Summary
En detaljert protokoll er gitt her for å etablere humane brystorganoider fra pasientavledede brysttumorreseksjoner eller normalt brystvev. Protokollen gir omfattende trinnvise instruksjoner for dyrking, frysing og tining av brystorganoider avledet fra mennesker.
Abstract
Brystkreft er en kompleks sykdom som har blitt klassifisert i flere forskjellige histologiske og molekylære subtyper. Pasientavledede brysttumororganoider utviklet i vårt laboratorium består av en blanding av flere tumoravledede cellepopulasjoner, og representerer dermed en bedre tilnærming av tumorcellediversitet og miljø enn de etablerte 2D-kreftcellelinjene. Organoider tjener som en ideell in vitro-modell , noe som muliggjør celle-ekstracellulære matriseinteraksjoner, kjent for å spille en viktig rolle i celle-celle-interaksjoner og kreftprogresjon. Pasientavledede organoider har også fordeler i forhold til musemodeller, da de er av menneskelig opprinnelse. Videre har de vist seg å rekapitulere den genomiske, transkriptomiske og metabolske heterogeniteten til pasienttumorer; Dermed er de i stand til å representere tumorkompleksitet så vel som pasientdiversitet. Som et resultat er de klare til å gi mer nøyaktig innsikt i måloppdagelse og validering og legemiddelfølsomhetsanalyser. I denne protokollen gir vi en detaljert demonstrasjon av hvordan pasientavledede brystorganoider etableres fra resekterte brysttumorer (kreftorganoider) eller reduktivt mammoplastikk-avledet brystvev (normale organoider). Dette etterfølges av en omfattende redegjørelse for 3D-organoidkultur, ekspansjon, passasje, frysing, samt tining av pasientavledede brystorganoidkulturer.
Introduction
Brystkreft (BC) er den hyppigst forekommende maligniteten hos kvinner, med 287 850 nye tilfeller anslått å bli diagnostisert i USA i 20221. Til tross for de siste fremskrittene i tidlig deteksjon med årlige screeninger, målrettede terapier og en bedre forståelse av genetisk predisposisjon, hersker det å være den nest største årsaken til kreftdødsfall hos kvinner i USA, med > 40.000 dødsfall som tilskrives brystkreft årlig1. Brystkreft er for tiden klassifisert i flere subtyper basert på histopatologisk og molekylær evaluering av primærtumor. Bedre subtypestratifisering har forbedret pasientresultatene med subtypespesifikke behandlingsalternativer2. For eksempel har identifiseringen av HER2 som et proto-onkogen3 ført til utviklingen av trastuzumab, noe som har gjort denne svært aggressive subtypen håndterbar hos de fleste pasienter4. Videre forskning på genetikk og transkriptomikk av denne komplekse sykdommen på en pasientspesifikk måte vil hjelpe til med å utvikle og forutsi bedre pasientspesifikke personlige behandlingsregimer 2,5. Pasientavledede organoider (PUD) er en lovende ny modell for å få innsikt i kreft på molekylært nivå, identifisere nye mål eller biomarkører og designe nye behandlingsstrategier 6,7,8.
PUD er flercellede, tredimensjonale (3D) strukturer avledet fra ferske resekterte primære vevsprøver 8,9. De dyrkes tredimensjonalt ved å være innebygd i en hydrogelmatrise, vanligvis sammensatt av en kombinasjon av ekstracellulære matriksproteiner (ECM), og kan derfor brukes til å studere tumorcelle-ECM-interaksjoner. PUD representerer pasientmangfold og rekapitulerer cellulær heterogenitet og genetiske trekk ved svulsten10,11,12. Å være in vitro-modeller, tillater de genetisk manipulering og narkotikaskjermer med høy gjennomstrømning13,14,15. Videre kan PUD plausibelt brukes til å evaluere pasientens legemiddelfølsomhet og behandlingsstrategier parallelt med klinikken og bidra til å forutsi pasientutfall16,17,18. I tillegg til kjemoterapi har visse organoidmodeller også blitt brukt til å undersøke individuelle pasientresponser på kjemostråling 19,20. Gitt den lovende anvendeligheten av PUD for forskning og klinisk bruk, har National Cancer Institute initiert et internasjonalt konsortium, The Human Cancer Models Initiative (HCMI) 21, for å generere og gi disse tumoravledede nye kreftmodellene. Mange av organoidmodellene av ulike krefttyper utviklet gjennom HCMI er tilgjengelige via American Type Culture Collection (ATCC)22.
Normale brystorganoider har vist seg å bestå av forskjellige epitelcellepopulasjoner tilstede i brystkjertelen 11,23 og tjener dermed som gode modeller for å studere grunnleggende biologiske prosesser, for å analysere drivermutasjoner som forårsaker tumorigenese, og for kreftcelle-avstamningsstudier 6,15 . Brysttumororganoidmodeller har blitt brukt til å identifisere nye mål som er oppmuntrende utsikter for å utvikle nye terapier, spesielt for resistente svulster24,25,26. Ved å bruke pasientavledet xenograft (PDX) og matchede PDX-avledede organoide (PDxO) modeller av behandlingsresistente brysttumorer, viste Guillen et al. at organoider er kraftige modeller for presisjonsmedisin, som kan utnyttes til å evaluere legemiddelrespons og direkte terapibeslutninger parallelt28. Videre gir utviklingen av nye samkulturmetoder for dyrking av PUD med forskjellige immunceller27,28,29, fibroblaster 30,31 og mikrober 32,33 en mulighet til å studere virkningen av tumormikromiljøet på kreftprogresjon. Mens mange slike samkulturmetoder etableres aktivt for PUD avledet fra bukspyttkjertel- eller kolorektaltumorer, har lignende etablerte samkulturmetoder for bryst-PUD bare blitt rapportert for naturlige drepeceller34 og fibroblaster35.
Den første biobanken med >100 pasientavledede organoider som representerer forskjellige brystkreftsubtyper ble utviklet av Hans Clevers-gruppen36,37. Som en del av denne innsatsen utviklet Clevers-gruppen også det første komplekse kulturmediet for brystorganoidvekst, som for tiden er mye brukt36. En oppfølgingsstudie ga en omfattende redegjørelse for etablering og kultur av PUD for bryster og pasientavledede organoide xenotransplantater (PDOXs)38. Welm-laboratoriet utviklet en stor samling av BC PDX-modeller og PDxOs som dyrkes i et relativt enklere vekstmedium som inneholder føtalt bovint serum (FBS) og færre vekstfaktorer39,40. Vi har uavhengig utviklet og karakterisert et stort utvalg naive pasientavledede brystkreftorganoidmodeller11, og deltatt i utviklingen av BC PUD-modeller som en del av HCMI initiativ21. Her tar vi sikte på å gi en praktisk veiledning som beskriver metodikken som brukes av oss for å generere pasientavledede brystorganoidmodellsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumorreseksjoner fra brystkreftpasienter, sammen med distalt og tilstøtende normalvev, ble innhentet fra Northwell Health i henhold til Institutional Review Board-protokollene IRB-03-012 og IRB 20-0150, og med skriftlig informert samtykke fra pasientene.
MERK: Alle prosedyrer nevnt nedenfor ble utført i et BSL2-rom for vevskultur av pattedyr beregnet for pasientprøver etter godkjenning av biosikkerhetskomiteen. Alle prosedyrer skal utføres i henhold til sikkerhetsprotokoller som opprettholder aseptiske forhold i biosikkerhetsskap. Hvert sentrifugeringstrinn utføres ved romtemperatur (RT) med mindre annet er angitt. Vev/organoider og matrikslagre i kjellermembran legges alltid på is med mindre annet er oppgitt. Nye plater inkuberes over natten for forvarming. Plettering kupler på forvarmede plater sikrer de beste resultatene for å oppnå avrundede kupler som ikke flater ut mens plating eller løfter av senere fra plateoverflaten.
1. Middels forberedelse og oppskrifter
- Klargjør R-spondin1-betingede medier som beskrevet nedenfor (kan alternativt kjøpes kommersielt).
- Forbered to separate voksende medier sammensatt av Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM), 10% FBS, 5% penicillin-streptomycin, og med eller uten 300 μg / ml zeocintilskudd.
- Tine et hetteglass med HEK293T-HA-Rspondin1-Fc-celler (hentet fra Calvin Kuos laboratorium ved Stanford University og også kommersielt tilgjengelig) i en 75 cm2 vevskulturkolbe med 15 ml medium.
- Del cellene i 2 x 175 cm2 kulturflasker, hver med 35 ml medium som inneholder zeocin.
- Pass cellene igjen for å få så mange kolber som nødvendig for å generere ønsket batch av R-spondin1 betinget medium. Bruk vekstmedium uten zeocin.
- Når kolbene som inneholder medium uten zeocin er sammenflytende, fjern og erstatt vekstmediet med Ad-DF+++ (trinn 1.2; Tabell 1). Plasser cellene i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 1 uke.
- Spinn ned mediet ved 400 x g i 5 minutter for å fjerne celler som ikke er festet. Filtrer mediet gjennom et 0,22 μm filter. Lag 25 ml alikoter og oppbevar dem ved -20 °C (kan oppbevares i opptil 6 måneder).
- Bruk HEK293T-celler, utfør en dual luciferase TOPFLASH41,42-analyse ved bruk av et kommersielt DNA-transfeksjonsreagens ved et 4.8: 1-reagens til DNA-forhold med fortynningsmiddelet DMEM (høy glukose, pyruvat). Tilsett 100 μL R-spondin1 betinget medium (eller basalmedium for negativ kontroll) til 100 μL transfekterte celler. Deretter utfører du dual luciferase-analysen i henhold til produsentens protokoll for å verifisere Wnt-aktiviteten til det R-spondin1-betingede mediet.
MERK: Analysen bruker et TOP-plasmid med Firefly luciferase-aktivitetsavlesning, og FOP-plasmidet brukes som en negativ kontroll.
- Forbered basalmedium (Ad-DF+++ medium, som tidligere publisert av Sachs et al.36).
Reagent Konsentrasjon av aksjer Endelig konsentrasjon Avansert DMEM/F12 1x 1x GlutaMax 100x 1x HEPES 1 M 10 mM Penicillin-Streptomycin 10 000 U/ml; 10 000 μg/ml 100 U / ml; 100 μg/ml
Tabell 1: Basal Ad-DF+++ medium sammensetning. - Forbered komplett medium for pasientavledede brystorganoider som tidligere publisert av Sachs et al.36.
Reagent Konsentrasjon av aksjer Endelig konsentrasjon Ad-DF+++ medium 1x 1x R-spondin internt 100% 10% B-27 supplement 50x 1x Nikotinamid 1 M 5 mM NAC 500 mM 1,25 mM Primocin 50 mg/ml 50 μg/ml Noggin 100 μg/ml 100 ng/ml Menneskelig EGF 5 mikrogram/ml 5 ng/ml Menneskelig Heregulin β1/Neuregulin1 75 mikrogram/ml 37,5 ng/ml Y-27632 Dihydroklorid (Rho-kinase) 100 mM 5 μM A83-01 5 mM 500 nM Menneskelig FGF-7 100 μg/ml 5 ng/ml Menneskelig FGF-10 1 mg/ml 20 ng/ml P38i 30 mM 498 nM
Tabell 2: Komplett mediumsammensetning for pasientavledede brystorganoider. - Klargjør 2 mg / ml kollagenase IV-oppløsning ved å veie den nødvendige mengden kollagenase IV-pulver og oppløseliggjøre det i Ad-DF +++ basalmedium. Filtrer gjennom et 0,22 μm filter før bruk.
- Lag 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) oppløsning fra 7,5 % stamløsning ved bruk av 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) som fortynningsmiddel. Filtrer gjennom et 0,22 μm filter før bruk.
2. Etablering av brysttumor/normale organoider fra resektvev (figur 1)
- Transporter en kirurgisk resektert brysttumor / normal vevsprøve til laboratoriet i et 50 ml konisk rør inneholdende Ad-DF +++. Oppbevar tuben på is til isolasjonen starter.
- Tine en flaske membranmatrise i kjelleren på is eller over natten ved 4 °C.
- Overfør resektert vev til en 10 cm steril petriskål. Undersøk vevet makroskopisk og noter om det virker morfologisk fett, vaskularisert eller nekrotisk. I tillegg registrerer du størrelsen og formen på vevet. Ta gjerne et bilde av vevet med en linjal i sikte (figur 2).
- Hakk vevet i svært små biter (~1 mm3) med en steril skalpell nr. 10, og overfør det til et 50 ml konisk rør.
- Tilsett 10 ml 2 mg/ml kollagenase IV-oppløsning og forsegl røret med en gjennomsiktig film. Plasser røret på en orbital shaker ved 37 ° C ved 140 o / min i 30-90 minutter i en vinklet stilling (~ 30 ° vinkel).
- Under inkubasjonen, legg en aliquot av komplett medium for å forvarme i et 37 ° C perle / vannbad.
- Hvert 15. minutt resuspenderes vevet ved å blande kraftig opp og ned med en 5 ml steril serologisk pipette. Belegg pipetten på forhånd med 0,5 % BSA-oppløsning for å forhindre vevstap forårsaket av at prøven fester seg til pipetten. Overvåk dissosiasjon over tid ved å observere det koniske røret under mikroskopet ved en 5x eller høyere forstørrelse.
- Når vevet er dissosiert, sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter. Aspirer supernatanten, tilsett 10 ml Ad-DF+++ og sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter.
- Kast supernatanten forsiktig. Vevpellets kan av og til være løse, så vær forsiktig når du aspirerer. Gjenta trinnet en gang til.
- Hvis vevspelleten er delvis rød, tilsett 2 ml lysisbuffer for røde blodlegemer og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Ikke inkuber lenger, da dette vil redusere cellens levedyktighet betydelig.
- Tilsett 10 ml Ad-DF+++ til røret, sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter, og kast supernatanten. Resuspender pelleten i 50-300 μL ufortynnet, kald kjellermembranmatrise og bland forsiktig ved å pipetere forsiktig for å unngå å danne bobler.
NOTAT: Volumet av tilsatt kjellermembranmatrise avhenger av pelletsstørrelsen. Hvis du er usikker, plate en liten kuppel på ~ 10 μL fra den resuspenderte pelleten og observer sammenløpet under mikroskopet. Juster ved å legge til mer kjellermembranmatrise om nødvendig. Se figur 3 (bilde fra dag 1) for en referansesåtetthet. - Plate 300 μL av kjellermembranmatrikskuppel som inneholder organoider i hver brønn av en forvarmet, merket, 6-brønns vevskulturplate. Se tabell 3 for anbefalt matrise av kjellermembran og middels volum ved bruk av forskjellige plater.
Antall brønner per plate Kjellermembranmatrise per kuppel (μL) Middels per brønn (μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (oppheng i stedet for kuppel) 100
Tabell 3: Mengde kjellermembranmatrise og vekstmedium anbefalt per brønn basert på platestørrelse. - La platen stå uforstyrret i hetten i 5 min og legg den forsiktig i inkubatoren ved 37 °C i 20-30 minutter for at kjellermembranmatrikskuppelen skal stivne helt.
- Tilsett 3 ml forvarmet komplett medium dråpevis til hver brønn på en 6-brønnsplate og sett i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2. Ta bilder av organoidene ved hjelp av et 5x objektiv på et omvendt lysfeltmikroskop.
- Replenish mediet hver 4-8 dager basert på veksten av organoider. Aspirer det gamle mediet forsiktig uten å forstyrre kuppelen, og tilsett friskt, forvarmet medium dråpevis.
MERK: Protokollen er den samme for å etablere brystkreftorganoider avledet fra resektert tumor og for normale organoider avledet fra resektert sunt brystvev (enten fra tilstøtende og normalt brystvev av samme pasient eller sunt brystvev oppnådd fra en reduktiv mammoplastikkkirurgi).
3. Passering og utvidelse av pasientavledede brystorganoider i kultur
- Tine en flaske membranmatrise i kjelleren på is eller over natten ved 4 °C.
- Løft kjellermembranmatrikskuppelen inn i mediet i brønnen ved hjelp av en celleskrape eller en 1 ml pipettespiss.
- Forbelegg pipettespissen med 0,5 % BSA-løsning og overfør deretter den flytende kuppelen på organoidene med medium til et konisk rør på 15 ml eller 50 ml, avhengig av antall brønner som høstes. For mer enn to brønner som inneholder 300 μL kjellermembranmatrikskupler, bruk et 50 ml konisk rør. Legg til 1x DPBS for å øke volumet til minst 5 ml.
- Spinn rørene på 400 x g i 5 minutter. Kjellermembranmatrisen med organoider danner et lag nederst. Aspirer forsiktig for å fjerne supernatanten.
- Tilsett 5-20 ml 1x DPBS, avhengig av antall brønner samlet i et rør. Forbelegg en steril engangspipette med 0,5 % BSA og bland matrikspelleten for organoid-kjellermembran i DPBS jevnt ved å pipettere opp og ned.
- Spinn rørene på 400 x g i 5 minutter. Aspirer forsiktig og kast supernatanten.
- Legg til celledissosiasjonsreagens ved tre ganger volumet av kjellermembranmatrisen til røret. Bruk en 0,5 % BSA-belagt pipettespiss til å resuspendere organoidene i celledissosiasjonsreagenset.
- Plasser røret på en orbital shaker ved 37 ° C ved 140 o / min i 8-15 minutter i en vinklet stilling. Overvåk røret ved å observere det under mikroskopet hvert 5. minutt for å sikre at organoidene brytes ned i mindre klynger.
- Tilsett basalmedium (dvs. Ad-DF+++) ved et volum som er lik eller større enn celledissosiasjonsreagenset, og pipette for å blande organoidene. Spinn ved 400 x g i 5 minutter ved RT for å oppnå en organoid pellet.
- Hvis pelleten inneholder organoider som fortsatt er innebygd i den uoppløste kjellermembranmatrisen, gjenta trinn 3.7-3.9 i ytterligere 5-8 minutter trypsinisering.
- Når en hvit organoid pellet uten uoppløst kjellermembranmatrise er oppnådd, kast supernatanten og tilsett 1 ml Ad-DF +++ for å resuspendere pelleten ved pipettering. Legg deretter til mer Ad-DF+++ opptil 10 ml.
- Spinn på 400 x g i 5 min ved RT for vasketrinnet. Aspirer og kast supernatanten.
- Legg til den nødvendige mengden kjellermembranmatrise til de fordøyde organoider basert på riktig delingsforhold (dette vil variere mye for hver organoidlinje basert på veksthastighet). Se figur 3 (bilde fra dag 1) for et eksempel på såtetthet. Bland ved å pipettere forsiktig opp og ned for å unngå å skape bobler. Legg straks på is.
- Åpne og merk en forvarmet 6-brønns plate. Det anbefales å plate en 10-20 μL kuppel i hjørnet av en brønn for å observere sammenløpet under mikroskopet. Hvis organoidene er sammenflytende, kan mer kjellermembranmatrise legges til for å øke delingsforholdet.
- Plate 300 μL kupler av organoider resuspendert i kjellermembranmatrise. Sørg for å holde røret på is mens plating flere brønner slik at kjellermembranmatrisen forblir i løsning.
- La platen stå uforstyrret i hetten i 5 minutter og legg den forsiktig i en 37 °C kuvøse med 5% CO2 uten å forstyrre kuplene.
- Etter 20-30 min stivner kuplene. Tilsett 3 ml forvarmet komplett medium til hver brønn og legg platen tilbake i inkubatoren. Tilsett ferskt komplett medium hver 5-7 dag. Utfør rutinemessig testing av kulturer for påvisning av mykoplasmaforurensning.
MERK: Protokollen for kulturen av brysttumorer og normale organoider er den samme. Vår erfaring er imidlertid at normale organoider har en tendens til å vokse godt frem til passasje 6-8 før de bremser ned. Det er tilrådelig å lage så mange tidlige passasjebestander som mulig for fremtidig forskning.
4. Frysing av pasientavledede brystorganoider
- Passasje sammenflytende brønner av organoider for å fjerne enhver kjellermembranmatrise, som angitt i trinn 3.1-3.12.
- Resuspender pelleten av organoider i cellefrysemedium (tint over natten ved 4 ºC) med 1 ml medium per 200-300 μL kjellermembranmatriksvolum før passering. Utføre en celletelling før frysing for referanse. Aliquot et lite volum (minst 100 μL) av celler for å gjennomgå ytterligere trypsinisering, om nødvendig, for å få enkeltceller, og deretter telle dem ved hjelp av en celle tellermaskin.
- Overfør 1 ml celler til 2 ml kryovialer merket med organoid linjenummer, dato og passasjenummer. Sørg for å merke rørene med en permanent markør eller bruk kryoetiketter.
- Flytt hetteglassene til en cellefrysebeholder og overfør beholderen til en fryser på -80 °C. Etter inkubering over natten er hetteglassene klare til å flyttes til en fryser med flytende nitrogen for langtidslagring.
5. Tining av pasientavledede brystorganoider
- Tine en flaske membranmatrise i kjelleren på is eller over natten ved 4 °C. Forvarm Ad-DF+++ medium ved 37 °C. Aliquot 9 ml forvarmet medium til 15 ml koniske rør for hvert frosne hetteglass.
- Tine det frosne hetteglasset med organoider raskt ved å plassere det i et perlebad på 37 °C. Spray 70% etanol og overfør røret til biosikkerhetsskapet.
- Skyll pipettespissen med 0,5 % BSA-oppløsning for å unngå organoidtap. Bland de tinte organoidene forsiktig ved å pipettere opp og ned for å blande eventuelle sedimenterte organoider i røret.
- Overfør forsiktig 1 ml frosne organoider til 9 ml forvarmet Ad-DF +++ på en dråpevis måte. Spinn cellene ved 400 x g i 5 minutter og kast deretter supernatanten forsiktig.
- Vask pelleten ved å tilsette 10 ml fersk forvarmet Ad-DF +++ til organoidpelleten, og bland forsiktig med en pipette forhåndsbelagt med 0,5% BSA for å resuspendere pelleten. Spinn cellene ved 400 x g i 5 minutter og kast forsiktig supernatanten.
- Legg den organoide pelleten på is og fjern eventuelle rester av Ad-DF+++ forsiktig med en pipettespiss med mindre volum. Resuspender pelleten i 300 μL kjellermembranmatrise og plate i en forvarmet 6-brønnsplate. Plasser platen i en 37 °C inkubator med 5% CO2.
MERK: Det anbefales å plate en liten 10 μL kuppel fra den resuspenderte pelleten i et hjørne av brønnen for å skille sammenløpet under mikroskopet. Hvis organoidene ser sammenflytende ut, fortynnes ved å tilsette 300 μL kjellermembranmatrise til platen i to brønner med en 6-brønnsplate. - Etter en 20-30 min inkubasjon, tilsett 3 ml forvarmet komplett medium til den størknede kuppelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har etablert en biobank av pasientavledede brysttumororganoider med ulike subtyper11. I tillegg har vi etablert multiple normale brystorganoidlinjer avledet fra reduktive vevsprøver fra mammoplastikk eller tilstøtende/distalt normalt bryst fra BC-pasienter ved hjelp av tilnærmingen skissert i figur 1.
De ulike pasientavledede brysttumororganoidlinjene varierer i morfologi (figur 2) og veksthastighet (figur 3). Normale brystorganoider, og de få organoidene vi har etablert fra tidlig duktalt carcinoma in situ (DCIS) vi har etablert, ligner den normale bryststrukturen med et sentralt lumen omgitt av duktale celler (figur 2A,B). Organoider avledet fra et invasivt lobulært karsinom (figur 2C) har en tendens til å danne løst festede druegjenglignende strukturer, som rapportert tidligere av andre laboratorier36,43. I mellomtiden har organoider avledet fra invasive duktale karsinomer (hormonreseptor-positive og trippel negative brystkreft) en tendens til å danne tette, store og runde organoider (figur 2D, E). Organoider ble fiksert med 4% paraformaldehyd etterfulgt av å være innebygd i 2% agaroseformer. De ble deretter parafininnebygd, og 10 μm seksjoner ble farget med hematoksylin og eosin (som beskrevet i Bhatia et al.11) for å observere morfologien.
For å demonstrere forskjellene i veksthastigheten til forskjellige pasientavledede brysttumororganoidlinjer, ble 1000 levedyktige enkeltceller belagt i 10% kjellermembranmatriseopphengsløsning per 96-brønnplate, med seks replikater hver for å bestemme cellelevedyktighet på forskjellige tidspunkter for å overvåke vekst over en periode på 12 dager (figur 3B ). Organoiddannelsen ble målt ved hjelp av en selvlysende cellelevedyktighetsanalyse på dag 3, 6, 9 og 12, med en baselineavlesning på dag 1 etter plating. Figur 3A viser lysfeltbilder av de samme organoidene utvidet i 6-brønnsplater over tid. Noen pasientavledede organoidlinjer har en doblingstid på 2 dager, mens noen tar 5 dager (figur 3B).
Figur 1 Etablering av pasientavledede brystorganoider. (A) Skjematisk fremstilling av de viktigste trinnene i å etablere pasientavledede brysttumorer eller normale organoider. (B) Representative bilder som viser vekst av DS117T pasientderiverte brysttumororganoider fra etablering (passasje 0) til langtidskultur (passasje 12). Blå piler = fibrøst materiale, gule piler = rusk/døde celler, og røde piler = støttende celletyper fra mikromiljøet (hovedsakelig fibroblaster). Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Pasientavledede brystorganoider som representerer ulike subtyper. Øverste panel: morfologiske forskjeller mellom organoide linjer avledet fra pasientens brysttumorer (B-E) av forskjellige histopatologiske og molekylære subtyper. (A) Figuren representerer organoider avledet fra normalt humant brystvev oppnådd etter reduktiv mammoplastikkkirurgi. Skala bar = 50 μm. Bunnpanel: H&E-fargede bilder av de samme organoidlinjene. Skala bar = 100 μm. Forkortelse: TNBC = trippel negativ brystkreft. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Vekst i kultur av ulike pasientavledede brysttumororganoider. Representative lysfeltbilder og cellelevedyktighetskurver (A og B), målt via en selvlysende cellelevedyktighetsanalyse som viser veksten i kultur av forskjellige pasientavledede brysttumororganoidlinjer over 12 dager. Skala bar = 50 μm. Feilfelt representerer SEM for n = 6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt laboratorium har med hell benyttet de ovennevnte protokollene for å etablere organoider fra naive tumorreseksjoner eller skraping. Vi har også benyttet denne protokollen til å utvikle normale organoider fra brystvev oppnådd via reduktive mammoplastikker eller fra kreftpasienters tilstøtende eller distale normale brystvev. Omtrent 30%-40% av de resekterte primære svulstene resulterte i vellykkede langsiktige (>passasje 8) tumororganoidkulturer. De tumororganoide linjene som avtok etter noen få passasjer, hadde enten en utvekst av normale organoider eller stromale celler, eller besto hovedsakelig av ikke-proliferative tumorceller. Videre evaluering og modifisering av mediekomponentene som i dag favoriserer epitelcelleutvekst, eller andre metoder for forhåndsvalg av tumorcellepopulasjoner, bør forbedre suksessraten for etablering og langsiktig kultur av PUD. I tillegg anbefales det sterkt å fryse ned flere hetteglass med vellykket utvidede organoider og utføre tinetester på frosne hetteglass for hver etablerte organoidlinje for å autentisere deres langsiktige suksess i kultur.
Noen vellykkede organoide linjer som til tider bremser i kultur eller sliter med å komme seg etter tining, har ofte nytte av å øke såtettheten. Høyere konfluens observeres å hjelpe til med å stimulere raskere vekst for de fleste linjer, sannsynligvis som et resultat av celle-celle-interaksjoner eller utskilte faktorer. I tillegg kan filtrering av organoider (etter trypsinisering) gjennom et 70-100 μm filter bidra til å fjerne rusk akkumulert fra døde organoider som noen ganger vises etter tining av noen organoide linjer og har en tendens til å hindre veksten. Det må imidlertid bemerkes at noe sunt organoid materiale også går tapt i filtreringsprosessen. Visse organoide linjer som uttrykker østrogenreseptor (ER +) kan være sakte dyrkere sammenlignet med TNBC, og kan potensielt dra nytte av tilsetning av østradiol til mediet. Vi anbefaler at de etablerte pasientavledede brysttumororganoidlinjene karakteriseres genetisk og transkriptomisk. Dette kan gjøres ved å benytte flere teknikker, for eksempel immunhistokjemi evaluering for de patologiske og genetiske egenskapene til pasienttumorer (ekspresjon av østrogenreseptor, progesteronreseptor, human epidermal vekstfaktor 2, Cadherin, Ki-67, etc.), RNA-sekvensering, enkeltcelle RNA-sekvensering, DNA-sekvensering for kreftdrivergener, kopinummervariasjoner, etc. For mekanistiske og legemiddelresponsstudier må man vurdere de spesifikke hemmerne som er komponenter i mediet og eventuelle tidligere behandlinger mottatt av pasienten før kirurgi.
Tumororganoidlinjer avledet fra forskjellige pasienter varierer i genomiske mutasjoner, transkriptomikk, morfologi, veksthastighet, kapasitet til å danne store organoider, tilstedeværelse av heterogene cellepopulasjoner, etc. Disse forskjellene gir utfordringer med å etablere og dyrke dem, men de gjør også organoider robuste modeller som representerer både pasientdiversitet og tumorkompleksitet. Brysttumoravledede organoider har vist seg å rekapitulere de opprinnelige pasienttumorene ved genomiske, transkriptomiske11,36 og metabolomiske nivåer44. Alle disse faktorene gjør dem til kraftige verktøy for narkotikascreening og presisjonsonkologi39. Pasientavledede organoider er et spennende nytt modellsystem som vil fungere som tredimensjonale in vitro-modeller for å studere kreftbiologi, samt undersøke terapeutisk viktige spørsmål for å fremme feltet personlig medisin. Normale og tumorbrystorganoider kan genmodifiseres via CRISPR engineering15,38, noe som fører til gunstig bruk for mekanistiske genetiske studier for tumorigenese og kreftprogresjon. Pasientavledede brysttumororganoider har også blitt brukt til å utvikle xenograftmodeller 11,38,39 som potensielt kan etterligne tumorvekst hos pasienter. Videre forblir pasientavledede brysttumororganoide samkultursystemer et underutforsket forskningsområde som kan gi kraftig innsikt i viktigheten av crosstalk mellom brystkreftceller og andre celler, for eksempel stromalkreftassosierte fibroblaster, immunceller, adipocytter, etc. i tumorprogresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil takke medlemmer av Spector-laboratoriet for kritiske diskusjoner gjennom hele arbeidet. Vi takker Norman Sachs og Hans Clevers (Hubrecht Institute, Nederland) for at de i første omgang ga oss deres organoiddyrkingsprotokoll. Vi anerkjenner CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources for tjenester og teknisk ekspertise (NCI 2P3OCA45508). Vi takker Dr. Qing Gao for hjelp med histologisk prøvepreparering. Vi er takknemlige for støtten fra Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) for å gi pasienttumorprøver. Vi setter også pris på innsatsen til Northwell Health Biobanking-teamet for prøveinnsamling, og vi takker pasientene og deres familier for å donere vev til forskning. Denne forskningen ble støttet av CSHL / Northwell Health (DLS), NCI 5P01CA013106-Project 3 (DLS), og Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson og DLS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
- di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
- Hortobagyi, G. N., et al.
- Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
- Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. Á, Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
- Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
- Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
- Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- HCMI Catalog. , Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022).
- Search ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022).
- Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
- Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
- Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
- Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- HUB Organoids: Patient in the lab. , Available from: https://www.huborganoids.nl (2022).
- Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
- Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
- PDX Portal. , Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022).
- Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
- Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
- Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
- Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).
