 포함하는 환자 유래 유방 종양 오가노이드의 바이오뱅크를 설립했습니다. 또한, 우리는 그림 1에 설명된 접근 방식을 사용하여 축소성 유방 성형술 조직 샘플 또는 BC 환자의 인접/원위 정상 유방에서 파생된 여러 정상 유방 오가노이드 라인을 확립했습니다.
다양한 환자 유래 유방 종양 오가노이드 계통은 형태(그림 2)와 성장 속도(그림 3)가 다릅니다. 정상 유방 오가노이드와 우리가 확립한 몇 안 되는 초기 유관 상피내암종(DCIS) 유래 오가노이드는 관 세포로 둘러싸인 중앙 내강이 있는 정상 유방 구조와 유사합니다(그림 2A, B). 침윤성 소엽암(그림 2C)에서 파생된 오가노이드는 이전에 다른 실험실에서 보고된 바와 같이 느슨하게 부착된 포도송이와 같은 구조를 형성하는 경향이 있습니다36,43. 한편, 침윤성 유관 암종(호르몬 수용체 양성 및 삼중 음성 유방암)에서 유래한 오가노이드는 조밀하고 크고 둥근 오가노이드를 형성하는 경향이 있습니다(그림 2D, E). 오가노이드는 4% 파라포름알데히드로 고정된 후 2% 아가로스 주형에 매립되었습니다. 그런 다음 파라핀을 매립하고 10μm 절편을 헤마톡실린 및 에오신(Bhatia et al.11에 기재된 바와 같이)으로 염색하여 형태를 관찰했습니다.
서로 다른 환자 유래 유방 종양 오가노이드 라인의 성장 속도의 차이를 입증하기 위해 1,000개의 생존 가능한 단일 세포를 96웰 플레이트당 10% 기저막 매트릭스 현탁액 용액에 도말하고, 각각 6번의 복제를 통해 서로 다른 시점에서 세포 생존율을 결정하여 12일 동안 성장을 모니터링했습니다(그림 3B ). 오가노이드 형성은 3일, 6일, 9일 및 12일에 발광 세포 생존율 분석을 사용하여 측정되었으며, 도금 후 1일에 기준선 판독값이 있습니다. 그림 3A 는 시간 경과에 따라 6웰 플레이트에서 확장된 동일한 오가노이드의 명시야 이미지를 보여줍니다. 일부 환자 유래 오가노이드 라인은 배가 시간이 2일인 반면 일부는 5일이 걸립니다(그림 3B).
그림 1: 환자 유래 유방 오가노이드 설정. (A) 환자 유래 유방 종양 또는 정상 오가노이드를 확립하는 주요 단계의 개략도. (B) DS117T 환자 유래 유방 종양 오가노이드의 확립(계대 0)부터 장기 배양(계대 12)까지의 성장을 보여주는 대표 이미지. 파란색 화살표 = 섬유질 물질, 노란색 화살표 = 파편/죽은 세포, 빨간색 화살표 = 미세 환경(주로 섬유아세포)의 지지 세포 유형. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다양한 아형을 나타내는 환자 유래 유방 오가노이드. 상단 패널: 다양한 조직병리학적 및 분자 아형의 환자 유방 종양(B-E)에서 파생된 오가노이드 라인 간의 형태학적 차이. (A) 그림은 축소 유방 성형술 후 얻은 정상 인간 유방 조직에서 유래한 오가노이드를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 하단 패널: 동일한 오가노이드 라인의 H&E 염색 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 약어: TNBC = 삼중 음성 유방암. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다양한 환자 유래 유방 종양 오가노이드의 배양 성장. 12일 동안 상이한 환자 유래 유방 종양 오가노이드 라인의 배양물에서의 성장을 보여주는 발광 세포 생존율 분석을 통해 측정한 대표적인 명시야 이미지 및 세포 생존율 곡선(A 및 B). 스케일 바 = 50 μm. 오차 막대는 n = 6에 대한 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리 연구실은 위의 프로토콜을 성공적으로 사용하여 순진한 종양 절제술 또는 긁힌 자국에서 오가노이드를 확립했습니다. 우리는 또한 이 프로토콜을 활용하여 환원성 유방 성형술을 통해 얻은 유방 조직 또는 암 환자의 인접 또는 원위 정상 유방 조직에서 정상 오가노이드를 개발했습니다. 절제된 원발성 종양의 약 30%-40%가 성공적인 장기(>계대 8) 종양 오가노이드 배양을 초래했습니다. 몇 번의 계대 후에 가늘어지는 종양 오가노이드 라인은 정상 오가노이드 또는 기질 세포의 성장이 있었거나 주로 비증식성 종양 세포로 구성되었습니다. 현재 상피 세포 성장을 선호하는 배지 성분 또는 종양 세포 집단을 사전 선택하는 다른 수단의 추가 평가 및 변형은 PDO의 확립 및 장기 배양에 대한 성공률을 향상시켜야 합니다. 또한, 성공적으로 확장된 오가노이드의 여러 바이알을 동결하고 확립된 각 오가노이드 라인에 대해 냉동 바이알에 대한 해동 테스트를 수행하여 배양에서 장기적인 성공을 인증하는 것이 좋습니다.
배양에서 때때로 속도가 느려지거나 해동에서 회복하기 위해 고군분투하는 일부 성공적인 오가노이드 라인은 종종 파종 밀도를 증가시키는 이점을 얻습니다. 더 높은 밀도는 아마도 세포-세포 상호 작용 또는 분비 인자의 결과로 대부분의 라인에서 더 빠른 성장을 자극하는 데 도움이 되는 것으로 관찰됩니다. 또한 70-100μm 필터를 통해 오가노이드(트립신 처리 후)를 여과하면 일부 오가노이드 라인을 해동한 후 때때로 나타나고 성장을 방해하는 경향이 있는 죽은 오가노이드에서 축적된 파편을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 일부 건강한 오가노이드 물질도 필터링 과정에서 손실된다는 점에 유의해야 합니다. 에스트로겐 수용체(ER+)를 발현하는 특정 오가노이드 계통은 TNBC에 비해 성장 속도가 느릴 수 있으며 배지에 에스트라디올을 첨가하면 잠재적으로 이점을 얻을 수 있습니다. 확립된 환자 유래 유방 종양 오가노이드 계통은 게놈 및 전사체적으로 특성화할 것을 권장합니다. 이는 환자 종양의 병리학적 및 유전적 특징(에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 인간 표피 성장 인자 2, Cadherin, Ki-67 등의 발현)에 대한 면역조직화학 평가, RNA 시퀀싱, 단일 세포 RNA 시퀀싱, 암 드라이버 유전자에 대한 DNA 시퀀싱, 복제 수 변이 등과 같은 여러 기술을 활용하여 수행할 수 있습니다. 기계론적 및 약물 반응 연구의 경우, 배지의 구성 요소인 특정 억제제와 수술 전에 환자가 받은 이전 치료를 고려해야 합니다.
다른 환자에서 파생된 종양 오가노이드 계통은 게놈 돌연변이, 전사체학, 형태학, 성장률, 큰 오가노이드 형성 능력, 이질적인 세포 집단의 존재 등 다양합니다. 이러한 차이는 오가노이드를 확립하고 배양하는 데 어려움을 겪지만, 오가노이드를 환자 다양성과 종양 복잡성을 모두 나타내는 강력한 모델로 만들기도 합니다. 유방 종양 유래 오가노이드는 게놈, 전사체11,36 및 대사체 수준44에서 원래 환자 종양을 요약하는 것으로 나타났습니다. 이러한 모든 요소는 약물 스크리닝 및 정밀 종양학을 위한 강력한 도구가 됩니다39. 환자 유래 오가노이드는 암 생물학을 연구하고 개인화된 의학 분야를 발전시키기 위한 치료적으로 중요한 질문을 조사하기 위한 3차원 체외 모델 역할을 하는 흥미로운 새로운 모델 시스템입니다. 정상 및 종양 유방 오가노이드는 CRISPR 공학15,38을 통해 유전적으로 변형될 수 있어 종양 형성 및 암 진행에 대한 기계론적 유전 연구에 유리하게 사용됩니다. 환자 유래 유방 종양 오가노이드는 또한 환자의 종양 성장을 잠재적으로 모방할 수 있는 이종이식 모델 11,38,39을 개발하는 데 사용되었습니다. 또한, 환자 유래 유방 종양 오가노이드 공동 배양 시스템은 유방암 세포와 간질 암 관련 섬유아세포, 면역 세포, 지방 세포 등과 같은 다른 세포 간의 누화의 중요성에 대한 강력한 통찰력을 제공할 수 있는 아직 탐구되지 않은 연구 영역으로 남아 있습니다. 종양 진행에서.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업을 진행하는 동안 비판적인 토론을 해주신 스펙터 연구소 구성원들에게 감사의 말씀을 전합니다. Norman Sachs와 Hans Clevers(네덜란드 Hubrecht Institute)가 처음에 오가노이드 배양 프로토콜을 제공한 것에 대해 감사드립니다. 우리는 서비스 및 기술 전문 지식(NCI 2P3OCA45508)에 대해 CSHL 암 센터 조직학 및 현미경 공유 리소스를 인정합니다. 조직학적 샘플 준비에 도움을 주신 Qing Gao 박사에게 감사드립니다. 환자 종양 샘플을 제공한 Karen Kostroff 박사(Northwell Health)의 지원에 감사드립니다. 또한 샘플 수집을 위한 Northwell Health Biobanking 팀의 노력에 감사드리며, 연구를 위해 조직을 기증해 주신 환자와 그 가족에게도 감사드립니다. 이 연구는 CSHL/Northwell Health(D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3(D.L.S.) 및 Leidos Biomedical HHSN26100008(David Tuveson 및 D.L.S)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
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