Summary
Ett detaljerat protokoll tillhandahålls här för att etablera humana bröstorganoider från patient-härledda brösttumörresektioner eller normal bröstvävnad. Protokollet ger omfattande steg-för-steg-instruktioner för odling, frysning och upptining av mänskliga patient-härledda bröstorganoider.
Abstract
Bröstcancer är en komplex sjukdom som har klassificerats i flera olika histologiska och molekylära subtyper. Patient-derived brösttumörorganoider utvecklade i vårt laboratorium består av en blandning av flera tumör-härledda cellpopulationer, och representerar därmed en bättre approximation av tumörcelldiversitet och miljö än de etablerade 2D-cancer cellinjer. Organoider fungerar som en idealisk in vitro-modell , vilket möjliggör cell-extracellulära matrisinteraktioner, kända för att spela en viktig roll i cell-cellinteraktioner och cancerprogression. Patient-derived organoider har också fördelar jämfört med musmodeller eftersom de är av mänskligt ursprung. Vidare har de visat sig rekapitulera den genomiska, transkriptomiska såväl som metaboliska heterogeniteten hos patienttumörer; Således kan de representera tumörkomplexitet såväl som patientdiversitet. Som ett resultat är de redo att ge mer exakta insikter i målupptäckt och validering och läkemedelskänslighetsanalyser. I detta protokoll ger vi en detaljerad demonstration av hur patient-härledda bröstorganoider etableras från resekterade brösttumörer (cancerorganoider) eller reduktiv mammoplastik-härledd bröstvävnad (normala organoider). Detta följs av en omfattande redogörelse för 3D-organoidkultur, expansion, passaging, frysning samt upptining av patient-härledda bröstorganoidkulturer.
Introduction
Bröstcancer (BC) är den vanligaste maligniteten hos kvinnor, med 287 850 nya fall som beräknas diagnostiseras i USA 20221. Trots de senaste framstegen inom tidig upptäckt med årliga screenings, riktade terapier och en bättre förståelse för genetisk predisposition, råder det att vara den näst ledande orsaken till cancerdöd hos kvinnor i USA, med > 40 000 dödsfall som tillskrivs bröstcancer årligen1. Bröstcancer klassificeras för närvarande i flera subtyper baserat på histopatologisk och molekylär utvärdering av den primära tumören. Bättre subtypstratifiering har förbättrat patientresultaten med subtypspecifika behandlingsalternativ2. Till exempel har identifieringen av HER2 som en proto-onkogen3 lett till utvecklingen av Trastuzumab, vilket har gjort denna mycket aggressiva subtyp hanterbar hos de flesta patienter4. Ytterligare forskning om genetik och transkriptomik av denna komplexa sjukdom på ett patientspecifikt sätt kommer att hjälpa till att utveckla och förutsäga bättre patientspecifika personliga behandlingsregimer 2,5. Patient-derived organoids (PDO) är en lovande ny modell för att få insikter om cancer på molekylär nivå, identifiera nya mål eller biomarkörer och utforma nya behandlingsstrategier 6,7,8.
SUB är flercelliga, tredimensionella (3D) strukturer som härrör från nyligen resekterade primära vävnadsprover 8,9. De odlas tredimensionellt genom att vara inbäddade i en hydrogelmatris, vanligtvis sammansatt av en kombination av extracellulära matrixproteiner (ECM), och kan därför användas för att studera tumörcell-ECM-interaktioner. SUBs representerar patientdiversitet och rekapitulerar cellulär heterogenitet och genetiska egenskaper hos tumören10,11,12. Eftersom de är in vitro-modeller möjliggör de genetisk manipulation och läkemedelsskärmar med hög kapacitet13,14,15. Vidare kan PDOs rimligen användas för att utvärdera patientens läkemedelskänslighet och behandlingsstrategier parallellt med kliniken och hjälpa till att förutsäga patientresultat16,17,18. Förutom kemoterapi har vissa organoidmodeller också använts för att undersöka enskilda patienters svar på kemostrålning19,20. Med tanke på den lovande tillämpligheten av SUBs för forskning och klinisk användning har National Cancer Institute initierat ett internationellt konsortium, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, för att generera och tillhandahålla dessa tumörhärledda nya cancermodeller. Många av de organoidmodeller av olika cancertyper som utvecklats genom HCMI är tillgängliga via American Type Culture Collection (ATCC)22.
Normala bröstorganoider har visat sig bestå av olika epitelcellpopulationer närvarande i bröstkörteln 11,23 och fungerar därmed som bra modeller för att studera grundläggande biologiska processer, för att analysera drivarmutationer som orsakar tumörgenes och för cancercell-of-origin härstamningsstudier 6,15 . Brösttumörorganoidmodeller har använts för att identifiera nya mål som uppmuntrar utsikterna att utveckla nya terapier, särskilt för resistenta tumörer24,25,26. Med hjälp av patient-derived xenograft (PDX) och matchade PDX-härledda organoidmodeller (PDxO) av behandlingsresistenta brösttumörer visade Guillen et al. att organoider är kraftfulla modeller för precisionsmedicin, som kan utnyttjas för att utvärdera läkemedelssvar och direkta terapibeslut parallellt28. Vidare ger utvecklingen av nya samodlingsmetoder för odling av SUB med olika immunceller27,28,29, fibroblaster 30,31 och mikrober 32,33 en möjlighet att studera tumörmikromiljöns inverkan på cancerprogression. Medan många sådana samodlingsmetoder aktivt etableras för SUB härrörande från bukspottskörtel- eller kolorektala tumörer, har liknande etablerade samodlingsmetoder för bröst-PDO endast rapporterats för naturliga mördarceller34 och fibroblaster35.
Den första biobanken med >100 patientbaserade organoider som representerar olika bröstcancersubtyper utvecklades av Hans Clevers grupp36,37. Som en del av detta arbete utvecklade Clevers-gruppen också det första komplexa odlingsmediet för bröstorganoidtillväxt, som för närvarande används allmänt36. En uppföljningsstudie gav en omfattande redogörelse för etablering och odling av SUB:er i bröst och patienthärledda organoida xenotransplantat (PDOX)38. Welm-labbet utvecklade en stor samling BC PDX-modeller och PDxOs som odlas i ett jämförelsevis enklare tillväxtmedium innehållande fetalt bovint serum (FBS) och färre tillväxtfaktorer39,40. Vi har självständigt utvecklat och karakteriserat ett stort antal naiva patient-härledda bröstcancerorganoidmodeller11, och deltagit i utvecklingen av BC PDO-modeller som en del av HCMI-initiativet21. Här strävar vi efter att ge en praktisk guide som beskriver den metod som används av oss för att generera patient-härledda bröstorganoidmodellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumörresektioner från bröstcancerpatienter, tillsammans med distal och intilliggande normal vävnad, erhölls från Northwell Health i enlighet med Institutional Review Board-protokollen IRB-03-012 och IRB 20-0150, och med skriftligt informerat samtycke från patienterna.
OBS: Alla procedurer som nämns nedan utfördes i ett BSL2-rum för däggdjursvävnadskultur avsett för patientprover efter godkännande av biosäkerhetskommittén. Alla procedurer ska utföras enligt säkerhetsprotokoll som upprätthåller aseptiska förhållanden i biosäkerhetsskåp. Varje centrifugeringssteg utförs vid rumstemperatur (RT) om inte annat anges. Vävnad/organoider och basalmembranmatrislager läggs alltid på is om inget annat anges. Nya plattor inkuberas över natten för förvärmning. Pläteringskupoler på förvärmda plattor säkerställer bästa resultat för att få rundade kupoler som inte plattar ut medan de pläteras eller lyfts av senare från plattytan.
1. Medium beredning och recept
- Förbered R-spondin1 konditionerade medier enligt beskrivningen nedan (alternativt kan köpas kommersiellt).
- Förbered två separata odlingsmedier bestående av Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM), 10% FBS, 5% penicillin-streptomycin och med eller utan 300 μg / ml zeocintillskott.
- Tina en injektionsflaska med HEK293T-HA-Rspondin1-Fc-celler (erhållen från Calvin Kuos laboratorium vid Stanford University och även kommersiellt tillgänglig) i en 75 cm2 vävnadsodlingskolv med 15 ml medium.
- Dela cellerna i 2 x 175 cm2 odlingskolvar, var och en med 35 ml medium innehållande zeocin.
- För cellerna igen för att erhålla så många kolvar som behövs för att generera önskat parti R-spondin1-konditionerat medium. Använd tillväxtmedium utan zeocin.
- När kolvarna som innehåller medium utan zeocin är sammanflytande, avlägsna och ersätt odlingssubstratet med Ad-DF+++ (steg 1.2; Tabell 1). Placera cellerna i en 37 °C inkubator med 5%CO2 i 1 vecka.
- Snurra ner mediet vid 400 x g i 5 minuter för att ta bort eventuella celler som inte är fästa. Filtrera mediet genom ett 0,22 μm filter. Gör 25 ml alikvoter och förvara dem vid -20 °C (kan förvaras i upp till 6 månader).
- Använd HEK293T-celler, utför en dubbel luciferas TOPFLASH41,42-analys med användning av ett kommersiellt DNA-transfektionsreagens vid ett 4,8: 1-reagens till DNA-förhållande med utspädningsmedlet DMEM (hög glukos, pyruvat). Tillsätt 100 μL R-spondin1 konditionerat medium (eller basalmedium för den negativa kontrollen) till 100 μL transfekterade celler. Utför sedan den dubbla luciferasanalysen enligt tillverkarens protokoll för att verifiera Wnt-aktiviteten hos det R-spondin1-konditionerade mediet.
OBS: Analysen använder en TOP-plasmid med Firefly-luciferasaktivitetsavläsning och FOP-plasmiden används som en negativ kontroll.
- Förbered basalmedium (Ad-DF+++ medium, som tidigare publicerats av Sachs et al.36).
Reagens Koncentration av bestånd Slutlig koncentration Avancerad DMEM/F12 1x 1x GlutaMax 100x 1x HEPES 2 . 10 mM Penicillin-streptomycin 10 000 E/ml; 10 000 μg/ml 100 U / ml; 100 μg/ml
Tabell 1: Basal Ad-DF +++ medium sammansättning. - Förbered komplett medium för patient-härledda bröstorganoider som tidigare publicerats av Sachs et al.36.
Reagens Koncentration av bestånd Slutlig koncentration Ad-DF +++ medium 1x 1x R-spondin internt 100% 10% B-27 tillägg 50x 1x Nikotinamid 2 . 5 mM NAC 500 mM 1,25 mM Primocin 50 mg/ml 50 μg/ml Skalle 100 μg/ml 100 ng/ml EGF för människor 5 μg/ml 5 ng/ml Humant heregulin β1/neuregulin1 75 μg/ml 37,5 ng/ml Y-27632 Dihydroklorid (rhokinas) 100 mM 5 μM A83-01 5 mM 500 nM Mänsklig FGF-7 100 μg/ml 5 ng/ml Mänsklig FGF-10 1 mg/ml 20 ng/ml P38i 30 mM 498 nM
Tabell 2: Komplett mediumsammansättning för patienthärledda bröstorganoider. - Bered 2 mg/ml kollagenas IV-lösning genom att väga erforderlig mängd kollagenas IV-pulver och lösligt i Ad-DF+++ basmedium. Filtrera genom ett 0,22 μm filter före användning.
- Bered 0,5% bovint serumalbumin (BSA) lösning från 7,5% stamlösning med 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) som utspädningsmedel. Filtrera genom ett 0,22 μm filter före användning.
2. Etablering av brösttumör/normala organoider från resekterad vävnad (figur 1)
- Transportera en kirurgiskt resekterad brösttumör/normalt vävnadsprov till laboratoriet i ett 50 ml koniskt rör innehållande Ad-DF+++. Förvara röret på is tills isoleringen börjar.
- Tina en flaska basalmembranmatris på is eller över natten vid 4 °C.
- Överför den resekterade vävnaden till en 10 cm steril petriskål. Undersök vävnaden makroskopiskt och notera om den verkar morfologiskt fet, vaskulär eller nekrotisk. Registrera dessutom vävnadens storlek och form. Ta helst en bild av vävnaden med en linjal i sikte (figur 2).
- Finhacka vävnaden i mycket små bitar (~ 1 mm3) med en steril skalpell nr 10 och överför den till ett 50 ml koniskt rör.
- Tillsätt 10 ml 2 mg/ml kollagenas IV-lösning och försegla röret med en genomskinlig film. Placera röret på en orbitalskakapparat vid 37 °C vid 140 rpm i 30-90 min i ett vinklat läge (~30° vinkel).
- Placera under inkubationen en alikvot av hela mediet för förvärmning i ett 37 °C pärla/vattenbad.
- Var 15:e minut suspenderas vävnaden genom kraftig blandning med en 5 ml steril serologisk pipett. Förbelägga pipetten med 0,5% BSA-lösning för att förhindra vävnadsförlust orsakad av att provet fastnar på pipetten. Övervaka dissociation över tid genom att observera det koniska röret under mikroskopet vid en 5x eller högre förstoring.
- När vävnaden har dissocierats, centrifugera vid 400 x g i 5 minuter. Aspirera supernatanten, tillsätt 10 ml Ad-DF +++ och centrifugera vid 400 x g i 5 minuter.
- Kassera supernatanten försiktigt. Vävnadspellets kan ibland vara lösa, så var försiktig när du aspirerar. Upprepa steget en gång till.
- Om vävnadspelleten är delvis röd, tillsätt 2 ml röd blodkroppslysbuffert och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Inkubera inte längre, eftersom detta avsevärt minskar cellviabiliteten.
- Tillsätt 10 ml Ad-DF +++ till röret, centrifugera vid 400 x g i 5 minuter och kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 50-300 μL outspädd, kall basalmembranmatris och blanda genom pipettering försiktigt för att undvika att bubblor bildas.
OBS: Volymen på basalmembranmatrisen som tillsätts beror på pelletsstorleken. Om du är osäker, platta en liten kupol på ~ 10 μL från den återsuspenderade pelleten och observera sammanflödet under mikroskopet. Justera genom att lägga till mer basalmembranmatris om det behövs. Se figur 3 (bild dag 1) för en referenssådddensitet. - Platta 300 μL basalmembranmatriskupol innehållande organoider i varje brunn på en förvärmd, märkt vävnadsodlingsplatta med 6 brunnar. Se tabell 3 för rekommenderad basalmembranmatris och medelstora volymer om du använder olika plattor.
Antal brunnar per platta Basalmembranmatris per kupol (μL) Medium per brunn (μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (upphängning istället för kupol) 100
Tabell 3: Mängd basalmembranmatris och tillväxtmedium som rekommenderas per brunn baserat på plattstorlek. - Låt plattan stå ostörd i huven i 5 minuter och placera sedan försiktigt i inkubatorn vid 37 °C i 20-30 minuter så att basalmembranmatriskupolen stelnar helt.
- Tillsätt 3 ml förvärmt komplett medium droppvis till varje brunn på en 6-brunnsplatta och placera i inkubatorn vid 37 °C och 5%CO2. Ta bilder av organoiderna med ett 5x mål på ett inverterat ljusfältmikroskop.
- Fyll på mediet var 4-8: e dag baserat på tillväxten av organoider. Aspirera försiktigt det gamla mediet utan att störa kupolen och tillsätt färskt, förvärmt medium droppvis.
OBS: Protokollet är detsamma för att etablera bröstcancerorganoider härledda från den resekterade tumören och för normala organoider härrörande från resekterad frisk bröstvävnad (antingen från intilliggande och normal bröstvävnad hos samma patient eller frisk bröstvävnad erhållen från en reduktiv mammoplastikkirurgi).
3. Passera och expandera patient-härledda bröstorganoider i kultur
- Tina en flaska basalmembranmatris på is eller över natten vid 4 °C.
- Lyft in basalmembranmatriskupolen i mediet i brunnen med en cellskrapa eller en 1 ml pipettspets.
- Förbelägg pipettspetsen med 0,5% BSA-lösning och överför sedan organoidernas flytande kupol med medium till ett 15 ml eller 50 ml koniskt rör, beroende på antalet brunnar som skördas. För mer än två brunnar som innehåller 300 μL basalmembranmatriskupoler, använd ett 50 ml koniskt rör. Lägg till 1x DPBS för att öka volymen till minst 5 ml.
- Snurra rören vid 400 x g i 5 min. Basalmembranmatrisen med organoider bildar ett lager i botten. Aspirera försiktigt för att ta bort supernatanten.
- Tillsätt 5-20 ml 1x DPBS, beroende på antalet brunnar som samlas i ett rör. Förbelägg en steril engångspipett med 0,5% BSA och blanda organoid-basalmembranmatrispelleten i DPBS jämnt genom pipettering upp och ner.
- Snurra rören vid 400 x g i 5 min. Aspirera försiktigt och kassera supernatanten.
- Tillsätt celldissociationsreagens vid tre gånger volymen av basalmembranmatrisen till röret. Använd en 0,5% BSA-belagd pipettspets, resuspendera organoiderna i celldissociationsreagenset.
- Placera röret på en orbitalskakapparat vid 37 °C vid 140 rpm i 8-15 min i ett vinklat läge. Övervaka röret genom att observera det under mikroskopet var 5: e minut för att säkerställa att organoiderna bryts ner i mindre kluster.
- Tillsätt basalmedium (dvs. Ad-DF +++) vid en volym som är lika med eller större än celldissociationsreagenset och pipett för att blanda organoiderna. Snurra vid 400 x g i 5 min vid rumstemperatur för att erhålla en organoidpellet.
- Om pelleten innehåller organoider som fortfarande är inbäddade i den oupplösta basalmembranmatrisen, upprepa steg 3.7-3.9 för ytterligare 5-8 minuters trypsinisering.
- När en vit organoidpellet utan oupplöst basalmembranmatris erhållits, kassera supernatanten och tillsätt 1 ml Ad-DF +++ för att återsuspendera pelleten genom pipettering. Lägg sedan till mer Ad-DF +++ upp till 10 ml.
- Snurra vid 400 x g i 5 min vid RT för tvättsteget. Aspirera och kassera supernatanten.
- Tillsätt den erforderliga mängden basalmembranmatris till de smälta organoiderna baserat på lämpligt delningsförhållande (detta varierar mycket för varje organoidlinje baserat på tillväxthastighet). Se figur 3 (bild dag 1) för ett exempel på sådddensitet. Blanda genom att försiktigt pipta upp och ner för att undvika att skapa bubblor. Lägg omedelbart på is.
- Öppna och märk en förvärmd 6-brunnsplatta. Det rekommenderas att platta en 10-20 μL kupol i hörnet av en brunn för att observera sammanflödet under mikroskopet. Om organoiderna är sammanflytande kan mer basalmembranmatris tillsättas för att öka delningsförhållandet.
- Platta 300 μL kupoler av organoider återsuspenderade i basalmembranmatris. Se till att hålla röret på is medan du pläterar flera brunnar så att basalmembranmatrisen förblir i lösning.
- Låt plattan stå ostörd i huven i 5 minuter och placera sedan försiktigt i en 37 °C inkubator med 5% CO2 utan att störa kupolerna.
- Efter 20-30 minuter stelnar kupolerna. Tillsätt 3 ml förvärmt komplett medium till varje brunn och placera plattan tillbaka i inkubatorn. Tillsätt färskt komplett medium var 5-7: e dag. Utför rutinmässig testning av kulturerna för att detektera mykoplasmakontaminering.
OBS: Protokollet för odling av brösttumörer och normala organoider är detsamma. Men enligt vår erfarenhet tenderar normala organoider att växa bra upp till passage 6-8 innan de saktar ner. Det är lämpligt att göra så många tidiga passagebestånd som möjligt för framtida forskning.
4. Frysning av patient-härledda bröstorganoider
- Passera sammanflytande brunnar av organoider för att avlägsna eventuell basalmembranmatris, enligt vad som anges i steg 3.1-3.12.
- Återsuspendera pelleten av organoider i cellfrysningsmedium (tinas över natten vid 4 °C) med 1 ml medium per 200-300 μL basalmembranmatrisvolym före passaging. Utför ett cellantal före frysning som referens. Alikvot en liten volym (minst 100 μL) celler för att genomgå ytterligare trypsinisering, om det behövs, för att få enstaka celler och räkna dem sedan med hjälp av en cellräknarmaskin.
- Överför 1 ml celler till 2 ml kryovialer märkta med organoidlinjenummer, datum och passagenummer. Var noga med att märka rören med en permanent markör eller använd kryoetiketter.
- Flytta injektionsflaskorna till en cellfrysbehållare och överför behållaren till en frys på -80 °C. Efter inkubation över natten är injektionsflaskorna redo att flyttas till en frys för lagring av flytande kväve för långvarig lagring.
5. Upptining av patienthärledda bröstorganoider
- Tina en flaska basalmembranmatris på is eller över natten vid 4 °C. Förvärm Ad-DF+++ medium vid 37 °C. Alikvot 9 ml förvärmt medium i 15 ml koniska rör för varje fryst injektionsflaska.
- Tina snabbt den frysta injektionsflaskan med organoider genom att placera den i ett 37 °C pärlbad. Spraya 70% etanol och överför röret till biosäkerhetsskåpet.
- Skölj pipettspetsen med 0,5% BSA-lösning för att undvika organoidförlust. Blanda de tinade organoiderna försiktigt genom att pipettera upp och ner för att blanda eventuella sedimenterade organoider i röret.
- Överför försiktigt 1 ml frysta organoider till 9 ml förvärmd Ad-DF +++ på ett droppvis sätt. Snurra cellerna vid 400 x g i 5 minuter och kasta sedan försiktigt supernatanten.
- Tvätta pelleten genom att tillsätta 10 ml färsk förvärmd Ad-DF +++ till organoidpelleten och blanda försiktigt med en pipett förbelagd med 0,5% BSA för att återsuspendera pelleten. Snurra cellerna vid 400 x g i 5 minuter och kasta försiktigt supernatanten.
- Placera organoidpelleten på is och ta försiktigt bort eventuella rester av Ad-DF+++ med en pipettspets med mindre volym. Återsuspendera pelleten i 300 μL basalmembranmatris och platta i en förvärmd 6-brunnsplatta. Placera plattan i en 37 °C inkubator med 5% CO2.
OBS: Det rekommenderas att plåta en liten 10 μL kupol från den återsuspenderade pelleten i ett hörn av brunnen för att urskilja sammanflödet under mikroskopet. Om organoiderna ser sammanflytande ut, späd genom att tillsätta 300 μL basalmembranmatris till plattan i två brunnar på en 6-brunnsplatta. - Efter en 20-30 minuters inkubation, tillsätt 3 ml förvärmt komplett medium till den stelnade kupolen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har etablerat en biobank av patienthärledda brösttumörorganoider omfattande olika subtyper11. Dessutom har vi etablerat flera normala bröstorganoidlinjer härledda från reduktiva mammoplastikvävnadsprover eller intilliggande/distala normala bröst från BC-patienter med hjälp av det tillvägagångssätt som beskrivs i figur 1.
De olika patient-härledda brösttumörorganoidlinjerna skiljer sig åt i deras morfologi (figur 2) och tillväxthastighet (figur 3). Normala bröstorganoider och de få tidiga duktala karcinom in situ (DCIS) -härledda organoider som vi har etablerat, liknar den normala bröststrukturen med en central lumen omgiven av duktala celler (figur 2A, B). Organoider härrörande från ett invasivt lobulärt karcinom (figur 2C) tenderar att bilda löst fästa druvklasliknande strukturer, som tidigare rapporterats av andra laboratorier36,43. Under tiden tenderar organoider härrörande från invasiva duktala karcinom (hormonreceptorpositiv och trippelnegativ bröstcancer) att bilda täta, stora och runda organoider (figur 2D, E). Organoider fixerades med 4% paraformaldehyd följt av att vara inbäddade i 2% agarosformar. De var sedan paraffin inbäddade, och 10 μm sektioner färgades med hematoxylin och eosin (som beskrivs i Bhatia et al.11) för att observera morfologin.
För att demonstrera skillnaderna i tillväxthastigheten för olika patienthärledda brösttumörorganoidlinjer pläterades 1 000 livskraftiga enskilda celler i 10% basalmembranmatrissuspensionslösning per 96-brunnsplatta, med sex replikat vardera för att bestämma cellviabiliteten vid olika tidpunkter för att övervaka tillväxten under en period av 12 dagar (figur 3B ). Organoidbildningen mättes med hjälp av en luminescerande cellviabilitetsanalys dag 3, 6, 9 och 12, med en baslinjeavläsning dag 1 efter plätering. Figur 3A visar ljusfältsbilder av samma organoider expanderade i 6-brunnsplattor över tiden. Vissa patienthärledda organoidlinjer har en fördubblingstid på 2 dagar, medan vissa tar 5 dagar (figur 3B).
Figur 1: Upprättande av patient-härledda bröstorganoider. (A) Schematisk representation av de viktigaste stegen för att etablera patient-härledda brösttumörer eller normala organoider. (B) Representativa bilder som visar tillväxt av DS117T patient-härledda brösttumörorganoider från etablering (passage 0) till långtidsodling (passage 12). Blå pilar = fibröst material, gula pilar = skräp / döda celler och röda pilar = stödjande celltyper från mikromiljön (främst fibroblaster). Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bröstorganoider som härrör från patienten och representerar olika subtyper. Topppanel: morfologiska skillnader mellan organoidlinjer härledda från patientens brösttumörer (B-E) av olika histopatologiska och molekylära subtyper. (A) Figuren representerar organoider härrörande från normal mänsklig bröstvävnad erhållen efter reduktiv mammoplastikkirurgi. Skalstapel = 50 μm. Bottenpanel: H&E-färgade bilder av samma organoidlinjer. Skalstång = 100 μm. Förkortning: TNBC = trippelnegativ bröstcancer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Tillväxt i kultur av olika patient-härledda brösttumörorganoider. Representativa ljusfältsbilder och cellviabilitetskurvor (A och B), mätt via en självlysande cellviabilitetsanalys som visar tillväxten i odling av olika patient-härledda brösttumörorganoidlinjer under 12 dagar. Skalstapel = 50 μm. Felstaplar representerar SEM för n = 6. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt laboratorium har framgångsrikt använt ovanstående protokoll för att etablera organoider från naiva tumörresektioner eller skrapningar. Vi har också använt detta protokoll för att utveckla normala organoider från bröstvävnad erhållen via reduktiva mammoplastier eller från cancerpatienters intilliggande eller distala normala bröstvävnad. Cirka 30% -40% av de resekterade primära tumörerna resulterade i framgångsrika långsiktiga (>passage 8) tumörorganoidkulturer. Tumörorganoidlinjerna som avsmalnade efter några passager hade antingen en utväxt av normala organoider eller stromaceller, eller bestod huvudsakligen av icke-proliferativa tumörceller. Ytterligare utvärdering och modifiering av de mediekomponenter som för närvarande gynnar epitelcellutväxt, eller andra sätt att förvälja tumörcellpopulationerna, bör förbättra framgångsgraden för etablering och långsiktig odling av SUB. Dessutom rekommenderas det starkt att frysa ner flera injektionsflaskor med framgångsrikt expanderade organoider och utföra upptiningstester på frysta injektionsflaskor för varje etablerad organoidlinje för att verifiera deras långsiktiga framgång i kulturen.
Vissa framgångsrika organoidlinjer som saktar ner ibland i kulturen eller kämpar för att återhämta sig från upptining drar ofta nytta av att öka sådddensiteten. Högre sammanflöde observeras för att underlätta stimulera snabbare tillväxt för de flesta linjer, troligen som ett resultat av cell-cellinteraktioner eller utsöndrade faktorer. Dessutom kan filtrering av organoiderna (efter trypsinisering) genom ett 70-100 μm filter hjälpa till att avlägsna skräp som ackumuleras från döda organoider som ibland uppträder efter upptining av vissa organoidlinjer och tenderar att hindra deras tillväxt. Det måste emellertid noteras att något friskt organoidmaterial också förloras vid filtreringsprocessen. Vissa organoidlinjer som uttrycker östrogenreceptor (ER +) kan vara långsamma odlare jämfört med TNBC och kan potentiellt dra nytta av tillsatsen av östradiol till mediet. Vi rekommenderar att de etablerade patient-härledda brösttumörorganoidlinjerna karakteriseras genomiskt och transkriptomiskt. Detta kan göras genom att använda flera tekniker, såsom immunohistokemisk utvärdering för de patologiska och genetiska egenskaperna hos patienttumörer (uttryck av östrogenreceptor, progesteronreceptor, human epidermal tillväxtfaktor 2, Cadherin, Ki-67, etc.), RNA-sekvensering, encells RNA-sekvensering, DNA-sekvensering för cancerdrivargener, kopieringsnummervariationer etc. För mekanistiska och läkemedelsresponsstudier måste man överväga de specifika hämmare som är komponenter i mediet och eventuella tidigare behandlingar som patienten fått före operationen.
Tumörorganoidlinjer härledda från olika patienter varierar i genomiska mutationer, transkriptomik, morfologi, tillväxthastighet, förmåga att bilda stora organoider, närvaro av heterogena cellpopulationer etc. Dessa skillnader utgör utmaningar för att etablera och odla dem, men de gör också organoider robusta modeller som representerar både patientdiversitet och tumörkomplexitet. Brösttumör-härledda organoider har visat sig rekapitulera de ursprungliga patienttumörerna vid genomiska, transkriptomiska11,36 och metabolomiska nivåer44. Alla dessa faktorer gör dem till kraftfulla verktyg för läkemedelsscreening och precisionsonkologi39. Patient-derived organoids är ett spännande nytt modellsystem som kommer att fungera som tredimensionella in vitro-modeller för att studera cancerbiologi, samt undersöka terapeutiskt viktiga frågor för att främja området personlig medicin. Normala och tumörbröstorganoider kan modifieras genetiskt via CRISPR-teknik15,38, vilket leder till deras gynnsamma användning för mekanistiska genetiska studier för tumörgenes och cancerprogression. Patient-derived brösttumörorganoider har också använts för att utveckla xenograftmodeller 11,38,39 som potentiellt kan efterlikna tumörtillväxt hos patienter. Dessutom är patient-härledda brösttumörorganoida samodlingssystem fortfarande ett underutforskat forskningsområde som kan ge kraftfulla insikter om vikten av överhörning mellan bröstcancerceller och andra celler, såsom stromacancerassocierade fibroblaster, immunceller, adipocyter etc. i tumörprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Spectors labb för kritiska diskussioner under arbetets gång. Vi tackar Norman Sachs och Hans Clevers (Hubrecht Institute, Nederländerna) för att de inledningsvis försåg oss med sitt organoidodlingsprotokoll. Vi erkänner CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources för tjänster och teknisk expertis (NCI 2P3OCA45508). Vi tackar Dr. Qing Gao för hjälp med histologisk provberedning. Vi är tacksamma för stödet från Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) för att tillhandahålla patienttumörprover. Vi uppskattar också Northwell Health Biobanks-teamets ansträngningar för provförvärv, och vi tackar patienterna och deras familjer för att donera vävnader för forskning. Denna forskning stöddes av CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) och Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson och D.L.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
- di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
- Hortobagyi, G. N., et al.
- Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
- Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. Á, Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
- Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
- Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
- Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- HCMI Catalog. , Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022).
- Search ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022).
- Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
- Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
- Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
- Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- HUB Organoids: Patient in the lab. , Available from: https://www.huborganoids.nl (2022).
- Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
- Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
- PDX Portal. , Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022).
- Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
- Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
- Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
- Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).
