Summary
Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Etablierung von humanen Brustorganoiden aus patienteneigenen Brusttumorresektionen oder normalem Brustgewebe bereitgestellt. Das Protokoll enthält eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Kultivieren, Einfrieren und Auftauen von Brustorganoiden aus menschlichen Patienten.
Abstract
Brustkrebs ist eine komplexe Erkrankung, die in verschiedene histologische und molekulare Subtypen eingeteilt wurde. Die in unserem Labor entwickelten Brusttumor-Organoide von Patientinnen bestehen aus einer Mischung mehrerer Tumorzellpopulationen und stellen daher eine bessere Annäherung an die Diversität und das Milieu der Tumorzellen dar als die etablierten 2D-Krebszelllinien. Organoide dienen als ideales In-vitro-Modell , das Zell-extrazelluläre Matrix-Interaktionen ermöglicht, von denen bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle bei Zell-Zell-Interaktionen und der Krebsprogression spielen. Von Patienten stammende Organoide haben auch Vorteile gegenüber Mausmodellen, da sie menschlichen Ursprungs sind. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass sie die genomische, transkriptomische sowie metabolische Heterogenität von Patiententumoren rekapitulieren; Damit sind sie in der Lage, sowohl die Tumorkomplexität als auch die Patientenvielfalt abzubilden. Dadurch sind sie in der Lage, genauere Einblicke in die Entdeckung und Validierung von Zielmolekülen sowie in Tests zur Arzneimittelempfindlichkeit zu liefern. In diesem Protokoll zeigen wir detailliert, wie aus resezierten Brusttumoren (Krebsorganoide) oder aus reduktiver Mammoplastik gewonnenem Brustgewebe (normale Organoide) Brustorganoide von Patientinnen hergestellt werden. Darauf folgt eine umfassende Darstellung der 3D-Organoidkultur, der Expansion, des Durchgangs, des Einfrierens sowie des Auftauens von Brustorganoidkulturen aus der Brust.
Introduction
Brustkrebs ist die am häufigsten auftretende bösartige Erkrankung bei Frauen, wobei im Jahr 2022 schätzungsweise 287.850 neue Fälle in den Vereinigten Staaten diagnostiziert wurden1. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Früherkennung mit jährlichen Screenings, zielgerichteten Therapien und einem besseren Verständnis der genetischen Veranlagung ist sie in den Vereinigten Staaten mit jährlich >40.000 Todesfällen auf Brustkrebs zurückzuführen die zweithäufigste Krebstodesursache bei Frauen1. Brustkrebs wird derzeit auf der Grundlage histopathologischer und molekularer Untersuchungen des Primärtumors in mehrere Subtypen eingeteilt. Eine bessere Subtyp-Stratifizierung hat die Patientenergebnisse mit subtypspezifischen Behandlungsoptionen verbessert2. So hat beispielsweise die Identifizierung von HER2 als Proto-Onkogen3 zur Entwicklung von Trastuzumab geführt, das diesen hochaggressiven Subtyp bei den meisten Patientinnen beherrschbar gemacht hat4. Weitere patientenspezifische Forschungen zur Genetik und Transkriptomik dieser komplexen Erkrankung werden dazu beitragen, bessere patientenspezifische, personalisierte Behandlungsschemata zu entwickeln und vorherzusagen 2,5. Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) sind ein vielversprechendes neues Modell, um Einblicke in Krebs auf molekularer Ebene zu gewinnen, neue Ziele oder Biomarker zu identifizieren und neue Behandlungsstrategien zu entwickeln 6,7,8.
PDOs sind mehrzellige, dreidimensionale (3D) Strukturen, die aus frisch resezierten primären Gewebeproben gewonnen werden 8,9. Sie werden dreidimensional gezüchtet, indem sie in eine Hydrogelmatrix eingebettet werden, die typischerweise aus einer Kombination von Proteinen der extrazellulären Matrix (EZM) besteht, und können daher zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Tumorzellen und EZM verwendet werden. PDOs repräsentieren die Patientenvielfalt und rekapitulieren die zelluläre Heterogenität und die genetischen Merkmale des Tumors10,11,12. Da es sich um In-vitro-Modelle handelt, ermöglichen sie genetische Manipulation und Hochdurchsatz-Wirkstoffscreenings13,14,15. Darüber hinaus können PDOs plausibel eingesetzt werden, um die Medikamentensensitivität und Behandlungsstrategien von Patienten parallel zur Klinik zu bewerten und dabei zu helfen, Patientenergebnisse vorherzusagen16,17,18. Neben der Chemotherapie wurden auch bestimmte Organoidmodelle verwendet, um das individuelle Ansprechen von Patienten auf die Chemobestrahlung zu untersuchen19,20. Angesichts der vielversprechenden Anwendbarkeit von PDOs für die Forschung und den klinischen Einsatz hat das National Cancer Institute ein internationales Konsortium, die Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, ins Leben gerufen, um diese neuartigen Krebsmodelle zu generieren und bereitzustellen. Viele der Organoid-Modelle verschiedener Krebsarten, die im Rahmen des HCMI entwickelt wurden, sind über die American Type Culture Collection (ATCC)22 erhältlich.
Es hat sich gezeigt, dass normale Brustorganoide aus verschiedenen Epithelzellpopulationen bestehen, die in der Brustdrüse vorhanden sind 11,23 und daher als hervorragende Modelle für die Untersuchung grundlegender biologischer Prozesse, für die Analyse von Treibermutationen, die die Tumorentstehung verursachen, und für Studien zur Abstammungslinie von Krebszellen dienen 6,15 . Organoidmodelle für Brusttumore wurden verwendet, um neue Angriffspunkte zu identifizieren, die vielversprechende Aussichten für die Entwicklung neuer Therapien, insbesondere für resistente Tumore, darstellen24,25,26. Guillen et al. zeigten unter Verwendung von patientenabgeleiteten Xenotransplantat- (PDX) und PDX-abgeleiteten Organoidmodellen (PDxO) von behandlungsresistenten Brusttumoren, dass Organoide leistungsstarke Modelle für die Präzisionsmedizin sind, die genutzt werden können, um das Ansprechen auf Arzneimittel zu bewerten und Therapieentscheidungen parallel zu treffen28. Darüber hinaus bietet die Entwicklung neuer Kokulturmethoden zur Kultivierung von PDOs mit verschiedenen Immunzellen27,28,29, Fibroblasten 30,31 und Mikroben32,33 die Möglichkeit, den Einfluss der Tumormikroumgebung auf die Krebsprogression zu untersuchen. Während viele solcher Kokulturmethoden aktiv für PDOs etabliert werden, die aus Pankreas- oder Kolorektaltumoren gewonnen werden, wurden ähnliche etablierte Kokulturmethoden für Brust-PDOs nur für natürliche Killerzellen34 und Fibroblasten35 berichtet.
Die erste Biobank mit >100 patienteneigenen Organoiden, die verschiedene Brustkrebs-Subtypen repräsentieren, wurde von der Hans-Clevers-Gruppe entwickelt36,37. Im Rahmen dieser Bemühungen entwickelte die Clevers-Gruppe auch das erste komplexe Nährmedium für das Wachstum von Brustorganoiden, das derzeit weit verbreitet ist36. Eine Folgestudie lieferte einen umfassenden Überblick über die Etablierung und Kultur von Brust-PDOs und patienteneigenen Organoid-Xenotransplantaten (PDOXs)38. Das Welm-Labor entwickelte eine große Sammlung von BC PDX-Modellen und PDxOs, die in einem vergleichsweise einfacheren Nährmedium kultiviert werden, das fötales Kälberserum (FBS) und weniger Wachstumsfaktoren enthält39,40. Wir haben unabhängig voneinander eine große Anzahl von naiven patientenabgeleiteten Brustkrebs-Organoidmodellenentwickelt und charakterisiert 11 und waren im Rahmen der HCMI-Initiative21 an der Entwicklung von BC-PDO-Modellen beteiligt. Hier möchten wir einen praktischen Leitfaden zur Verfügung stellen, der die von uns verwendete Methodik zur Erstellung von patientenabgeleiteten Brustorganoid-Modellsystemen detailliert beschreibt.
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Protocol
Tumorresektionen von Brustkrebspatientinnen, zusammen mit dem distalen und angrenzenden Normalgewebe, wurden von Northwell Health in Übereinstimmung mit den Protokollen IRB-03-012 und IRB 20-0150 des Institutional Review Board und mit schriftlicher Einverständniserklärung der Patientinnen durchgeführt.
HINWEIS: Alle unten genannten Verfahren wurden nach Genehmigung des Ausschusses für biologische Sicherheit in einem BSL2-Raum für Säugetiergewebekulturen durchgeführt, der für Patientenproben vorgesehen ist. Alle Verfahren sollten nach Sicherheitsprotokollen durchgeführt werden, die aseptische Bedingungen in Biosicherheitswerkbänken aufrechterhalten. Jeder Zentrifugationsschritt wird, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Gewebe/Organoide und Basalmembranmatrixbestände werden immer auf Eis gelegt, sofern nicht anders angegeben. Neue Platten werden zum Vorwärmen über Nacht inkubiert. Das Plattieren von Kuppeln auf vorgewärmten Platten sorgt für die besten Ergebnisse, um abgerundete Kuppeln zu erhalten, die beim Plattieren nicht abflachen oder später von der Plattenoberfläche abheben.
1. Mittlere Zubereitung und Rezepte
- Stellen Sie R-Spondin1-konditionierte Medien wie unten beschrieben her (alternativ im Handel erhältlich).
- Bereiten Sie zwei separate Nährböden vor, die aus Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), 10 % FBS, 5 % Penicillin-Streptomycin und mit oder ohne 300 μg/ml Zeocin-Supplementierung bestehen.
- Tauen Sie ein Fläschchen mit HEK293T-HA-Rspondin1-Fc-Zellen (bezogen aus Calvin Kuos Labor an der Stanford University und auch im Handel erhältlich) in einem 75 cm2 Gewebekulturkolben mit 15 ml Medium auf.
- Teilen Sie die Zellen in 2 x 175 cm2 Kulturflaschen mit jeweils 35 ml zeocinhaltigem Medium auf.
- Durchlaufen Sie die Zellen erneut, um so viele Kolben zu erhalten, wie für die Erzeugung der gewünschten Charge des R-Spondin1-konditionierten Mediums erforderlich sind. Verwenden Sie ein Nährmedium ohne Zeocin.
- Wenn die Kolben mit dem Medium ohne Zeocin konfluent sind, entfernen Sie das Nährmedium und ersetzen Sie es durch Ad-DF+++ (Schritt 1.2; Tabelle 1). Legen Sie die Zellen für 1 Woche in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5% CO2 .
- Drehen Sie das Medium bei 400 x g für 5 Minuten herunter, um alle nicht anhaftenden Zellen zu entfernen. Filtern Sie das Medium durch einen 0,22 μm Filter. Stellen Sie 25 ml Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C (bis zu 6 Monate haltbar).
- Führen Sie unter Verwendung von HEK293T-Zellen einen dualen Luciferase-TOPFLASH41,42-Assay mit einem handelsüblichen DNA-Transfektionsreagenz in einem Reagenz-zu-DNA-Verhältnis von 4,8:1 mit dem Verdünnungsmittel DMEM (hohe Glukose, Pyruvat) durch. Fügen Sie 100 μl R-Spondin1-konditioniertes Medium (oder Basalmedium für die Negativkontrolle) zu 100 μl transfizierten Zellen hinzu. Führen Sie dann den dualen Luciferase-Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers durch, um die Wnt-Aktivität des R-Spondin1-konditionierten Mediums zu überprüfen.
HINWEIS: Der Assay verwendet ein TOP-Plasmid mit Firefly-Luciferase-Aktivitätsanzeige, und das FOP-Plasmid wird als Negativkontrolle verwendet.
- Präparation von Basalmedium (Ad-DF+++ Medium, wie bereits von Sachs et al.36 veröffentlicht).
Reagenz Bestandskonzentration Endkonzentration DMEM/F12 für Fortgeschrittene 1x 1x GlutaMax 100-fach 1x HEPES 1 Mio. 10 mM Penicillin-Streptomycin 10.000 U/ml; 10.000 μg/ml 100 U/ml; 100 μg/ml
Tabelle 1: Zusammensetzung des basalen Ad-DF+++ Mediums. - Bereiten Sie ein komplettes Medium für Brustorganoide vor, die von Patientinnen stammen, wie sie zuvor von Sachs et al.36 veröffentlicht wurden.
Reagenz Bestandskonzentration Endkonzentration Ad-DF+++ mittel 1x 1x R-Spondin im eigenen Haus 100% 10% B-27 Zuschlag 50-fach 1x Nicotinamid 1 Mio. 5 mM NAC 500 mM 1,25 mM Primocin 50 mg/ml 50 μg/ml Birne 100 μg/ml 100 ng/ml EGF für Humanfragen 5 μg/ml 5 ng/ml Humanes Heregulin β1/Neuregulin1 75 μg/ml 37,5 ng/ml Y-27632 Dihydrochlorid (Rho-Kinase) 100 mM 5 μM A83-01 5 mM 500 nM Menschliches FGF-7 100 μg/ml 5 ng/ml Menschliches FGF-10 1 mg/ml 20 ng/ml P38i 30 mM 498 nM
Tabelle 2: Vollständige Mediumzusammensetzung für von Patientinnen gewonnene Brustorganoide. - Bereiten Sie 2 mg/ml Kollagenase-IV-Lösung vor, indem Sie die erforderliche Menge Kollagenase-IV-Pulver wiegen und in Ad-DF+++ Basalmedium solubilisieren. Vor Gebrauch durch einen 0,22 μm Filter filtern.
- Bereiten Sie 0,5 %ige Rinderserumalbuminlösung (BSA) aus 7,5 %iger Stammlösung unter Verwendung von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco als Verdünnungsmittel zu. Vor Gebrauch durch einen 0,22 μm Filter filtern.
2. Etablierung von Brusttumoren/normalen Organoiden aus reseziertem Gewebe (Abbildung 1)
- Transportieren Sie eine operativ resezierte Brusttumor-/Normalgewebeprobe in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit Ad-DF+++ ins Labor. Lagern Sie das Röhrchen bis zum Beginn der Isolierung auf Eis.
- Tauen Sie eine Flasche Basalmembranmatrix auf Eis oder über Nacht bei 4 °C auf.
- Übertragen Sie das resezierte Gewebe in eine 10 cm sterile Petrischale. Untersuchen Sie das Gewebe makroskopisch und notieren Sie sich, ob es morphologisch fettig, vaskularisiert oder nekrotisch erscheint. Notieren Sie zusätzlich die Größe und Form des Gewebes. Idealerweise machen Sie ein Foto des Gewebes mit einem Lineal im Blick (Abbildung 2).
- Hacken Sie das Gewebe mit einem sterilen Skalpell Nr. 10 in sehr kleine Stücke (~1 mm3) und übertragen Sie es in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
- Fügen Sie 10 ml 2 mg/ml Kollagenase-IV-Lösung hinzu und verschließen Sie das Röhrchen mit einer transparenten Folie. Legen Sie das Röhrchen auf einen Orbitalschüttler bei 37 °C bei 140 U/min für 30-90 min in einer abgewinkelten Position (~30° Winkel).
- Während der Inkubation wird ein Aliquot des vollständigen Mediums zum Vorwärmen in ein 37 °C heißes Perlen-/Wasserbad gegeben.
- Resuspendieren Sie das Gewebe alle 15 Minuten, indem Sie es mit einer sterilen serologischen 5-ml-Pipette kräftig auf und ab mischen. Beschichten Sie die Pipette mit 0,5%iger BSA-Lösung, um Gewebeverlust zu vermeiden, der durch das Anhaften der Probe an der Pipette verursacht wird. Überwachen Sie die Dissoziation im Laufe der Zeit, indem Sie den konischen Tubus unter dem Mikroskop mit einer 5-fachen oder höheren Vergrößerung betrachten.
- Sobald das Gewebe dissoziiert ist, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 400 x g . Saugen Sie den Überstand an, fügen Sie 10 ml Ad-DF+++ hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 400 x g .
- Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Gewebekügelchen können gelegentlich locker sein, seien Sie also vorsichtig beim Absaugen. Wiederholen Sie den Schritt noch einmal.
- Wenn das Gewebepellet teilweise rot ist, fügen Sie 2 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie nicht länger, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen erheblich verringert.
- Geben Sie 10 ml Ad-DF+++ in das Röhrchen, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 400 x g und verwerfen Sie den Überstand. Das Pellet wird in 50-300 μl unverdünnter, kalter Basalmembranmatrix resuspendiert und durch sorgfältiges Pipettieren gemischt, um Blasenbildung zu vermeiden.
HINWEIS: Das Volumen der hinzugefügten Basalmembranmatrix hängt von der Pelletgröße ab. Wenn Sie sich nicht sicher sind, legen Sie eine kleine Kuppel von ~10 μl aus dem resuspendierten Pellet und beobachten Sie die Konfluenz unter dem Mikroskop. Passen Sie es an, indem Sie bei Bedarf weitere Basalmembranmatrix hinzufügen. In Abbildung 3 (Bild von Tag 1) finden Sie eine Referenz-Seeding-Dichte. - Platte 300 μl der Basalmembranmatrixkuppel mit Organoiden in jeder Vertiefung einer vorgewärmten, markierten 6-Well-Gewebekulturplatte. In Tabelle 3 finden Sie die empfohlene Basalmembranmatrix und das mittlere Volumen, wenn verschiedene Platten verwendet werden.
Anzahl der Wells pro Platte Basalmembranmatrix pro Kuppel (μL) Medium pro Well (μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (Aufhängung statt Dom) 100
Tabelle 3: Die empfohlene Menge an Basalmembranmatrix und Wachstumsmedium pro Vertiefung basierend auf der Plattengröße. - Lassen Sie die Platte 5 min ungestört in der Haube und stellen Sie sie dann vorsichtig für 20-30 min bei 37 °C in den Inkubator, damit sich die Membranmatrixkuppel im Grundgebirge vollständig verfestigen kann.
- Geben Sie 3 ml vorgewärmtes komplettes Medium tropfenweise in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und stellen Sie es bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator. Nehmen Sie Bilder der Organoide mit einem 5-fach-Objektiv an einem inversen Hellfeldmikroskop auf.
- Füllen Sie das Medium alle 4-8 Tage auf, basierend auf dem Wachstum der Organoide. Saugen Sie das alte Medium vorsichtig an, ohne die Kuppel zu stören, und fügen Sie frisches, vorgewärmtes Medium tropfenweise hinzu.
HINWEIS: Das Protokoll ist das gleiche für die Etablierung von Brustkrebs-Organoiden, die aus dem resezierten Tumor gewonnen werden, und für normale Organoide, die aus reseziertem gesundem Brustgewebe gewonnen werden (entweder aus benachbartem und normalem Brustgewebe derselben Patientin oder aus gesundem Brustgewebe, das aus einer reduktiven Mammoplastik gewonnen wurde).
3. Verabschiedung und Expansion von patienteneigenen Brustorganoiden in Kultur
- Tauen Sie eine Flasche Basalmembranmatrix auf Eis oder über Nacht bei 4 °C auf.
- Heben Sie die Basalmembranmatrixkuppel mit einem Zellschaber oder einer 1-ml-Pipettenspitze in das Medium im Well.
- Die Pipettenspitze wird mit 0,5%iger BSA-Lösung vorbeschichtet und dann die schwimmende Kuppel der Organoide mit Medium in ein konisches 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen übertragen, je nach Anzahl der geernteten Wells. Verwenden Sie für mehr als zwei Vertiefungen mit 300 μl Basalmembranmatrixkuppeln ein konisches 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 1x DPBS hinzu, um das Volumen auf mindestens 5 ml zu erhöhen.
- Schleudern Sie die Röhrchen bei 400 x g für 5 Minuten. Die Basalmembranmatrix mit Organoiden bildet am Boden eine Schicht. Vorsichtig absaugen, um den Überstand zu entfernen.
- Fügen Sie 5-20 ml 1x DPBS hinzu, abhängig von der Anzahl der Vertiefungen, die sich in einem Röhrchen befinden. Beschichten Sie eine sterile Einwegpipette mit 0,5 % BSA und mischen Sie das organoid-basal-Membranmatrix-Pellet in DPBS gleichmäßig durch Auf- und Abpipettieren.
- Schleudern Sie die Röhrchen bei 400 x g für 5 Minuten. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn.
- Geben Sie das Zelldissoziationsreagenz mit dem dreifachen Volumen der Basalmembranmatrix in das Röhrchen. Resuspendieren Sie die Organoide im Zelldissoziationsreagenz mit einer 0,5 % BSA-beschichteten Pipettenspitze.
- Legen Sie das Röhrchen auf einen Orbitalschüttler bei 37 °C bei 140 U/min für 8-15 min in abgewinkelter Position. Überwachen Sie das Röhrchen, indem Sie es alle 5 Minuten unter dem Mikroskop beobachten, um sicherzustellen, dass die Organoide in kleinere Cluster zerlegt werden.
- Fügen Sie Basalmedium (d. h. Ad-DF+++) in einem Volumen hinzu, das gleich oder größer als das Zelldissoziationsreagenz ist, und pipettieren Sie, um die Organoide zu mischen. Bei 400 x g für 5 min bei RT schleudern, um ein Organoid-Pellet zu erhalten.
- Wenn das Pellet Organoide enthält, die noch in der ungelösten Basalmembranmatrix eingebettet sind, wiederholen Sie die Schritte 3.7-3.9 für weitere 5-8 Minuten der Trypsinisierung.
- Sobald ein weißes Organoid-Pellet ohne ungelöste Basalmembranmatrix erhalten wurde, verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml Ad-DF+++ hinzu, um das Pellet durch Pipettieren zu resuspendieren. Fügen Sie dann mehr Ad-DF+++ bis zu 10 ml hinzu.
- Für den Waschschritt bei 400 x g für 5 min bei RT schleudern. Saugen Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn.
- Fügen Sie den verdauten Organoiden die erforderliche Menge an Basalmembranmatrix hinzu, basierend auf dem entsprechenden Spaltungsverhältnis (dies variiert für jede Organoidlinie je nach Wachstumsrate stark). In Abbildung 3 (Bild von Tag 1) finden Sie ein Beispiel für die Aussaatdichte. Mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, um Blasen zu vermeiden. Sofort auf Eis legen.
- Öffnen und beschriften Sie eine vorgewärmte 6-Well-Platte. Es wird empfohlen, eine 10-20 μL Kuppel in der Ecke einer Vertiefung zu beschichten, um die Konfluenz unter dem Mikroskop zu beobachten. Wenn die Organoide konfluent sind, kann mehr Basalmembranmatrix hinzugefügt werden, um das Spaltungsverhältnis zu erhöhen.
- Platte 300 μL Kuppeln aus Organoiden, die in der Basalmembranmatrix resuspendiert wurden. Achten Sie darauf, das Röhrchen auf Eis zu halten, während Sie mehrere Vertiefungen plattieren, damit die Basalmembranmatrix in Lösung bleibt.
- Lassen Sie die Platte 5 min ungestört in der Haube und stellen Sie sie dann vorsichtig in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5% CO2 , ohne die Kuppeln zu stören.
- Nach 20-30 min erstarren die Kuppeln. Geben Sie 3 ml vorgewärmtes Komplettmedium in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Fügen Sie alle 5-7 Tage frisches Komplettmedium hinzu. Führen Sie routinemäßige Tests der Kulturen durch, um eine Mykoplasmenkontamination nachzuweisen.
HINWEIS: Das Protokoll für die Kultur von Brusttumoren und normalen Organoiden ist das gleiche. Unserer Erfahrung nach neigen normale Organoide jedoch dazu, bis zur Passage 6-8 gut zu wachsen, bevor sie langsamer werden. Es ist ratsam, so viele frühe Passagen wie möglich für zukünftige Forschungen anzulegen.
4. Einfrieren von Brustorganoiden aus der Patientin
- Durchgang konfluenter Vertiefungen von Organoiden, um jegliche Basalmembranmatrix zu entfernen, wie in den Schritten 3.1-3.12 angegeben.
- Resuspendieren Sie das Pellet aus Organoiden in Zellgefriermedium (über Nacht bei 4 ºC aufgetaut) mit 1 ml Medium pro 200-300 μl Basalmembranmatrixvolumen vor dem Durchleiten. Führen Sie eine Zellzählung durch, bevor Sie sie als Referenz einfrieren. Aliquotieren Sie ein kleines Volumen (mindestens 100 μl) von Zellen, um sie bei Bedarf einer weiteren Trypsinisierung zu unterziehen, um einzelne Zellen zu erhalten, und zählen Sie sie dann mit einem Zellzähler.
- Übertragen Sie 1 ml Zellen in 2-ml-Kryozellen, die mit der Organoid-Liniennummer, dem Datum und der Durchgangsnummer gekennzeichnet sind. Achten Sie darauf, die Röhrchen mit einem Permanentmarker zu beschriften oder Kryoetiketten zu verwenden.
- Legen Sie die Durchstechflaschen in einen Gefrierbehälter und stellen Sie den Behälter in einen Gefrierschrank bei -80 °C. Nach der Inkubation über Nacht können die Fläschchen zur Langzeitlagerung in einen Gefrierschrank mit flüssigem Stickstoff gebracht werden.
5. Auftauen von Brustorganoiden aus der Patientin
- Tauen Sie eine Flasche Basalmembranmatrix auf Eis oder über Nacht bei 4 °C auf. Ad-DF+++ medium bei 37 °C vorwärmen. Aliquotieren Sie 9 ml des vorgewärmten Mediums in konische 15-ml-Röhrchen für jede gefrorene Durchstechflasche.
- Tauen Sie die gefrorene Durchstechflasche mit Organoiden schnell auf, indem Sie sie in ein 37 °C heißes Perlenbad legen. Sprühen Sie 70%iges Ethanol auf und geben Sie das Röhrchen in die Biosicherheitswerkbank.
- Spülen Sie die Pipettenspitze mit 0,5%iger BSA-Lösung, um Organoidverlust zu vermeiden. Mischen Sie die aufgetauten Organoide vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren, um alle abgesetzten Organoide im Röhrchen zu mischen.
- Übertragen Sie vorsichtig 1 ml gefrorene Organoide auf 9 ml vorgewärmtes Ad-DF+++ tropfenweise. Drehen Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 400 x g und entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand.
- Waschen Sie das Pellet, indem Sie dem Organoid-Pellet 10 ml frisches, vorgewärmtes Ad-DF+++ hinzufügen, und mischen Sie es vorsichtig mit einer Pipette, die mit 0,5 % BSA vorbeschichtet ist, um das Pellet zu resuspendieren. Schleudern Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 400 x g und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
- Legen Sie das Organoid-Pellet auf Eis und entfernen Sie alle Reste von Ad-DF+++ vorsichtig mit einer Pipettenspitze mit kleinerem Volumen. Das Pellet wird in 300 μl Basalmembranmatrix resuspendiert und in eine vorgewärmte 6-Well-Platte gelegt. Legen Sie die Platte in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5% CO2.
HINWEIS: Es wird empfohlen, eine kleine 10-μl-Kuppel aus dem resuspendierten Pellet in einer Ecke des Wells zu plattieren, um die Konfluenz unter dem Mikroskop zu erkennen. Wenn die Organoide konfluent aussehen, verdünnen Sie die Platte, indem Sie 300 μl Basalmembranmatrix in zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte hinzufügen. - Nach einer Inkubationszeit von 20-30 Minuten werden 3 ml vorgewärmtes Komplettmedium in die erstarrte Kuppel gegeben.
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Representative Results
Wir haben eine Biobank von patienteneigenen Brusttumor-Organoiden aufgebaut, die verschiedene Subtypenumfasst 11. Darüber hinaus haben wir mehrere normale Brustorganoidlinien etabliert, die aus Gewebeproben der reduktiven Mammoplastik oder benachbarter/distaler normaler Brust von BC-Patientinnen abgeleitet wurden, wobei der in Abbildung 1 beschriebene Ansatz verwendet wurde.
Die verschiedenen Organoidlinien des Brusttumors unterscheiden sich in ihrer Morphologie (Abbildung 2) und Wachstumsrate (Abbildung 3). Normale Brustorganoide und die wenigen von uns etablierten Organoide aus dem frühen duktalen Carcinoma in situ (DCIS) ähneln der normalen Bruststruktur mit einem zentralen Lumen, das von duktalen Zellen umgeben ist (Abbildung 2A,B). Organoide, die aus einem invasiven lobulären Karzinom stammen (Abbildung 2C), neigen dazu, lose anhaftende traubenartige Strukturen zu bilden, wie bereits von anderen Labors berichtet wurde36,43. Organoide, die aus invasiven duktalen Karzinomen (Hormonrezeptor-positiver und dreifach negativer Brustkrebs) stammen, neigen dazu, dichte, große und runde Organoide zu bilden (Abbildung 2D, E). Organoide wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend in 2 % Agaroseformen eingebettet. Sie wurden dann in Paraffin eingebettet und 10 μm große Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt (wie in Bhatia et al.11 beschrieben), um die Morphologie zu beobachten.
Um die Unterschiede in der Wachstumsrate verschiedener von Patientinnen abgeleiteter Brusttumor-Organoidlinien zu demonstrieren, wurden 1.000 lebensfähige Einzelzellen in einer 10%igen Basalmembranmatrix-Suspensionslösung pro 96-Well-Platte plattiert, mit jeweils sechs Wiederholungen, um die Zellviabilität zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen und das Wachstum über einen Zeitraum von 12 Tagen zu überwachen (Abbildung 3B ). Die Organoidbildung wurde an den Tagen 3, 6, 9 und 12 mit einem Lumineszenz-Zellviabilitätstest gemessen, wobei an Tag 1 nach der Beschichtung ein Ausgangswert gemessen wurde. Abbildung 3A zeigt Hellfeldbilder der gleichen Organoide, die sich im Laufe der Zeit in 6-Well-Platten expandiert haben. Einige vom Patienten stammende Organoidlinien haben eine Verdopplungszeit von 2 Tagen, während andere 5 Tage benötigen (Abbildung 3B).
Abbildung 1: Etablierung von Brustorganoiden aus der Patientin. (A) Schematische Darstellung der wichtigsten Schritte bei der Etablierung von Brusttumoren oder normalen Organoiden. (B) Repräsentative Bilder, die das Wachstum von DS117T-Brusttumor-Organoiden von der Etablierung (Passage 0) bis zur Langzeitkultur (Passage 12) zeigen. Blaue Pfeile = faseriges Material, gelbe Pfeile = Trümmer/tote Zellen und rote Pfeile = unterstützende Zelltypen aus der Mikroumgebung (hauptsächlich Fibroblasten). Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Von Patientinnen stammende Brustorganoide, die verschiedene Subtypen repräsentieren. Oben: Morphologische Unterschiede zwischen Organoidlinien, die von Brusttumoren (B-E) verschiedener histopathologischer und molekularer Subtypen stammen. (A) Die Abbildung stellt Organoide dar, die aus normalem menschlichem Brustgewebe gewonnen werden, das nach einer reduktiven Mammoplastik gewonnen wurde. Maßstabsbalken = 50 μm. Untere Tafel: H&E-gefärbte Bilder der gleichen Organoidlinien. Maßstabsleiste = 100 μm. Abkürzung: TNBC = triple negative breast cancer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Wachstum in der Kultur verschiedener Brusttumor-Organoide von Patientinnen. Repräsentative Hellfeldbilder und Zellviabilitätskurven (A und B), gemessen mit einem Lumineszenz-Zellviabilitäts-Assay, der das Kulturwachstum verschiedener von Patientinnen stammender Brusttumor-Organoidlinien über 12 Tage zeigt. Maßstabsbalken = 50 μm. Fehlerbalken stellen SEM für n = 6 dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Unser Labor hat die oben genannten Protokolle erfolgreich eingesetzt, um Organoide aus naiven Tumorresektionen oder -kratzerungen zu etablieren. Wir haben dieses Protokoll auch verwendet, um normale Organoide aus Brustgewebe zu entwickeln, das durch reduktive Mammoplastiken oder aus benachbartem oder distalem normalem Brustgewebe von Krebspatientinnen gewonnen wurde. Etwa 30%-40% der resezierten Primärtumoren führten zu erfolgreichen Langzeittumoren (>Passage 8) Tumor-Organoid-Kulturen. Die Tumor-Organoid-Linien, die sich nach wenigen Passagen verjüngten, wiesen entweder einen Auswuchs aus normalen Organoiden oder Stromazellen auf oder bestanden hauptsächlich aus nicht-proliferativen Tumorzellen. Eine weitere Evaluierung und Modifikation der Mediumkomponenten, die derzeit das Auswachsen von Epithelzellen begünstigen, oder andere Mittel zur Vorselektion der Tumorzellpopulationen sollten die Erfolgsrate für die Etablierung und langfristige Kultivierung von PDOs verbessern. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, mehrere Fläschchen mit erfolgreich expandierten Organoiden einzufrieren und Auftautests an gefrorenen Fläschchen für jede etablierte Organoidlinie durchzuführen, um ihren langfristigen Erfolg in der Kultur zu authentifizieren.
Einige erfolgreiche Organoidlinien, die sich in der Kultur manchmal verlangsamen oder Schwierigkeiten haben, sich von einem Tauwetter zu erholen, profitieren oft von einer Erhöhung der Aussaatdichte. Es wird beobachtet, dass eine höhere Konfluenz dazu beiträgt, ein schnelleres Wachstum für die meisten Linien zu stimulieren, wahrscheinlich als Ergebnis von Zell-Zell-Interaktionen oder sezernierten Faktoren. Darüber hinaus kann das Filtern der Organoide (nach der Trypsinisierung) durch einen 70-100-μm-Filter dazu beitragen, Ablagerungen zu entfernen, die sich von toten Organoiden angesammelt haben, die manchmal nach dem Auftauen einiger Organoidlinien auftreten und dazu neigen, ihr Wachstum zu behindern. Es muss jedoch beachtet werden, dass beim Filtern auch ein Teil des gesunden Organoidmaterials verloren geht. Bestimmte Organoidlinien, die den Östrogenrezeptor (ER+) exprimieren, können im Vergleich zu TNBC langsam wachsen und könnten möglicherweise von der Zugabe von Estradiol zum Medium profitieren. Wir empfehlen, die etablierten patienteneigenen Brusttumor-Organoidlinien genomisch und transkriptomisch zu charakterisieren. Dies kann durch den Einsatz verschiedener Techniken erfolgen, wie z. B. immunhistochemische Bewertung der pathologischen und genetischen Merkmale von Patiententumoren (Expression von Östrogenrezeptor, Progesteronrezeptor, humanem epidermalem Wachstumsfaktor 2, Cadherin, Ki-67 usw.), RNA-Sequenzierung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung, DNA-Sequenzierung für Krebstreibergene, Kopienzahlvariationen usw. Bei mechanistischen Studien und Studien zum Ansprechen auf Arzneimittel muss man die spezifischen Inhibitoren berücksichtigen, die Bestandteile des Mediums sind, und alle vorherigen Behandlungen, die der Patient vor der Operation erhalten hat.
Tumor-Organoid-Linien, die von verschiedenen Patienten stammen, unterscheiden sich in genomischen Mutationen, Transkriptomik, Morphologie, Wachstumsrate, Fähigkeit, große Organoide zu bilden, Vorhandensein heterogener Zellpopulationen usw. Diese Unterschiede stellen eine Herausforderung bei der Etablierung und Kultivierung dar, machen Organoide aber auch zu robusten Modellen, die sowohl die Patientenvielfalt als auch die Tumorkomplexität repräsentieren. Es hat sich gezeigt, dass aus Brusttumoren gewonnene Organoide die ursprünglichen Tumore der Patientinnen auf genomischer, transkriptomischer11,36- und metabolomischer Ebene44 rekapitulieren. All diese Faktoren machen sie zu leistungsstarken Werkzeugen für das Wirkstoffscreening und die Präzisionsonkologie39. Patientenabgeleitete Organoide sind ein spannendes neues Modellsystem, das als dreidimensionale In-vitro-Modelle für die Erforschung der Krebsbiologie sowie für die Untersuchung therapeutisch wichtiger Fragen zur Weiterentwicklung der personalisierten Medizin dienen wird. Normal- und Tumorbrustorganoide können durch CRISPR-Technik genetisch verändert werden15,38, was zu ihrer günstigen Verwendung für mechanistische genetische Studien zur Tumorgenese und Krebsprogression führt. Von Patientinnen abgeleitete Brusttumor-Organoide wurden auch verwendet, um Xenotransplantatmodelle 11,38,39 zu entwickeln, die potenziell das Tumorwachstum bei Patientinnen nachahmen können. Darüber hinaus sind patienteneigene Organoid-Kokultursysteme für Brusttumore nach wie vor ein wenig erforschtes Forschungsgebiet, das aussagekräftige Einblicke in die Bedeutung der Wechselwirkung zwischen Brustkrebszellen und anderen Zellen, wie z. B. Stromakrebs-assoziierten Fibroblasten, Immunzellen, Adipozyten usw., liefern kann. bei der Tumorprogression.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei den Mitgliedern des Spector-Labors für die kritische Diskussion im Laufe dieser Arbeit. Wir danken Norman Sachs und Hans Clevers (Hubrecht Institute, Niederlande) für die erste Bereitstellung ihres Organoid-Kultivierungsprotokolls. Wir danken dem CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources für seine Dienstleistungen und sein technisches Know-how (NCI 2P3OCA45508). Wir danken Dr. Qing Gao für die Unterstützung bei der histologischen Probenvorbereitung. Wir sind dankbar für die Unterstützung von Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) für die Bereitstellung von Patiententumorproben. Wir schätzen auch die Bemühungen des Northwell Health Biobanking-Teams bei der Probengewinnung und danken den Patienten und ihren Familien für die Spende von Gewebe für die Forschung. Diese Forschung wurde von CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) und Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson und D.L.S.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
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