Summary
En detaljeret protokol gives her til etablering af humane brystorganoider fra patientafledte brysttumorresektioner eller normalt brystvæv. Protokollen giver omfattende trinvise instruktioner til dyrkning, frysning og optøning af humane patientafledte brystorganoider.
Abstract
Brystkræft er en kompleks sygdom, der er klassificeret i flere forskellige histologiske og molekylære undertyper. Patientafledte brysttumororganoider udviklet i vores laboratorium består af en blanding af flere tumorafledte cellepopulationer og repræsenterer således en bedre tilnærmelse af tumorcellediversitet og miljø end de etablerede 2D-kræftcellelinjer. Organoider tjener som en ideel in vitro-model , der giver mulighed for celle-ekstracellulære matrixinteraktioner, der vides at spille en vigtig rolle i celle-celle-interaktioner og kræftprogression. Patientafledte organoider har også fordele i forhold til musemodeller, da de er af menneskelig oprindelse. Desuden har de vist sig at rekapitulere den genomiske, transkriptomiske såvel som metaboliske heterogenitet af patienttumorer; Således er de i stand til at repræsentere tumorkompleksitet såvel som patientdiversitet. Som et resultat er de klar til at give mere nøjagtig indsigt i målopdagelse og validering og lægemiddelfølsomhedsanalyser. I denne protokol giver vi en detaljeret demonstration af, hvordan patientafledte brystorganoider etableres fra resekterede brysttumorer (kræftorganoider) eller reduktivt mammoplastikafledt brystvæv (normale organoider). Dette efterfølges af en omfattende redegørelse for 3D-organoidkultur, ekspansion, passering, frysning samt optøning af patientafledte brystorganoidkulturer.
Introduction
Brystkræft (BC) er den hyppigst forekommende malignitet hos kvinder med 287,850 nye tilfælde, der anslås at blive diagnosticeret i USA i 20221. På trods af de seneste fremskridt inden for tidlig påvisning med årlige screeninger, målrettede terapier og en bedre forståelse af genetisk disposition hersker det at være den næststørste årsag til kræftdødsfald hos kvinder i USA med > 40.000 dødsfald tilskrives brystkræft årligt1. Brystkræft klassificeres i øjeblikket i flere undertyper baseret på histopatologisk og molekylær evaluering af den primære tumor. Bedre subtype stratificering har forbedret patientresultater med subtype-specifikke behandlingsmuligheder2. For eksempel har identifikationen af HER2 som en proto-onkogen3 ført til udviklingen af Trastuzumab, hvilket har gjort denne meget aggressive undertype håndterbar hos de fleste patienter4. Yderligere forskning i genetik og transkriptomik af denne komplekse sygdom på en patientspecifik måde vil hjælpe med at udvikle og forudsige bedre patientspecifikke personaliserede behandlingsregimer 2,5. Patientafledte organoider (PDO'er) er en lovende ny model til at få indsigt i kræft på molekylært niveau, identificere nye mål eller biomarkører og designe nye behandlingsstrategier 6,7,8.
BOB'er er flercellede, tredimensionelle (3D) strukturer afledt af frisk resekterede primære vævsprøver 8,9. De dyrkes tredimensionelt ved at være indlejret i en hydrogelmatrix, typisk sammensat af en kombination af ekstracellulære matrix (ECM) proteiner, og kan derfor bruges til at studere tumorcelle-ECM-interaktioner. BDO'er repræsenterer patientdiversitet og rekapitulerer cellulær heterogenitet og genetiske egenskaber ved tumoren10,11,12. At være in vitro-modeller giver de mulighed for genetisk manipulation og lægemiddelskærme med høj kapacitet13,14,15. Endvidere kan BDO'er plausibelt bruges til at evaluere patientens lægemiddelfølsomhed og behandlingsstrategier parallelt med klinikken og hjælpe med at forudsige patientresultater16,17,18. Udover kemoterapi er visse organoidmodeller også blevet brugt til at undersøge individuelle patientresponser på kemostråling19,20. I betragtning af den lovende anvendelighed af BDO'er til forskning og klinisk brug har National Cancer Institute initieret et internationalt konsortium, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, for at generere og levere disse tumorafledte nye kræftmodeller. Mange af de organoidmodeller af forskellige kræftformer, der er udviklet gennem HCMI, er tilgængelige via American Type Culture Collection (ATCC)22.
Normale brystorganoider har vist sig at bestå af forskellige epitelcellepopulationer, der er til stede i brystkirtlen 11,23 og tjener således som gode modeller til at studere grundlæggende biologiske processer, analysere drivermutationer, der forårsager tumorgenese, og til kræftcelle-afstamningsundersøgelser 6,15 . Brysttumororganoidmodeller er blevet brugt til at identificere nye mål, der er opmuntrende udsigter til at udvikle nye terapier, især for resistente tumorer24,25,26. Ved hjælp af patientafledte xenograft (PDX) og matchede PDX-afledte organoidmodeller (PDxO) af behandlingsresistente brysttumorer viste Guillen et al., at organoider er kraftfulde modeller for præcisionsmedicin, som kan udnyttes til at evaluere lægemiddelresponser og beslutninger om direkte terapi parallelt28. Desuden giver udviklingen af nye samkulturmetoder til dyrkning af BDO'er med forskellige immunceller27,28,29, fibroblaster 30,31 og mikrober 32,33 mulighed for at studere tumormikromiljøets indvirkning på kræftprogression. Mens mange sådanne co-kultur metoder aktivt etableres for BDO'er afledt af bugspytkirtlen eller kolorektal tumorer, lignende etablerede co-kultur metoder til bryst BDO'er er kun blevet rapporteret for naturlige dræberceller34 og fibroblaster35.
Den første biobank med >100 patientafledte organoider, der repræsenterer forskellige brystkræftundertyper, blev udviklet af Hans Clevers-gruppen36,37. Som en del af denne indsats udviklede Clevers-gruppen også det første komplekse dyrkningsmedium til brystorganoidvækst, som i øjeblikket er meget udbredt36. En opfølgende undersøgelse gav en omfattende redegørelse for etablering og dyrkning af bryst-BOB'er og patientafledte organoide xenotransplantater (PDOX'er)38. Welm-laboratoriet udviklede en stor samling BC PDX-modeller og PDxO'er, der dyrkes i et forholdsvis enklere vækstmedium indeholdende føtalt bovint serum (FBS) og færre vækstfaktorer39,40. Vi har selvstændigt udviklet og karakteriseret en lang række naive patientafledte brystkræftorganoidmodeller11 og deltaget i udviklingen af BC BOB-modeller som en del af HCMI-initiativet21. Her sigter vi mod at give en praktisk vejledning, der beskriver den metode, vi anvender til at generere patientafledte brystorganoidmodelsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumorresektioner fra brystkræftpatienter sammen med det distale og tilstødende normale væv blev opnået fra Northwell Health i overensstemmelse med Institutional Review Board-protokollerne IRB-03-012 og IRB 20-0150 og med skriftligt informeret samtykke fra patienterne.
BEMÆRK: Alle nedenstående procedurer blev udført i et BSL2-rum til pattedyrsvævskultur, der er udpeget til patientprøver efter godkendelse fra biosikkerhedsudvalget. Alle procedurer skal udføres i henhold til sikkerhedsprotokoller, der opretholder aseptiske forhold i biosikkerhedsskabe. Hvert centrifugeringstrin udføres ved stuetemperatur (RT), medmindre andet er angivet. Væv/organoider og kældermembranmatrixstammer placeres altid på is, medmindre andet er angivet. Nye plader inkuberes natten over til foropvarmning. Belægning af kupler på forvarmede plader sikrer de bedste resultater for at opnå afrundede kupler, der ikke flader ud, mens plettering eller løfter senere fra pladeoverfladen.
1. Medium forberedelse og opskrifter
- Forbered R-spondin1 konditionerede medier som beskrevet nedenfor (alternativt kan købes kommercielt).
- Forbered to separate vækstmedier sammensat af Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM), 10% FBS, 5% penicillin-streptomycin og med eller uden 300 μg / ml zeocintilskud.
- Optø et hætteglas med HEK293T-HA-Rspondin1-Fc-celler (opnået fra Calvin Kuos laboratorium ved Stanford University og også kommercielt tilgængeligt) i en 75 cm2 vævskulturkolbe med 15 ml medium.
- Opdel cellerne i 2 x 175 cm2 dyrkningskolber, hver med 35 ml medium indeholdende zeocin.
- Cellerne ledes igen for at opnå så mange kolber, som der er behov for til generering af det ønskede parti R-spondin1-konditioneret medium. Brug vækstmedium uden zeocin.
- Når kolberne, der indeholder medium uden zeocin, er sammenflydende, fjernes og erstattes vækstmediet med Ad-DF+++ (trin 1.2; Tabel 1). Anbring cellerne i en 37 °C inkubator med 5% CO2 i 1 uge.
- Drej mediet ned ved 400 x g i 5 minutter for at fjerne eventuelle ikke-fastgjorte celler. Filtrer mediet gennem et 0,22 μm filter. Lav 25 ml alikvoter og opbevar dem ved -20 °C (kan opbevares i op til 6 måneder).
- Brug HEK293T-celler til at udføre et dobbelt luciferase TOPFLASH41,42-assay ved hjælp af et kommercielt DNA-transfektionsreagens ved et 4,8: 1-reagens til DNA-forhold med fortyndingsmidlet DMEM (højt glucose, pyruvat). Der tilsættes 100 μL R-spondin1-konditioneret substrat (eller basalmedium til negativ kontrol) til 100 μL transfekterede celler. Udfør derefter det dobbelte luciferase-assay i henhold til producentens protokol for at verificere Wnt-aktivitet af det R-spondin1-konditionerede medium.
BEMÆRK: Assayet bruger et TOP-plasmid med Firefly luciferase aktivitetsaflæsning, og FOP-plasmidet bruges som en negativ kontrol.
- Forbered basalmedium (Ad-DF+++ medium, som tidligere offentliggjort af Sachs et al.36).
Reagens Lagerkoncentration Endelig koncentration Avanceret DMEM/F12 1x 1x GlutaMax 100x 1x HEPES 1 m 10 mM Penicillin-streptomycin 10.000 U/ml; 10.000 μg/ml 100 U/ml; 100 μg/ml
Tabel 1: Basal Ad-DF+++ medium sammensætning. - Forbered komplet medium til patientafledte brystorganoider som tidligere offentliggjort af Sachs et al.36.
Reagens Lagerkoncentration Endelig koncentration Ad-DF+++ medium 1x 1x R-spondin internt 100% 10% B-27 tillæg 50x 1x Nicotinamid 1 m 5 mM NAC 500 mM 1,25 mM Primocin 50 mg/ml 50 μg/ml Noggin 100 μg/ml 100 ng/ml EGF til mænd 5 μg/ml 5 ng/ml Humant Heregulin β1/Neuregulin1 75 μg/ml 37,5 ng/ml Y-27632 Dihydrochlorid (rho-kinase) 100 mM 5 μM A83-01 5 mM 500 nM Humant FGF-7 100 μg/ml 5 ng/ml Menneskelig FGF-10 1 mg/ml 20 ng/ml p38i 30 mM 498 nM
Tabel 2: Komplet medium sammensætning for patientafledte brystorganoider. - Forbered 2 mg / ml collagenase IV opløsning ved at veje den nødvendige mængde collagenase IV pulver og opløse det i Ad-DF +++ basalmedium. Filtrer gennem et 0,22 μm filter før brug.
- Forbered 0,5% bovin serumalbumin (BSA) opløsning fra 7,5% stamopløsning ved anvendelse af 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) som fortyndingsmiddel. Filtrer gennem et 0,22 μm filter før brug.
2. Etablering af brysttumor/normale organoider fra resekteret væv (figur 1)
- Transport en kirurgisk resekteret brysttumor / normal vævsprøve til laboratoriet i et 50 ml konisk rør indeholdende Ad-DF +++. Opbevar røret på is indtil isolationens begyndelse.
- Optø en flaske kældermembranmatrix på is eller natten over ved 4 °C.
- Overfør det resekterede væv til en 10 cm steril petriskål. Undersøg vævet makroskopisk og noter, om det forekommer morfologisk fedtholdigt, vaskulariseret eller nekrotisk. Derudover skal du registrere vævets størrelse og form. Ideelt set skal du tage et billede af vævet med en lineal i betragtning (figur 2).
- Hak vævet i meget små stykker (~ 1 mm3) med en steril nr. 10 skalpel, og overfør det til et 50 ml konisk rør.
- Tilsæt 10 ml 2 mg/ml collagenase IV opløsning og forsegl tuben med en gennemsigtig film. Placer røret på en orbitalryster ved 37 °C ved 140 omdr./min. i 30-90 minutter i en vinklet position (~30° vinkel).
- Under inkubationen anbringes en prøve af komplet substrat til forvarmning i et 37 °C perle-/vandbad.
- Hvert 15. minut resuspenderes vævet ved at blande kraftigt op og ned med en 5 ml steril serologisk pipette. Fortræk pipetten med 0,5 % BSA-opløsning for at forhindre tab af væv forårsaget af, at prøven klæber til pipetten. Overvåg dissociation over tid ved at observere det koniske rør under mikroskopet ved en 5x eller højere forstørrelse.
- Når vævet er dissocieret, centrifugeres ved 400 x g i 5 min. Supernatanten suges, der tilsættes 10 ml Ad-DF+++, og centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter.
- Supernatanten kasseres forsigtigt. Vævspiller kan lejlighedsvis være løse, så vær forsigtig, når du aspirerer. Gentag trinnet igen.
- Hvis vævspiller er delvist rød, tilsættes 2 ml røde blodlegemer lysisbuffer og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Inkuber ikke længere, da dette vil reducere cellelevedygtigheden betydeligt.
- Der tilsættes 10 ml Ad-DF+++ til glasset, centrifugeres ved 400 x g i 5 min, og supernatanten kasseres. Resuspender pellet i 50-300 μL ufortyndet, kold kældermembranmatrix og bland ved pipettering omhyggeligt for at undgå dannelse af bobler.
BEMÆRK: Volumenet af den tilsatte kældermembranmatrix afhænger af pelletstørrelsen. Hvis du er usikker, skal du plade en lille kuppel på ~ 10 μL fra den opslæmmede pellet og observere sammenløbet under mikroskopet. Juster ved at tilføje mere kældermembranmatrix, hvis det er nødvendigt. Se figur 3 (dag 1-billede) for en referencesåtæthed. - Plade 300 μL kældermembranmatrixkuppel indeholdende organoider i hver brønd i en forvarmet, mærket 6-brønds vævskulturplade. Se tabel 3 for anbefalet kældermembranmatrix og mellemstore volumener, hvis der anvendes forskellige plader.
Antal brønde pr. plade Membranmatrix i kælderen pr. kuppel (μL) Medium pr. hul (μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (ophæng i stedet for kuppel) 100
Tabel 3: Anbefalet mængde kældermembranmatrix og vækstmedium pr. brønd baseret på pladestørrelse. - Lad pladen stå uforstyrret i emhætten i 5 min, og læg den derefter forsigtigt i inkubatoren ved 37 °C i 20-30 minutter, så kældermembranmatrixkuplen størkner helt.
- Der tilsættes 3 ml forvarmet komplet substrat dråbevis til hvert hul i en 6-brønds plade og anbringes i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Tag billeder af organoiderne ved hjælp af et 5x mål på et omvendt brightfield-mikroskop.
- Genopfyld mediet hver 4-8 dage baseret på væksten af organoider. Aspirer forsigtigt det gamle medium uden at forstyrre kuplen, og tilsæt frisk, forvarmet medium dråbevis.
BEMÆRK: Protokollen er den samme for etablering af brystkræftorganoider afledt af den resekterede tumor og for normale organoider afledt af resekteret sundt brystvæv (enten fra tilstødende og normalt brystvæv fra den samme patient eller sundt brystvæv opnået fra en reduktiv mammoplastikkirurgi).
3. Passaging og udvidelse af patientafledte brystorganoider i kultur
- Optø en flaske kældermembranmatrix på is eller natten over ved 4 °C.
- Løft kældermembranmatrixkuplen ind i mediet i brønden ved hjælp af en celleskraber eller en 1 ml pipettespids.
- Fortræk pipettespidsen med 0,5% BSA-opløsning, og overfør derefter organoidernes flydende kuppel med medium til et 15 ml eller 50 ml konisk rør, afhængigt af antallet af brønde, der høstes. For mere end to brønde, der indeholder 300 μL kældermembranmatrixkupler, skal du bruge et 50 ml konisk rør. Tilføj 1x DPBS for at øge lydstyrken til mindst 5 ml.
- Drej rørene ved 400 x g i 5 min. Kældermembranmatrixen med organoider danner et lag i bunden. Der suges forsigtigt til fjernelse af supernatanten.
- Tilføj 5-20 ml 1x DPBS, afhængigt af antallet af brønde samlet i et rør. Forbelæg en steril engangspipette med 0,5% BSA, og bland organoid-kældermembranmatrixpelleten i DPBS ensartet ved pipettering op og ned.
- Drej rørene ved 400 x g i 5 min. Supernatanten suges forsigtigt og kasseres.
- Tilsæt celledissociationsreagens ved tre gange volumenet af kældermembranmatrixen til røret. Brug en 0,5% BSA-belagt pipettespids til at resuspendere organoiderne i celledissociationsreagenset.
- Røret anbringes på en orbitalryster ved 37 °C ved 140 o/min i 8-15 minutter i en vinklet position. Overvåg røret ved at observere det under mikroskopet hvert 5. minut for at sikre, at organoiderne nedbrydes i mindre klynger.
- Tilsæt basalmedium (dvs. Ad-DF+++) med et volumen, der er lig med eller større end celledissociationsreagenset, og pipette for at blande organoiderne. Spin ved 400 x g i 5 minutter ved RT for at opnå en organoid pellet.
- Hvis pellet indeholder organoider, der stadig er indlejret i den uopløste kældermembranmatrix, gentages trin 3.7-3.9 i yderligere 5-8 minutters trypsinisering.
- Når der er fremstillet en hvid organoid pellet uden uopløst kældermembranmatrix, kasseres supernatanten, og der tilsættes 1 ml Ad-DF+++ for at resuspendere pelleten ved pipettering. Tilføj derefter mere Ad-DF+++ op til 10 ml.
- Spin ved 400 x g i 5 minutter ved RT til vasketrinnet. Opsug supernatanten og kassér den.
- Tilsæt den nødvendige mængde kældermembranmatrix til de fordøjede organoider baseret på det passende splitforhold (dette vil variere meget for hver organoidlinje baseret på væksthastighed). Se figur 3 (dag 1-billede) for et eksempel på såtæthed. Bland ved forsigtigt at pipettere op og ned for at undgå at skabe bobler. Placer straks på is.
- Åbn og mærk en forvarmet plade med 6 brønde. Det anbefales at plade en 10-20 μL kuppel i hjørnet af en brønd for at observere sammenløbet under mikroskopet. Hvis organoiderne er sammenflydende, kan der tilsættes mere kældermembranmatrix for at øge splitforholdet.
- Plade 300 μL kupler af organoider ophængt i kældermembranmatrix. Sørg for at holde røret på is, mens du pletterer flere brønde, så kældermembranmatrixen forbliver i opløsning.
- Lad pladen stå uforstyrret i emhætten i 5 minutter og læg den derefter forsigtigt i en 37 °C inkubator med 5% CO2 uden at forstyrre kuplerne.
- Efter 20-30 minutter størkner kuplerne. Tilsæt 3 ml forvarmet komplet medium til hver brønd og læg pladen tilbage i inkubatoren. Tilsæt frisk komplet medium hver 5-7 dage. Udfør rutinemæssig test af kulturerne til påvisning af mycoplasmakontaminering.
BEMÆRK: Protokollen for dyrkning af brysttumorer og normale organoider er den samme. Men efter vores erfaring har normale organoider tendens til at vokse godt op til passage 6-8, før de bremser. Det er tilrådeligt at lave så mange tidlige passagebestande som muligt til fremtidig forskning.
4. Frysning af patientafledte brystorganoider
- Passage sammenflydende brønde af organoider for at fjerne enhver kældermembranmatrix, som angivet i trin 3.1-3.12.
- Resuspender pellet af organoider i cellefrysemedium (optøet natten over ved 4 ºC) med 1 ml medium pr. 200-300 μL kældermembranmatrixvolumen før passage. Udfør en celletælling før frysning til reference. Aliquot et lille volumen (mindst 100 μL) celler til at gennemgå yderligere trypsinisering, hvis det er nødvendigt, for at få enkeltceller, og tæl dem derefter ved hjælp af en celletællermaskine.
- Overfør 1 ml celler til 2 ml kryovialer mærket med organoid linjenummer, dato og passagenummer. Sørg for at mærke rørene med en permanent markør eller brug kryoetiketter.
- Flyt hætteglassene til en cellefrysebeholder og overfør beholderen til en -80 °C fryser. Efter inkubation natten over er hætteglassene klar til at blive flyttet til en fryser til opbevaring af flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
5. Optøning af patientafledte brystorganoider
- Optø en flaske kældermembranmatrix på is eller natten over ved 4 °C. Forvarm Ad-DF+++ medium ved 37 °C. Alikvote 9 ml forvarmet substrat til 15 ml koniske reagensglas for hvert frosset hætteglas.
- Det frosne hætteglas med organoider tøs hurtigt op ved at anbringe det i et 37 °C perlebad. Spray 70% ethanol og overfør røret til biosikkerhedsskabet.
- Skyl pipettespidsen med 0,5% BSA-opløsning for at undgå organoidtab. Bland de optøede organoider forsigtigt ved pipettering op og ned for at blande eventuelle bundfældede organoider i røret.
- Overfør forsigtigt 1 ml frosne organoider til 9 ml forvarmet Ad-DF+++ på en dråbevis måde. Drej cellerne ved 400 x g i 5 minutter, og kassér derefter forsigtigt supernatanten.
- Vask pillen ved at tilsætte 10 ml frisk forvarmet Ad-DF+++ til den organoide pille, og bland forsigtigt med en pipette, der er forbelagt med 0,5% BSA for at resuspendere pelleten. Centrifuger cellerne ved 400 x g i 5 minutter og kassér forsigtigt supernatanten.
- Placer den organoide pellet på is og fjern eventuelle rester Ad-DF+++ forsigtigt ved hjælp af en pipettespids med mindre volumen. Resuspender pellet i 300 μL kældermembranmatrix og plade i en forvarmet 6-brønds plade. Pladen anbringes i en 37 °C inkubator med 5% CO2.
BEMÆRK: Det anbefales at plade en lille 10 μL kuppel fra den ophængte pellet i et hjørne af brønden for at skelne sammenløbet under mikroskopet. Hvis organoiderne ser sammenflydende ud, fortyndes ved at tilsætte 300 μL kældermembranmatrix til plade i to brønde i en 6-brøndplade. - Efter en 20-30 minutters inkubation tilsættes 3 ml forvarmet komplet medium til den størknede kuppel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har etableret en biobank af patientafledte brysttumororganoider, der omfatter forskellige undertyper11. Derudover har vi etableret flere normale brystorganoidlinjer afledt af reduktive mammoplastikvævsprøver eller tilstødende/distalt normalt bryst fra BC-patienter ved hjælp af den tilgang, der er skitseret i figur 1.
De forskellige patientafledte brysttumororganoidlinjer adskiller sig i deres morfologi (figur 2) og væksthastighed (figur 3). Normale brystorganoider og de få tidlige duktale carcinoma in situ (DCIS) afledte organoider, vi har etableret, ligner den normale bryststruktur med et centralt lumen omgivet af duktale celler (figur 2A, B). Organoider afledt af et invasivt lobulært karcinom (figur 2C) har tendens til at danne løst vedhæftede druebundlignende strukturer, som tidligere rapporteret af andre laboratorier36,43. I mellemtiden har organoider afledt af invasive duktale karcinomer (hormonreceptor-positiv og tredobbelt negativ brystkræft) tendens til at danne tætte, store og runde organoider (figur 2D, E). Organoider blev fikseret med 4% paraformaldehyd efterfulgt af at blive indlejret i 2% agaroseforme. De blev derefter paraffin indlejret, og 10 μm sektioner blev farvet med hæmatoxylin og eosin (som beskrevet i Bhatia et al.11) for at observere morfologien.
For at demonstrere forskellene i væksthastigheden for forskellige patientafledte brysttumororganoidlinjer blev 1.000 levedygtige enkeltceller belagt i 10% kældermembranmatrixsuspensionsopløsning pr. 96-brøndplade med seks replikater hver for at bestemme cellelevedygtighed på forskellige tidspunkter for at overvåge væksten over en periode på 12 dage (figur 3B ). Den organoide dannelse blev målt ved hjælp af en selvlysende cellelevedygtighedsanalyse på dag 3, 6, 9 og 12 med en baselineaflæsning på dag 1 efter plettering. Figur 3A viser lysfeltbilleder af de samme organoider udvidet i 6-brøndplader over tid. Nogle patientafledte organoidlinjer har en fordoblingstid på 2 dage, mens nogle tager 5 dage (figur 3B).
Figur 1: Etablering af patientafledte brystorganoider . (A) Skematisk repræsentation af de vigtigste trin i etablering af patientafledte brysttumorer eller normale organoider. (B) Repræsentative billeder, der viser vækst af DS117T-patientafledte brysttumororganoider fra etablering (passage 0) til langtidsdyrkning (passage 12). Blå pile = fibrøst materiale, gule pile = snavs / døde celler og røde pile = understøttende celletyper fra mikromiljøet (hovedsageligt fibroblaster). Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Patientafledte brystorganoider, der repræsenterer forskellige undertyper. Toppanel: morfologiske forskelle mellem organoide linjer afledt af patientens brysttumorer (B-E) af forskellige histopatologiske og molekylære undertyper. (A) Figuren repræsenterer organoider afledt af normalt humant brystvæv opnået postreduktiv mammoplastikkirurgi. Skalabjælke = 50 μm. Nederste panel: H&E-farvede billeder af de samme organoide linjer. Skalabjælke = 100 μm. Forkortelse: TNBC = tredobbelt negativ brystkræft. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vækst i kultur af forskellige patientafledte brysttumororganoider. Repræsentative lysfeltbilleder og cellelevedygtighedskurver (A og B) målt via et selvlysende cellelevedygtighedsassay, der viser væksten i kultur af forskellige patientafledte brysttumororganoidlinjer over 12 dage. Skalabjælke = 50 μm. Fejlbjælker repræsenterer SEM for n = 6. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores laboratorium har med succes anvendt ovenstående protokoller til at etablere organoider fra naive tumorresektioner eller skrabninger. Vi har også brugt denne protokol til at udvikle normale organoider fra brystvæv opnået via reduktive mammoplastiker eller fra kræftpatienters tilstødende eller distale normale brystvæv. Omkring 30% -40% af de resekterede primære tumorer resulterede i vellykkede langsigtede (>passage 8) tumororganoidkulturer. De tumororganoide linjer, der tilspidsede efter et par passager, havde enten en udvækst af normale organoider eller stromale celler eller bestod hovedsageligt af ikke-proliferative tumorceller. Yderligere evaluering og modifikation af de mediumkomponenter, der i øjeblikket favoriserer epitelcelleudvækst, eller andre midler til forududvælgelse af tumorcellepopulationerne, bør forbedre succesraten for etablering og langsigtet kultur af BDO'er. Derudover anbefales det stærkt at fryse flere hætteglas med vellykkede udvidede organoider og udføre optøningstest på frosne hætteglas for hver etableret organoidlinje for at godkende deres langsigtede succes i kultur.
Nogle vellykkede organoidlinjer, der til tider bremser i kultur eller kæmper for at komme sig efter en optøning, har ofte gavn af at øge såtætheden. Højere sammenløb observeres for at hjælpe med at stimulere hurtigere vækst for de fleste linjer, sandsynligvis som følge af celle-celle-interaktioner eller udskillede faktorer. Derudover kan filtrering af organoiderne (efter trypsinisering) gennem et 70-100 μm filter hjælpe med at fjerne snavs akkumuleret fra døde organoider, der undertiden vises efter optøning af nogle organoide linjer og har tendens til at hindre deres vækst. Det skal dog bemærkes, at noget sundt organoidmateriale også går tabt i filtreringsprocessen. Visse organoidlinjer, der udtrykker østrogenreceptor (ER +), kan være langsomme dyrkere sammenlignet med TNBC og kan potentielt drage fordel af tilsætning af østradiol til mediet. Vi anbefaler, at de etablerede patientafledte brysttumororganoidlinjer karakteriseres genomisk og transkriptomisk. Dette kan gøres ved at anvende flere teknikker, såsom immunohistokemisk evaluering for de patologiske og genetiske egenskaber ved patienttumorer (ekspression af østrogenreceptor, progesteronreceptor, human epidermal vækstfaktor 2, Cadherin, Ki-67 osv.), RNA-sekventering, enkeltcelle RNA-sekventering, DNA-sekventering for kræftdrivergener, kopinummervariationer osv. For mekanistiske og lægemiddelresponsundersøgelser skal man overveje de specifikke hæmmere, der er komponenter i mediet, og eventuelle tidligere behandlinger, som patienten har modtaget før operationen.
Tumororganoidlinjer afledt af forskellige patienter varierer i genomiske mutationer, transkriptomik, morfologi, væksthastighed, kapacitet til at danne store organoider, tilstedeværelse af heterogene cellepopulationer osv. Disse forskelle udgør udfordringer med at etablere og dyrke dem, men de gør også organoider robuste modeller, der repræsenterer både patientdiversitet og tumorkompleksitet. Brysttumorafledte organoider har vist sig at rekapitulere de oprindelige patienttumorer på genomiske, transkriptomiske11,36 og metabolomiske niveauer44. Alle disse faktorer gør dem til kraftfulde værktøjer til lægemiddelscreening og præcisionsonkologi39. Patientafledte organoider er et spændende nyt modelsystem, der vil fungere som tredimensionelle in vitro-modeller til undersøgelse af kræftbiologi samt undersøgelse af terapeutisk vigtige spørgsmål for at fremme området for personlig medicin. Normale og tumorbrystorganoider kan genetisk modificeres via CRISPR-teknik15,38, hvilket får deres gunstige anvendelse til mekanistiske genetiske undersøgelser for tumorigenese og kræftprogression. Patientafledte brysttumororganoider er også blevet brugt til at udvikle xenograftmodeller 11,38,39, der potentielt kan efterligne tumorvækst hos patienter. Desuden forbliver patientafledte brysttumororganoide cokultursystemer et underudforsket forskningsområde, der kan give stærk indsigt i vigtigheden af krydstale mellem brystkræftceller og andre celler, såsom stromale kræftassocierede fibroblaster, immunceller, adipocytter osv. i tumorprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmer af Spector-laboratoriet for kritiske diskussioner i løbet af dette arbejde. Vi takker Norman Sachs og Hans Clevers (Hubrecht Institute, Holland) for oprindeligt at give os deres organoid dyrkningsprotokol. Vi anerkender CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources for tjenester og teknisk ekspertise (NCI 2P3OCA45508). Vi takker Dr. Qing Gao for hjælp med histologisk prøveforberedelse. Vi er taknemmelige for støtten fra Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) for at give patienter tumorprøver. Vi værdsætter også Northwell Health Biobanking-teamets indsats for prøvetagning, og vi takker patienterne og deres familier for at donere væv til forskning. Denne forskning blev støttet af CSHL / Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) og Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson og D.L.S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
- di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
- Hortobagyi, G. N., et al.
- Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
- Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. Á, Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
- Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
- Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
- Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- HCMI Catalog. , Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022).
- Search ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022).
- Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
- Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
- Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
- Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- HUB Organoids: Patient in the lab. , Available from: https://www.huborganoids.nl (2022).
- Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
- Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
- PDX Portal. , Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022).
- Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
- Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
- Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
- Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).
