Summary
Aquí se proporciona un protocolo detallado para establecer organoides mamarios humanos a partir de resecciones de tumores de mama derivados de pacientes o tejido mamario normal. El protocolo proporciona instrucciones completas paso a paso para el cultivo, la congelación y la descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes humanos.
Abstract
El cáncer de mama es una enfermedad compleja que se ha clasificado en varios subtipos histológicos y moleculares diferentes. Los organoides tumorales de mama derivados de pacientes desarrollados en nuestro laboratorio consisten en una mezcla de múltiples poblaciones de células derivadas de tumores y, por lo tanto, representan una mejor aproximación de la diversidad y el entorno de las células tumorales que las líneas celulares de cáncer 2D establecidas. Los organoides sirven como un modelo ideal in vitro , lo que permite las interacciones célula-matriz extracelular, que se sabe que desempeñan un papel importante en las interacciones célula-célula y la progresión del cáncer. Los organoides derivados de pacientes también tienen ventajas sobre los modelos de ratón, ya que son de origen humano. Además, se ha demostrado que recapitulan la heterogeneidad genómica, transcriptómica y metabólica de los tumores de los pacientes; Por lo tanto, son capaces de representar la complejidad tumoral, así como la diversidad del paciente. Como resultado, están preparados para proporcionar información más precisa sobre el descubrimiento y la validación de objetivos y los ensayos de sensibilidad a los medicamentos. En este protocolo, proporcionamos una demostración detallada de cómo se establecen los organoides mamarios derivados de pacientes a partir de tumores de mama resecados (organoides de cáncer) o tejido mamario derivado de la mamoplastia reductora (organoides normales). Esto es seguido por una descripción completa del cultivo de organoides 3D, expansión, paso, congelación, así como la descongelación de cultivos de organoides mamarios derivados de pacientes.
Introduction
El cáncer de mama (CB) es la neoplasia maligna más común en las mujeres, con 287,850 nuevos casos estimados para ser diagnosticados en los Estados Unidos en 20221. A pesar de los recientes avances en la detección temprana con exámenes anuales, terapias dirigidas y una mejor comprensión de la predisposición genética, prevalece como la segunda causa principal de muertes por cáncer en mujeres en los Estados Unidos, con > 40,000 muertes atribuidas al cáncer de mama anualmente1. El cáncer de mama se clasifica actualmente en múltiples subtipos basados en la evaluación histopatológica y molecular del tumor primario. Una mejor estratificación del subtipo ha mejorado los resultados de los pacientes con opciones de tratamiento específicas del subtipo2. Por ejemplo, la identificación de HER2 como protooncogén3 ha llevado al desarrollo de Trastuzumab, lo que ha hecho que este subtipo altamente agresivo sea manejable en la mayoría de los pacientes4. La investigación adicional sobre la genética y la transcriptómica de esta enfermedad compleja de una manera específica del paciente ayudará a desarrollar y predecir mejores regímenes de tratamiento personalizados específicos para el paciente 2,5. Los organoides derivados de pacientes (DOP) son un nuevo modelo prometedor para obtener información sobre el cáncer a nivel molecular, identificar nuevos objetivos o biomarcadores y diseñar nuevas estrategias de tratamiento 6,7,8.
Las DOP son estructuras multicelulares tridimensionales (3D) derivadas de muestras de tejido primario recién resecadas 8,9. Se cultivan tridimensionalmente al estar incrustados en una matriz de hidrogel, típicamente compuesta de una combinación de proteínas de matriz extracelular (ECM) y, por lo tanto, se pueden usar para estudiar las interacciones entre células tumorales y ECM. Las PDO representan la diversidad del paciente y recapitulan la heterogeneidad celular y las características genéticas del tumor10,11,12. Al ser modelos in vitro, permiten la manipulación genética y el cribado de fármacos de alto rendimiento13,14,15. Además, las PDO se pueden utilizar de manera plausible para evaluar la sensibilidad a los medicamentos y las estrategias de tratamiento del paciente en paralelo a la clínica y ayudar a predecir los resultados de los pacientes16,17,18. Además de la quimioterapia, también se han utilizado ciertos modelos de organoides para examinar las respuestas individuales de los pacientes a la quimiorradiación19,20. Dada la prometedora aplicabilidad de las PDO para la investigación y el uso clínico, el Instituto Nacional del Cáncer ha iniciado un consorcio internacional, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, para generar y proporcionar estos nuevos modelos de cáncer derivados de tumores. Muchos de los modelos organoides de varios tipos de cáncer desarrollados a través del HCMI están disponibles a través de la American Type Culture Collection (ATCC)22.
Se ha demostrado que los organoides normales de mama están compuestos por diferentes poblaciones de células epiteliales presentes en la glándula mamaria 11,23 y, por lo tanto, sirven como excelentes modelos para estudiar procesos biológicos básicos, analizar mutaciones impulsoras que causan tumorigénesis y estudios de linaje de células cancerosas de origen 6,15 . Se han utilizado modelos de organoides tumorales de mama para identificar nuevas dianas que son alentadoras perspectivas para el desarrollo de nuevas terapias, en particular para tumores resistentes24,25,26. Utilizando xenoinjertos derivados del paciente (PDX) y modelos organoides derivados de PDX (PDxO) emparejados de tumores de mama resistentes al tratamiento, Guillén et al. demostraron que los organoides son modelos poderosos para la medicina de precisión, que pueden aprovecharse para evaluar las respuestas a los medicamentos y las decisiones de terapia directa de manera paralela28. Además, el desarrollo de nuevos métodos de cocultivo para el cultivo de PDOs con diversas células inmunes27,28,29, fibroblastos 30,31 y microbios 32,33 presenta una oportunidad para estudiar el impacto del microambiente tumoral en la progresión del cáncer. Si bien muchos de estos métodos de cocultivo se están estableciendo activamente para las PDO derivadas de tumores pancreáticos o colorrectales, solo se han informado métodos similares de cocultivo establecidos para las PDO de mama para las células asesinas naturales34 y los fibroblastos35.
El primer biobanco de >100 organoides derivados de pacientes que representan diferentes subtipos de cáncer de mama fue desarrollado por el grupo Hans Clevers36,37. Como parte de este esfuerzo, el grupo Clevers también desarrolló el primer medio de cultivo complejo para el crecimiento de organoides mamarios, que actualmente es ampliamente utilizado36. Un estudio de seguimiento proporcionó una descripción exhaustiva del establecimiento y cultivo de DOP mamarias y xenoinjertos organoides derivados de pacientes (PDOX)38. El laboratorio de Welm desarrolló una gran colección de modelos BC PDX y PDxOs que se cultivan en un medio de crecimiento comparativamente más simple que contiene suero bovino fetal (FBS) y menos factores de crecimiento39,40. Hemos desarrollado y caracterizado de forma independiente una gran variedad de modelos organoides de cáncer de mama naïve derivados de pacientes11, y hemos participado en el desarrollo de modelos BC PDO como parte de la iniciativa HCMI21. Aquí, nuestro objetivo es proporcionar una guía práctica que detalle la metodología empleada por nosotros en la generación de sistemas de modelos de organoides mamarios derivados de pacientes.
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Protocol
Las resecciones tumorales de pacientes con cáncer de mama, junto con el tejido normal distal y adyacente, se obtuvieron de Northwell Health de acuerdo con los protocolos IRB-03-012 e IRB 20-0150 de la Junta de Revisión Institucional, y con el consentimiento informado por escrito de los pacientes.
NOTA: Todos los procedimientos mencionados a continuación se realizaron en una sala BSL2 de cultivo de tejido de mamíferos designada para muestras de pacientes previa aprobación del comité de bioseguridad. Todos los procedimientos deben realizarse siguiendo protocolos de seguridad manteniendo condiciones asépticas en gabinetes de bioseguridad. Cada paso de centrifugación se realiza a temperatura ambiente (RT) a menos que se indique lo contrario. Los tejidos / organoides y las existencias de la matriz de la membrana basal siempre se colocan en hielo a menos que se indique lo contrario. Las nuevas placas se incuban durante la noche para el precalentamiento. El revestimiento de domos en placas precalentadas garantiza los mejores resultados para obtener domos redondeados que no se aplanan mientras se recubren o se levantan más tarde de la superficie de la placa.
1. Preparación media y recetas
- Prepare los medios acondicionados R-spondin1 como se describe a continuación (alternativamente se pueden comprar comercialmente).
- Prepare dos medios de cultivo separados compuestos por el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 10% FBS, 5% penicilina-estreptomicina y con o sin 300 μg / ml de suplementación con zeocina.
- Descongele un vial de células HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (obtenidas del laboratorio de Calvin Kuo en la Universidad de Stanford y también disponibles comercialmente) en un matraz de cultivo tisular de 75 cm2 con 15 ml de medio.
- Dividir las células en 2 frascos de cultivo de 175 cm2 , cada uno con 35 ml de medio que contenga zeocina.
- Pasar las células de nuevo para obtener tantos matraces como sea necesario para generar el lote deseado de medio acondicionado R-spondin1. Use medio de crecimiento sin zeocina.
- Cuando los matraces que contienen medio sin zeocina sean confluentes, retirar y sustituir el medio de cultivo por Ad-DF+++ (paso 1.2; Tabla 1). Colocar las células en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 durante 1 semana.
- Gire el medio a 400 x g durante 5 minutos para eliminar las células no adheridas. Filtrar el medio a través de un filtro de 0,22 μm. Hacer 25 ml de alícuotas y almacenarlas a -20 °C (se pueden conservar hasta 6 meses).
- Usando células HEK293T, realice un ensayo dual de luciferasa TOPFLASH41,42 utilizando un reactivo de transfección de ADN comercial en una proporción de reactivo a ADN de 4.8: 1 con el diluyente DMEM (glucosa alta, piruvato). Añadir 100 μL de medio condicionado R-spondin1 (o medio basal para el control negativo) a 100 μL de células transfectadas. Luego, realice el ensayo de luciferasa dual según el protocolo del fabricante para verificar la actividad Wnt del medio acondicionado R-spondin1.
NOTA: El ensayo utiliza un plásmido TOP con lectura de actividad luciferasa Firefly, y el plásmido FOP se utiliza como control negativo.
- Preparar medio basal (medio Ad-DF+++, como ya había publicado Sachs et al.36).
Reactivo Concentración de existencias Concentración final DMEM/F12 avanzado 1x 1x GlutaMax 100x 1x HEPES 2 . 10 mM Penicilina-estreptomicina 10.000 U/ml; 10.000 μg/ml 100 U/ml; 100 μg/ml
Tabla 1: Composición basal del medio Ad-DF+++. - Preparar un medio completo para organoides mamarios derivados de pacientes como se publicó anteriormente por Sachs et al.36.
Reactivo Concentración de existencias Concentración final Ad-DF+++ medio 1x 1x R-spondin en casa 100% 10% B-27 suplemento 50x 1x Nicotinamida 2 . 5 mM NAC 500 mM 1,25 mM Primocina 50 mg/ml 50 μg/ml Cabeza 100 μg/ml 100 ng/ml FEAG humano 5 μg/ml 5 ng/ml Heregulin humano β1/Neuregulin1 75 μg/ml 37,5 ng/ml Y-27632 Diclorhidrato (Rho-quinasa) 100 mM 5 μM A83-01 5 mM 500 nM FGF-7 humano 100 μg/ml 5 ng/ml FGF-10 humano 1 mg/ml 20 ng/ml p38i 30 mM 498 nM
Tabla 2: Composición media completa para organoides mamarios derivados de pacientes. - Prepare una solución de 2 mg/ml de colagenasa IV pesando la cantidad requerida de polvo de colagenasa IV y solubilizándola en medio basal Ad-DF+++. Filtrar a través de un filtro de 0,22 μm antes de usarlo.
- Prepare una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% a partir de una solución madre al 7,5% utilizando 1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco como diluyente. Filtrar a través de un filtro de 0,22 μm antes de usarlo.
2. Establecimiento de tumor de mama/organoides normales a partir de tejido resecado (Figura 1)
- Transporte un tumor de mama/muestra de tejido normal resecado quirúrgicamente al laboratorio en un tubo cónico de 50 ml que contiene Ad-DF+++. Guarde el tubo en hielo hasta el inicio del aislamiento.
- Descongele una botella de matriz de membrana basal en hielo o durante la noche a 4 °C.
- Transfiera el tejido resecado a una placa de Petri estéril de 10 cm. Examine el tejido macroscópicamente y tome nota si parece morfológicamente graso, vascularizado o necrótico. Además, registre el tamaño y la forma del tejido. Lo ideal es tomar una fotografía del tejido con una regla a la vista (Figura 2).
- Picar el tejido en trozos muy pequeños (~1 mm3) con un bisturí estéril nº 10 y transferirlo a un tubo cónico de 50 ml.
- Agregue 10 ml de solución IV de 2 mg/ml de colagenasa y selle el tubo con una película transparente. Coloque el tubo en un agitador orbital a 37 °C a 140 rpm durante 30-90 min en una posición angular (ángulo de ~30°).
- Durante la incubación, colocar una alícuota de medio completo a precalentar en un baño de perla/maría a 37 °C.
- Cada 15 min, resuspender el tejido mezclando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica estéril de 5 ml. Cubra previamente la pipeta con una solución de BSA al 0,5% para evitar la pérdida de tejido causada por la picadura de la muestra. Monitoree la disociación a lo largo del tiempo observando el tubo cónico bajo el microscopio a un aumento de 5x o más.
- Una vez disociado el tejido, centrifugar a 400 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante, añadir 10 ml de Ad-DF+++ y centrifugar a 400 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante cuidadosamente. Los gránulos de tejido ocasionalmente pueden estar sueltos, así que tenga cuidado al aspirar. Repita el paso una vez más.
- Si el pellet de tejido está parcialmente rojo, agregue 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. No incubar por más tiempo, ya que esto reducirá significativamente la viabilidad celular.
- Agregue 10 ml de Ad-DF+++ al tubo, centrifugar a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 50-300 μL de matriz de membrana basal fría sin diluir y mezclar pipeteando cuidadosamente para evitar la formación de burbujas.
NOTA: El volumen de la matriz de membrana basal agregada depende del tamaño del pellet. Si no está seguro, coloque una pequeña cúpula de ~ 10 μL del pellet resuspendido y observe la confluencia bajo el microscopio. Ajuste agregando más matriz de membrana basal si es necesario. Consulte la Figura 3 (imagen del día 1) para obtener una densidad de siembra de referencia. - Placa de 300 μL de cúpula de matriz de membrana basal que contiene organoides en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos precalentada, etiquetada. Consulte la Tabla 3 para ver la matriz de membrana basal recomendada y los volúmenes medios si se utilizan placas diferentes.
Número de pocillos por placa Matriz de membrana basal por domo (μL) Medio por pocillo (μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (suspensión en lugar de cúpula) 100
Tabla 3: Cantidad de matriz de membrana basal y medio de crecimiento recomendado por pocillo basado en el tamaño de la placa. - Deje la placa sin perturbaciones en la campana durante 5 minutos y luego colóquela cuidadosamente en la incubadora a 37 °C durante 20-30 minutos para que la cúpula de la matriz de la membrana basal se solidifique completamente.
- Añadir 3 ml de medio completo precalentado gota a gota a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y colocar en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Tome imágenes de los organoides usando un objetivo 5x en un microscopio de campo claro invertido.
- Reponer el medio cada 4-8 días en función del crecimiento de los organoides. Aspire cuidadosamente el medio viejo sin perturbar la cúpula y agregue un medio fresco y precalentado gota.
NOTA: El protocolo es el mismo para establecer organoides de cáncer de mama derivados del tumor resecado y para organoides normales derivados de tejido mamario sano resecado (ya sea de tejido mamario adyacente y normal de la misma paciente o tejido mamario sano obtenido de una cirugía de mamoplastia reductiva).
3. Pasar y expandir los organoides mamarios derivados de pacientes en cultivo
- Descongele una botella de matriz de membrana basal en hielo o durante la noche a 4 °C.
- Levante la cúpula de la matriz de la membrana basal en el medio en el pozo usando un raspador celular o una punta de pipeta de 1 ml.
- Recubra previamente la punta de la pipeta con una solución de BSA al 0,5% y luego transfiera la cúpula flotante de los organoides con un tubo cónico de medio a 15 ml o 50 ml, dependiendo del número de pocillos que se cosechan. Para más de dos pocillos que contienen 300 μL de domos de matriz de membrana basal, use un tubo cónico de 50 ml. Agregue 1x DPBS para aumentar el volumen a al menos 5 ml.
- Girar los tubos a 400 x g durante 5 min. La matriz de la membrana basal con organoides forma una capa en la parte inferior. Aspirar cuidadosamente para eliminar el sobrenadante.
- Agregue 5-20 ml de 1x DPBS, dependiendo de la cantidad de pozos agrupados en un tubo. Cubra previamente una pipeta desechable estéril con BSA al 0,5% y mezcle el pellet de matriz de membrana basal organoide en DPBS uniformemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Girar los tubos a 400 x g durante 5 min. Aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante.
- Agregue reactivo de disociación celular a tres veces el volumen de la matriz de la membrana basal al tubo. Usando una punta de pipeta recubierta con BSA al 0,5%, resuspender los organoides en el reactivo de disociación celular.
- Coloque el tubo en un agitador orbital a 37 °C a 140 rpm durante 8-15 min en posición angulosa. Controle el tubo observándolo bajo el microscopio cada 5 minutos para asegurarse de que los organoides se descompongan en grupos más pequeños.
- Agregue un medio basal (es decir, Ad-DF +++) a un volumen igual o mayor que el reactivo de disociación celular, y pipetear para mezclar los organoides. Girar a 400 x g durante 5 min a RT para obtener un pellet de organoide.
- Si el pellet contiene organoides aún incrustados dentro de la matriz de la membrana basal no disuelta, repita los pasos 3.7-3.9 durante 5-8 minutos adicionales de tripsinización.
- Una vez que se obtenga un pellet de organoide blanco sin matriz de membrana basal no disuelta, deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de Ad-DF +++ para resuspender el pellet mediante pipeteo. Luego agregue más Ad-DF +++ hasta 10 ml.
- Girar a 400 x g durante 5 min en RT para el paso de lavado. Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Agregue la cantidad requerida de matriz de membrana basal a los organoides digeridos en función de la proporción de división apropiada (esto variará ampliamente para cada línea de organoides según la tasa de crecimiento). Consulte la Figura 3 (imagen del día 1) para ver un ejemplo de densidad de siembra. Mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para evitar crear burbujas. Colocar inmediatamente sobre hielo.
- Abra y etiquete una placa de 6 pocillos precalentada. Se recomienda colocar una cúpula de 10-20 μL en la esquina de un pozo para observar la confluencia bajo el microscopio. Si los organoides son confluentes, se puede agregar más matriz de membrana basal para aumentar la relación de división.
- Domos en placa de 300 μL de organoides resuspendidos en matriz de membrana basal. Asegúrese de mantener el tubo en hielo mientras cubre múltiples pocillos para que la matriz de la membrana basal permanezca en solución.
- Deje la placa sin perturbaciones en la campana durante 5 minutos y luego colóquela cuidadosamente en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 sin alterar las cúpulas.
- Después de 20-30 minutos, las cúpulas se solidifican. Agregue 3 ml de medio completo precalentado a cada pocillo y vuelva a colocar la placa en la incubadora. Agregue un medio completo fresco cada 5-7 días. Realizar pruebas rutinarias de los cultivos para detectar la contaminación por micoplasma.
NOTA: El protocolo para el cultivo de tumores de mama y organoides normales es el mismo. Sin embargo, en nuestra experiencia, los organoides normales tienden a crecer bien hasta el pasaje 6-8 antes de disminuir la velocidad. Es aconsejable hacer tantas existencias de paso temprano como sea posible para futuras investigaciones.
4. Congelación de organoides mamarios derivados de pacientes
- Pasar pozos confluentes de organoides para eliminar cualquier matriz de membrana basal, como se indica en los pasos 3.1-3.12.
- Resuspender el pellet de organoides en medio de congelación celular (descongelado durante la noche a 4 ºC) con 1 mL de medio por cada 200-300 μL de volumen de matriz de membrana basal antes de pasar por deaging. Realice un recuento de células antes de congelar como referencia. Alícuota un pequeño volumen (al menos 100 μL) de células para someterse a una tripsinización adicional, si es necesario, para obtener células individuales, y luego contarlas usando una máquina contadora de células.
- Transfiera 1 ml de células a crioviales de 2 ml marcados con el número de línea del organoide, la fecha y el número de pasaje. Asegúrese de etiquetar los tubos con un marcador permanente o use crioetiquetas.
- Mover los viales a un recipiente de congelación de celdas y transferir el recipiente a un congelador a -80 °C. Después de la incubación durante la noche, los viales están listos para ser trasladados a un congelador de almacenamiento de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
5. Descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes
- Descongele una botella de matriz de membrana basal en hielo o durante la noche a 4 °C. Precaliente Ad-DF+++ medio a 37 °C. Alícuota 9 ml de medio precalentado en tubos cónicos de 15 ml para cada vial congelado.
- Descongelar rápidamente el vial congelado de organoides colocándolo en un baño de perlas a 37 °C. Rocíe etanol al 70% y transfiera el tubo al gabinete de bioseguridad.
- Enjuague la punta de la pipeta con una solución BSA al 0,5% para evitar la pérdida de organoides. Mezcle los organoides descongelados suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar los organoides sedimentados en el tubo.
- Transfiera suavemente 1 ml de organoides congelados a 9 ml de Ad-DF+++ precalentado gota. Gire las celdas a 400 x g durante 5 minutos y luego deseche cuidadosamente el sobrenadante.
- Lave el pellet agregando 10 ml de Ad-DF+++ fresco precalentado al pellet organoide y mezcle suavemente con una pipeta prerecubierta con BSA al 0,5% para resuspender el pellet. Gire las celdas a 400 x g durante 5 minutos y deseche cuidadosamente el sobrenadante.
- Coloque el pellet organoide en hielo y retire cualquier remanente de Ad-DF+++ con cuidado utilizando una punta de pipeta de menor volumen. Resuspender el pellet en 300 μL de matriz de membrana basal y placa en una placa de 6 pocillos precalentada. Colocar la placa en una incubadora a 37 °C con un 5% deCO2.
NOTA: Se recomienda colocar una pequeña cúpula de 10 μL del pellet resuspendido en una esquina del pozo para discernir la confluencia bajo el microscopio. Si los organoides parecen confluentes, diluir agregando 300 μL de matriz de membrana basal a la placa en dos pocillos de una placa de 6 pocillos. - Después de una incubación de 20-30 minutos, agregue 3 ml de medio completo precalentado a la cúpula solidificada.
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Representative Results
Hemos establecido un biobanco de organoides tumorales de mama derivados de pacientes que comprende varios subtipos11. Además, hemos establecido múltiples líneas organoides mamarias normales derivadas de muestras de tejido de mamoplastia reductora o mama normal adyacente/distal de pacientes con BC utilizando el enfoque descrito en la Figura 1.
Las diversas líneas organoides de tumores de mama derivados de pacientes difieren en su morfología (Figura 2) y tasa de crecimiento (Figura 3). Los organoides mamarios normales, y los pocos organoides derivados del carcinoma ductal temprano in situ (CDIS) que hemos establecido, se asemejan a la estructura mamaria normal con una luz central rodeada de células ductales (Figura 2A, B). Los organoides derivados de un carcinoma lobulillar invasivo (Figura 2C) tienden a formar estructuras similares a racimos de uva poco adheridas, como lo informaron previamente otros laboratorios36,43. Mientras tanto, los organoides derivados de carcinomas ductales invasivos (cáncer de mama con receptores hormonales positivos y triple negativos) tienden a formar organoides densos, grandes y redondos (Figura 2D, E). Los organoides se fijaron con paraformaldehído al 4% seguido de ser incrustados en moldes de agarosa al 2%. Luego se incrustaron parafina y se tiñeron secciones de 10 μm con hematoxilina y eosina (como se describe en Bhatia et al.11) para observar la morfología.
Para demostrar las diferencias en la tasa de crecimiento de diferentes líneas organoides de tumores de mama derivadas de pacientes, se colocaron 1.000 células individuales viables en una solución de suspensión de matriz de membrana basal al 10% por placa de 96 pocillos, con seis réplicas cada una para determinar la viabilidad celular en diferentes puntos de tiempo para monitorear el crecimiento durante un período de 12 días (Figura 3B ). La formación de organoides se midió utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente en los días 3, 6, 9 y 12, con una lectura de referencia el día 1 después del enchapado. La Figura 3A muestra imágenes de campo brillante de los mismos organoides expandidos en placas de 6 pocillos a lo largo del tiempo. Algunas líneas de organoides derivadas del paciente tienen un tiempo de duplicación de 2 días, mientras que otras tardan 5 días (Figura 3B).
Figura 1: Establecimiento de organoides mamarios derivados de pacientes. (A) Representación esquemática de los principales pasos en el establecimiento de tumores de mama derivados de pacientes u organoides normales. (B) Imágenes representativas que muestran el crecimiento de organoides tumorales de mama derivados de pacientes DS117T desde el establecimiento (pasaje 0) hasta el cultivo a largo plazo (pasaje 12). Flechas azules = material fibroso, flechas amarillas = escombros/células muertas y flechas rojas = tipos de células de soporte del microambiente (principalmente fibroblastos). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Organoides mamarios derivados de pacientes que representan diferentes subtipos. Panel superior: diferencias morfológicas entre líneas organoides derivadas de tumores mamarios de pacientes (B-E) de diferentes subtipos histopatológicos y moleculares. (A) La figura representa organoides derivados del tejido mamario humano normal obtenido después de la cirugía de mamoplastia reductiva. Barra de escala = 50 μm. Panel inferior: imágenes teñidas de H&E de las mismas líneas organoides. Barra de escala = 100 μm. Abreviatura: TNBC = cáncer de mama triple negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Crecimiento en cultivo de diferentes organoides tumorales de mama derivados de pacientes. Imágenes representativas de campo claro y curvas de viabilidad celular (A y B), medidas a través de un ensayo de viabilidad celular luminiscente que muestra el crecimiento en cultivo de diferentes líneas organoides de tumores de mama derivadas de pacientes durante 12 días. Barra de escala = 50 μm. Las barras de error representan SEM para n = 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestro laboratorio ha empleado con éxito los protocolos anteriores para establecer organoides a partir de resecciones o raspados tumorales ingenuos. También hemos utilizado este protocolo para desarrollar organoides normales a partir de tejido mamario obtenido a través de mamoplastias reductoras o de tejido mamario normal adyacente o distal de pacientes con cáncer. Alrededor de 30 a 40 % de los tumores primarios resecados dieron lugar a cultivos de organoides tumorales exitosos a largo plazo (paso 8 >). Las líneas organoides tumorales que disminuyeron después de unos pocos pasajes tuvieron un crecimiento de organoides normales o células del estroma, o consistieron principalmente en células tumorales no proliferativas. La evaluación y modificación adicionales de los componentes medios que actualmente favorecen el crecimiento de células epiteliales, u otros medios de preselección de las poblaciones de células tumorales, deberían mejorar la tasa de éxito para el establecimiento y el cultivo a largo plazo de las DOP. Además, se recomienda encarecidamente congelar varios viales de organoides expandidos con éxito y realizar pruebas de descongelación en viales congelados para cada línea de organoides establecida para autenticar su éxito a largo plazo en cultivo.
Algunas líneas de organoides exitosas que se ralentizan a veces en cultivo o luchan por recuperarse de un deshielo a menudo se benefician del aumento de la densidad de siembra. Se observa una mayor confluencia para ayudar a estimular un crecimiento más rápido para la mayoría de las líneas, probablemente como resultado de interacciones célula-célula o factores secretados. Además, filtrar los organoides (después de la tripsinización) a través de un filtro de 70-100 μm puede ayudar a eliminar los residuos acumulados de los organoides muertos que a veces aparecen después de descongelar algunas líneas de organoides y tienden a dificultar su crecimiento. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que algunos materiales organoides saludables también se pierden en el proceso de filtrado. Ciertas líneas organoides que expresan el receptor de estrógeno (ER +) pueden crecer lentamente en comparación con TNBC, y podrían beneficiarse potencialmente de la adición de estradiol al medio. Se recomienda que las líneas organoides de tumores de mama derivadas de pacientes establecidas se caractericen genómica y transcriptómicamente. Esto se puede hacer utilizando varias técnicas, como la evaluación inmunohistoquímica para las características patológicas y genéticas de los tumores de los pacientes (expresión del receptor de estrógeno, receptor de progesterona, factor de crecimiento epidérmico humano 2, Cadherin, Ki-67, etc.), secuenciación de ARN, secuenciación de ARN de una sola célula, secuenciación de ADN para genes impulsores del cáncer, variaciones en el número de copias, etc. Para los estudios mecanicistas y de respuesta a fármacos, se deben considerar los inhibidores específicos que son componentes del medio y cualquier tratamiento previo recibido por el paciente antes de la cirugía.
Las líneas organoides tumorales derivadas de diferentes pacientes varían en mutaciones genómicas, transcriptómica, morfología, tasa de crecimiento, capacidad para formar organoides grandes, presencia de poblaciones celulares heterogéneas, etc. Estas diferencias plantean desafíos para establecerlos y cultivarlos, sin embargo, también hacen que los organoides sean modelos robustos que representan tanto la diversidad del paciente como la complejidad del tumor. Se ha demostrado que los organoides derivados de tumores de mama recapitulan los tumores originales de los pacientes en los niveles genómico, transcriptómico11,36 y metabolómico44. Todos estos factores los convierten en herramientas poderosas para el tamizaje de fármacos y la oncología de precisión39. Los organoides derivados de pacientes son un nuevo y emocionante sistema modelo que servirá como modelos tridimensionales in vitro para estudiar la biología del cáncer, así como para examinar cuestiones terapéuticamente importantes para avanzar en el campo de la medicina personalizada. Los organoides mamarios normales y tumorales pueden modificarse genéticamente a través de la ingeniería CRISPR15,38, lo que provoca su uso favorable para estudios genéticos mecanicistas para la tumorigénesis y la progresión del cáncer. Los organoides tumorales de mama derivados de pacientes también se han utilizado para desarrollar modelos de xenoinjertos 11,38,39 que potencialmente pueden imitar el crecimiento tumoral en pacientes. Además, los sistemas de cocultivo de organoides de tumores de mama derivados de pacientes siguen siendo un área de investigación poco explorada que puede proporcionar información valiosa sobre la importancia de la diafonía entre las células de cáncer de mama y otras células, como los fibroblastos asociados al cáncer del estroma, las células inmunes, los adipocitos, etc. en la progresión tumoral.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Spector por las discusiones críticas a lo largo de este trabajo. Agradecemos a Norman Sachs y Hans Clevers (Hubrecht Institute, Países Bajos) por proporcionarnos inicialmente su protocolo de cultivo de organoides. Reconocemos los Recursos Compartidos de Histología y Microscopía del Centro Oncológico de CSHL por sus servicios y experiencia técnica (NCI 2P3OCA45508). Agradecemos al Dr. Qing Gao por su ayuda con la preparación de muestras histológicas. Estamos agradecidos por el apoyo de la Dra. Karen Kostroff (Northwell Health) por proporcionar muestras de tumores de pacientes. También apreciamos los esfuerzos del equipo de Northwell Health Biobanking para la adquisición de muestras, y agradecemos a los pacientes y sus familias por donar tejidos para la investigación. Esta investigación fue apoyada por CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) y Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson y D.L.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
- di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
- Hortobagyi, G. N., et al.
- Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
- Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. Á, Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
- Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
- Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
- Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- HCMI Catalog. , Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022).
- Search ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022).
- Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
- Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
- Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
- Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- HUB Organoids: Patient in the lab. , Available from: https://www.huborganoids.nl (2022).
- Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
- Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
- PDX Portal. , Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022).
- Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
- Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
- Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
- Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).
