Summary
Burada, hasta kaynaklı meme tümörü rezeksiyonlarından veya normal meme dokusundan insan meme organoidlerinin oluşturulması için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Protokol, insan hasta kaynaklı meme organoidlerinin kültürlenmesi, dondurulması ve çözülmesi için kapsamlı adım adım talimatlar sağlar.
Abstract
Meme kanseri, birkaç farklı histolojik ve moleküler alt tipte sınıflandırılmış kompleks bir hastalıktır. Laboratuvarımızda geliştirilen hasta kaynaklı meme tümörü organoidleri, çoklu tümör kaynaklı hücre popülasyonlarının bir karışımından oluşur ve bu nedenle tümör hücresi çeşitliliği ve ortamının yerleşik 2D kanser hücre hatlarından daha iyi bir yaklaşımını temsil eder. Organoidler, hücre-hücre etkileşimlerinde ve kanser ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı bilinen hücre-hücre dışı matriks etkileşimlerine izin veren ideal bir in vitro model olarak hizmet eder. Hasta kaynaklı organoidler, insan kökenli oldukları için fare modellerine göre de avantajlara sahiptir. Ayrıca, hasta tümörlerinin genomik, transkriptomik ve metabolik heterojenitesini özetledikleri gösterilmiştir; Böylece, tümör karmaşıklığını ve hasta çeşitliliğini temsil edebilirler. Sonuç olarak, hedef keşif ve doğrulama ve ilaç duyarlılığı testleri hakkında daha doğru bilgiler sağlamaya hazırdırlar. Bu protokolde, hasta kaynaklı meme organoidlerinin rezeke edilmiş meme tümörlerinden (kanser organoidleri) veya redüktif mamoplasti kaynaklı meme dokusundan (normal organoidler) nasıl oluştuğuna dair ayrıntılı bir gösterim sunuyoruz. Bunu, 3D organoid kültürün, genişlemenin, paslaşmanın, dondurmanın ve hasta kaynaklı meme organoid kültürlerinin çözülmesinin kapsamlı bir açıklaması izler.
Introduction
Meme kanseri (BC), kadınlarda en sık görülen malignitedir ve 2022'de Amerika Birleşik Devletleri'nde teşhis edileceği tahmin edilen 287.850 yeni vaka ile1. Yıllık taramalar, hedefe yönelik tedaviler ve genetik yatkınlığın daha iyi anlaşılması ile erken teşhisteki son gelişmelere rağmen, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki kadınlarda kanser ölümlerinin ikinci önde gelen nedeni olma eğilimindedir ve yılda 40.000 > meme kanserine atfedilmektedir1. Meme kanseri günümüzde primer tümörün histopatolojik ve moleküler değerlendirmesine göre birçok alt tipe ayrılmaktadır. Daha iyi alt tip tabakalaşması, alt tipe özgü tedavi seçenekleri ile hasta sonuçlarını iyileştirmiştir2. Örneğin, HER2'nin bir proto-onkogen3 olarak tanımlanması, Trastuzumab'ın gelişmesine yol açmıştır, bu da bu oldukça agresif alt tipin çoğu hastada yönetilebilir olmasını sağlamıştır4. Bu karmaşık hastalığın genetiği ve transkriptomikleri üzerine hastaya özgü bir şekilde daha fazla araştırma, hastaya özgü kişiselleştirilmiş tedavi rejimlerinin daha iyi geliştirilmesine ve tahmin edilmesine yardımcı olacaktır 2,5. Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), moleküler düzeyde kanser hakkında bilgi edinmek, yeni hedefler veya biyobelirteçler belirlemek ve yeni tedavi stratejileri tasarlamak için umut verici yeni bir modeldir 6,7,8.
PDO'lar, taze rezeke edilmiş primer doku örneklerinden türetilen çok hücreli, üç boyutlu (3D) yapılardır 8,9. Tipik olarak hücre dışı matris (ECM) proteinlerinin bir kombinasyonundan oluşan bir hidrojel matrisine gömülerek üç boyutlu olarak yetiştirilirler ve bu nedenle tümör hücresi-ECM etkileşimlerini incelemek için kullanılabilirler. PDO'lar hasta çeşitliliğini temsil eder ve tümörün hücresel heterojenitesini ve genetik özelliklerini özetler10,11,12. İn vitro modeller olarak, genetik manipülasyona ve yüksek verimli ilaç ekranlarına izin verirler13,14,15. Ayrıca, PDO'lar hastanın ilaç duyarlılığını ve tedavi stratejilerini kliniğe paralel olarak değerlendirmek ve hasta sonuçlarını tahmin etmeye yardımcı olmak için makul bir şekilde kullanılabilir16,17,18. Kemoterapinin yanı sıra, kemoradyasyona bireysel hasta yanıtlarını incelemek için bazı organoid modeller de kullanılmıştır19,20. PDO'ların araştırma ve klinik kullanım için umut verici uygulanabilirliği göz önüne alındığında, Ulusal Kanser Enstitüsü, bu tümör kaynaklı yeni kanser modellerini üretmek ve sağlamak için İnsan Kanser Modelleri Girişimi (HCMI)21 adlı uluslararası bir konsorsiyum başlattı. HCMI aracılığıyla geliştirilen çeşitli kanser türlerinin organoid modellerinin çoğu, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) 22 aracılığıyla temin edilebilir.
Normal meme organoidlerinin, meme bezinde bulunan farklı epitel hücre popülasyonlarından oluştuğu gösterilmiştir 11,23 ve bu nedenle temel biyolojik süreçleri incelemek, tümörigeneze neden olan sürücü mutasyonlarını analiz etmek ve kanser kökenli hücre soy çalışmaları için harika modeller olarak hizmet eder 6,15 . Meme tümörü organoid modelleri, özellikle dirençli tümörler için yeni tedaviler geliştirme umutlarını teşvik eden yeni hedefleri belirlemek için kullanılmıştır24,25,26. Guillen ve ark., tedaviye dirençli meme tümörlerinin hasta kaynaklı ksenograft (PDX) ve eşleşen PDX kaynaklı organoid (PDxO) modellerini kullanarak, organoidlerin hassas tıp için güçlü modeller olduğunu ve ilaç yanıtlarını değerlendirmek ve doğrudan tedavi kararlarını paralel olarak değerlendirmek için kullanılabilecek güçlü modeller olduğunu göstermiştir28. Ayrıca, çeşitli bağışıklık hücreleri27,28,29, fibroblastlar30,31 ve mikroplar 32,33 ile PDO'ların kültürlenmesi için yeni ko-kültür yöntemlerinin geliştirilmesi, tümör mikroçevresinin kanser ilerlemesi üzerindeki etkisini incelemek için bir fırsat sunmaktadır. Pankreas veya kolorektal tümörlerden türetilen PDO'lar için bu tür birçok ko-kültür yöntemi aktif olarak kurulurken, meme PDO'ları için benzer yerleşik ko-kültür yöntemleri sadece doğal öldürücü hücreler34 ve fibroblastlar35 için bildirilmiştir.
Farklı meme kanseri alt tiplerini temsil eden >100 hasta kaynaklı organoidin ilk biyobankası, Hans Clevers grubu36,37 tarafından geliştirilmiştir. Bu çabanın bir parçası olarak, Clevers grubu şu anda yaygın olarak kullanılan meme organoid büyümesi için ilk karmaşık kültür ortamını geliştirdi36. Bir takip çalışması, meme PDO'larının ve hasta kaynaklı organoid ksenogreftlerin (PDOX'lar) kuruluşu ve kültürü hakkında kapsamlı bir açıklama sağlamıştır38. Welm laboratuvarı, fetal sığır serumu (FBS) ve daha az büyüme faktörü içeren nispeten daha basit bir büyüme ortamında kültürlenen geniş bir BC PDX modelleri ve PDxOs koleksiyonu geliştirdi39,40. Bağımsız olarak çok çeşitli naif hasta kaynaklı meme kanseri organoid modelleri 11'i geliştirdik ve karakterize ettik ve HCMI girişimi21'in bir parçası olarak BC PDO modellerinin geliştirilmesine katıldık. Burada, hasta kaynaklı meme organoid model sistemleri oluşturmada kullandığımız metodolojiyi detaylandıran pratik bir rehber sunmayı amaçlıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Meme kanseri hastalarından tümör rezeksiyonları, distal ve komşu normal doku ile birlikte, Northwell Health'ten Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu protokolleri IRB-03-012 ve IRB 20-0150'ye uygun olarak ve hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınarak alındı.
NOT: Aşağıda belirtilen tüm prosedürler, biyogüvenlik komitesinin onayı üzerine hasta örnekleri için belirlenmiş bir memeli doku kültürü BSL2 odasında gerçekleştirilmiştir. Tüm prosedürler, biyogüvenlik kabinlerinde aseptik koşulları koruyan güvenlik protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Her santrifüjleme adımı, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir. Doku/organoidler ve bazal membran matris stokları aksi belirtilmedikçe daima buz üzerine yerleştirilir. Yeni plakalar ön ısıtma için gece boyunca inkübe edilir. Önceden ısıtılmış plakalar üzerindeki kaplama kubbeleri, plaka yüzeyinden daha sonra kaplama veya kaldırma sırasında düzleşmeyen yuvarlak kubbeler elde etmek için en iyi sonuçları sağlar.
1. Orta hazırlık ve tarifler
- R-spondin1 şartlandırılmış ortamı aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın (alternatif olarak ticari olarak satın alınabilir).
- Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM),% 10 FBS,% 5 penisilin-streptomisin ve 300 μg / mL zeosin takviyesi olsun veya olmasın oluşan iki ayrı büyüme ortamı hazırlayın.
- Bir şişe HEK293T-HA-Rspondin1-Fc hücresini (Calvin Kuo'nun Stanford Üniversitesi'ndeki laboratuvarından elde edilen ve ticari olarak da temin edilebilen) 15 mL orta ile 75cm2'lik bir doku kültürü şişesinde çözün.
- Hücreleri, her biri 35 mL zeosin içeren ortama sahip 2 x 175cm2 kültür şişesine bölün.
- İstenilen R-spondin1 şartlandırılmış ortam partisini üretmek için gerektiği kadar şişe elde etmek için hücreleri tekrar geçirin. Zeosin olmadan büyüme ortamı kullanın.
- Zeosin içermeyen ortam içeren şişeler birleştiğinde, büyüyen ortamı çıkarın ve Ad-DF+++ ile değiştirin (adım 1.2; Tablo 1). Hücreleri 1 hafta boyunca% 5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için ortamı 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün. Ortamı 0,22 μm'lik bir filtreden geçirin. 25 mL alikot yapın ve bunları -20 ° C'de saklayın (6 aya kadar saklanabilir).
- HEK293T hücrelerini kullanarak, seyreltici DMEM (yüksek glikoz, piruvat) ile 4.8: 1 reaktif-DNA oranında ticari bir DNA transfeksiyon reaktifi kullanarak çift lusiferaz TOPFLASH41,42 testi gerçekleştirin. 100 μL transfekte hücrelere 100 μL R-spondin1 şartlandırılmış ortam (veya negatif kontrol için bazal ortam) ekleyin. Daha sonra, R-spondin1 şartlandırılmış ortamın Wnt aktivitesini doğrulamak için üreticinin protokolüne göre çift lusiferaz testini gerçekleştirin.
NOT: Tahlil, Firefly lusiferaz aktivitesi okunmuş bir TOP plazmidi kullanır ve FOP plazmidi negatif bir kontrol olarak kullanılır.
- Bazal ortamı hazırlayın (Ad-DF + ++ ortamı, daha önce Sachs ve ark.36 tarafından yayınlandığı gibi).
Reaktif Stok Konsantrasyonu Son Konsantrasyon Gelişmiş DMEM/F12 1 adet 1 adet GlutaMax 100x 1 adet HEPES 1 milyon 10 mM Penisilin-Streptomisin 10.000 U/mL; 10.000 μg/mL 100 U/mL; 100 μg/mL
Tablo 1: Bazal Ad-DF+++ orta bileşimi. - Daha önce Sachs ve ark.36 tarafından yayınlandığı gibi hasta kaynaklı meme organoidleri için eksiksiz bir ortam hazırlayın.
Reaktif Stok Konsantrasyonu Son Konsantrasyon Ad-DF+++ ortamı 1 adet 1 adet Şirket içi R-spondin 100% 10% B-27 ek ücreti 50x 1 adet Nikotinamid 1 milyon 5 mM cesaret 500 mM 1,25 milyon Primosin 50 mg/mL 50 μg/mL Kafa 100 μg/mL 100 ng/mL İnsan EGF 5 μg/mL 5 ng/mL İnsan Heregulin β1/Neuregulin1 75 μg/mL 37,5 ng/mL Y-27632 Dihidroklorür (Rho-Kinaz) 100 mM 5 μM A83-01 5 mM 500 nM İnsan FGF-7 100 μg/mL 5 ng/mL İnsan FGF-10 1 mg/mL 20 ng/mL p38i 30 mM 498 mil
Tablo 2: Hasta kaynaklı meme organoidleri için tam orta kompozisyon. - Gerekli miktarda kollajenaz IV tozunu tartarak ve Ad-DF+++ bazal ortamda çözerek 2 mg/mL kollajenaz IV çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
- Seyreltici olarak 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (DPBS) kullanarak %7,5 stok çözeltisinden% 0,5 sığır serum albümin (BSA) çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
2. Rezeke edilmiş dokudan meme tümörü/normal organoidlerin saptanması (Şekil 1)
- Cerrahi olarak rezeke edilmiş bir meme tümörü / normal doku örneğini Ad-DF++ içeren 50 mL'lik bir konik tüp içinde laboratuvara taşıyın. İzolasyon başlayana kadar tüpü buz üzerinde saklayın.
- Bir şişe bazal membran matrisini buz üzerinde veya gece boyunca 4 ° C'de çözün.
- Rezeke edilen dokuyu 10 cm steril Petri kabına aktarın. Dokuyu makroskopik olarak inceleyin ve morfolojik olarak yağlı, vaskülarize veya nekrotik görünüp görünmediğini not edin. Ek olarak, dokunun boyutunu ve şeklini kaydedin. İdeal olarak, bir cetvel görünümde doku fotoğrafını çekin (Şekil 2).
- Dokuyu steril bir no. 10 neşter ile çok küçük parçalara (~ 1 mm3) parçalayın ve 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- 10 mL 2 mg / mL kollajenaz IV çözeltisi ekleyin ve tüpü şeffaf bir filmle kapatın. Tüpü açılı bir konumda (~ 30 ° açı) 30-90 dakika boyunca 140 rpm'de 37 ° C'de bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin.
- Kuluçka sırasında, 37 ° C'lik bir boncuk / su banyosunda önceden ısıtmak için tam bir ortam aliquot yerleştirin.
- Her 15 dakikada bir, 5 mL'lik steril serolojik pipet kullanarak yukarı ve aşağı kuvvetlice karıştırarak dokuyu yeniden askıya alın. Numunenin pipete yapışmasından kaynaklanan doku kaybını önlemek için pipeti %0,5 BSA çözeltisi ile önceden kaplayın. Konik tüpü mikroskop altında 5x veya daha yüksek bir büyütmede gözlemleyerek zaman içindeki ayrışmayı izleyin.
- Doku ayrıştıktan sonra, 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj. Süpernatanı aspire edin, 10 mL Ad-DF++ ekleyin ve 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın.
- Supernatant'ı dikkatlice atın. Doku topakları bazen gevşek olabilir, bu nedenle aspire ederken dikkatli olun. Adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Doku peleti kısmen kırmızıysa, 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Daha uzun süre inkübe etmeyin, çünkü bu hücre canlılığını önemli ölçüde azaltacaktır.
- Tüpe 10 mL Ad-DF + ++ ekleyin, 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peletleri 50-300 μL seyreltilmemiş, soğuk bazal membran matrisinde tekrar askıya alın ve kabarcık oluşmasını önlemek için pipetleyerek dikkatlice karıştırın.
NOT: Eklenen bazal membran matrisinin hacmi, pelet boyutuna bağlıdır. Emin değilseniz, askıya alınmış peletten ~ 10 μL'lik küçük bir kubbeyi plakalayın ve mikroskop altında akıcılığı gözlemleyin. Gerekirse daha fazla bazal membran matrisi ekleyerek ayarlayın. Referans tohumlama yoğunluğu için Şekil 3'e (1. gün resim) bakın. - Plaka 300 μL bazal membran matris kubbesi, önceden ısıtılmış, etiketlenmiş, 6 delikli bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda organoidler içerir. Farklı plakalar kullanılıyorsa önerilen bazal membran matrisi ve orta hacimler için Tablo 3'e bakın.
Plaka başına düşen kuyu sayısı Kubbe başına Bodrum Membran Matrisi (μL) Kuyu başına orta (μL) 6 300 3000 12 100 1000 24 50 500 48 25 250 96 10 (kubbe yerine süspansiyon) 100
Tablo 3: Plaka boyutuna göre kuyu başına önerilen bazal membran matrisi ve büyüme ortamı miktarı. - Plakayı davlumbazda 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın ve daha sonra bodrum membran matris kubbesinin tamamen katılaşması için inkübatöre 20-30 dakika boyunca 37 ° C'de dikkatlice yerleştirin.
- 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna damla damla 3 mL önceden ısıtılmış tam ortam ekleyin ve inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO2'de yerleştirin. Ters çevrilmiş parlak alan mikroskobunda 5x objektif kullanarak organoidlerin görüntülerini alın.
- Organoidlerin büyümesine bağlı olarak ortamı her 4-8 günde bir doldurun. Kubbeyi rahatsız etmeden eski ortamı dikkatlice aspire edin ve taze, önceden ısıtılmış ortamı damla damla ekleyin.
NOT: Protokol, rezeke edilen tümörden türetilen meme kanseri organoidleri ve rezeke edilen sağlıklı meme dokusundan (aynı hastanın bitişik ve normal meme dokusundan veya redüktif mamoplasti ameliyatından elde edilen sağlıklı meme dokusundan) türetilen normal organoidler için aynıdır.
3. Kültürde hasta kaynaklı meme organoidlerinin yaygınlaştırılması ve yaygınlaştırılması
- Bir şişe bazal membran matrisini buz üzerinde veya gece boyunca 4 ° C'de çözün.
- Bazal membran matris kubbesini bir hücre kazıyıcı veya 1 mL pipet ucu kullanarak kuyudaki ortama kaldırın.
- Pipet ucunu %0,5 BSA çözeltisi ile önceden kaplayın ve ardından organoidlerin yüzen kubbesini hasat edilen kuyucuk sayısına bağlı olarak orta ila 15 mL veya 50 mL konik tüpe aktarın. 300 μL bazal membran matris kubbeleri içeren ikiden fazla kuyu için, 50 mL'lik bir konik tüp kullanın. Ses düzeyini en az 5 mL'ye çıkarmak için 1x DPBS ekleyin.
- Tüpleri 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün. Organoidli bazal membran matrisi altta bir tabaka oluşturur. Süpernatanı çıkarmak için dikkatlice aspire edin.
- Bir tüpte toplanan kuyucuk sayısına bağlı olarak 5-20 mL 1x DPBS ekleyin. Steril tek kullanımlık pipeti %0,5 BSA ile önceden kaplayın ve organoid-bazal membran matris peletini DPBS'de yukarı ve aşağı pipetleyerek eşit şekilde karıştırın.
- Tüpleri 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün. Supernatan'ı dikkatlice aspire edin ve atın.
- Hücre ayrışma reaktifini, bazal membran matrisinin hacminin üç katı kadar tüpe ekleyin. %0,5 BSA kaplı pipet ucu kullanarak, hücre ayrışma reaktifindeki organoidleri yeniden askıya alın.
- Tüpü açılı bir konumda 8-15 dakika boyunca 140 rpm'de 37 ° C'de bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin. Organoidlerin daha küçük kümelere ayrıldığından emin olmak için tüpü her 5 dakikada bir mikroskop altında gözlemleyerek izleyin.
- Hücre ayrışma reaktifine eşit veya daha büyük bir hacimde bazal ortam (yani, Ad-DF+++) ve organoidleri karıştırmak için pipet ekleyin. Bir organoid pelet elde etmek için RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
- Pelet hala çözülmemiş bazal membran matrisi içine gömülü organoidler içeriyorsa, 5-8 dakikalık ek bir tripsinizasyon için 3.7-3.9 adımlarını tekrarlayın.
- Çözülmemiş bazal membran matrisi olmayan beyaz bir organoid pelet elde edildikten sonra, süpernatanı atın ve pipetleme yoluyla pelet süspansiyonunu yeniden askıya almak için 1 mL Ad-DF + ++ ekleyin. Ardından, 10 mL'ye kadar daha fazla Ad-DF+++ ekleyin.
- Yıkama adımı için RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün. Supernatan'ı aspire edin ve atın.
- Uygun bölünme oranına bağlı olarak sindirilmiş organoidlere gerekli miktarda bazal membran matrisi ekleyin (bu, büyüme hızına bağlı olarak her organoid çizgi için büyük ölçüde değişecektir). Tohumlama yoğunluğunun bir örneği için Şekil 3'e (gün 1 resim) bakın. Kabarcık oluşmasını önlemek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Hemen buzun üzerine yerleştirin.
- Önceden ısıtılmış 6 delikli bir plakayı açın ve etiketleyin. Mikroskop altında akıcılığı gözlemlemek için bir kuyunun köşesinde 10-20 μL'lik bir kubbenin kaplanması önerilir. Organoidler birleşikse, bölünme oranını artırmak için daha fazla bazal membran matrisi eklenebilir.
- Plaka 300 μL organoid kubbeleri bazal membran matrisinde yeniden askıya alınmıştır. Birden fazla kuyuyu kaplarken tüpü buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun, böylece bazal membran matrisi çözelti içinde kalır.
- Plakayı davlumbazda 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın ve ardından kubbeleri rahatsız etmeden% 5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatöre dikkatlice yerleştirin.
- 20-30 dakika sonra kubbeler katılaşır. Her bir oyuğa 3 mL önceden ısıtılmış tam ortam ekleyin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Her 5-7 günde bir taze komple ortam ekleyin. Mikoplazma kontaminasyonunu tespit etmek için kültürlerin rutin testlerini gerçekleştirin.
NOT: Meme tümörleri ve normal organoidlerin kültürü için protokol aynıdır. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, normal organoidler yavaşlamadan önce 6-8 geçişine kadar iyi büyüme eğilimindedir. Gelecekteki araştırmalar için mümkün olduğunca çok sayıda erken geçiş stoğu yapılması tavsiye edilir.
4. Hasta kaynaklı meme organoidlerinin dondurulması
- Adım 3.1-3.12'de belirtildiği gibi, herhangi bir bazal membran matrisini çıkarmak için organoidlerin geçiş birleşen kuyuları.
- Organoidlerin peletini hücre dondurma ortamında (gece boyunca 4 ºC'de çözülür) 200-300 μL bazal membran matris hacmi başına 1 mL ortam ile pasifize etmeden önce tekrar askıya alın. Başvuru için dondurmadan önce bir hücre sayımı yapın. Tek hücreler elde etmek için gerekirse daha fazla tripsinizasyona tabi tutulmak üzere küçük bir hacimli (en az 100 μL) hücreyi aliquot edin ve ardından bir hücre sayacı makinesi kullanarak bunları sayın.
- 1 mL hücreyi, organoid hat numarası, tarih ve geçiş numarası ile etiketlenmiş 2 mL kriyoviyallere aktarın. Tüpleri kalıcı bir işaretleyici ile etiketlediğinizden veya kriyoetiketler kullandığınızdan emin olun.
- Şişeleri bir hücre dondurma kabına taşıyın ve kabı -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın. Gece boyunca inkübasyondan sonra, şişeler uzun süreli depolama için sıvı azot depolama dondurucusuna taşınmaya hazırdır.
5. Hasta kaynaklı meme organoidlerinin çözülmesi
- Bir şişe bazal membran matrisini buz üzerinde veya gece boyunca 4 ° C'de çözün. Ad-DF+++ ortamını 37 °C'de önceden ısıtın. Her dondurulmuş şişe için 9 mL önceden ısıtılmış ortamı 15 mL konik tüplere aliquot.
- Dondurulmuş organoid şişesini 37 ° C'lik bir boncuk banyosuna yerleştirerek hızla çözün. % 70 etanol püskürtün ve tüpü biyogüvenlik kabinine aktarın.
- Organoid kaybını önlemek için pipet ucunu %0,5 BSA çözeltisi ile durulayın. Tüpteki yerleşmiş organoidleri karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek çözülmüş organoidleri nazikçe karıştırın.
- 1 mL dondurulmuş organoidi, önceden ısıtılmış 9 mL Ad-DF+++'a damla damla şeklinde yavaşça aktarın. Hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün ve ardından süpernatanı dikkatlice atın.
- Organoid peletine 10 mL taze önceden ısıtılmış Ad-DF+++ ekleyerek peleti yıkayın ve peletin yeniden askıya alınması için %0,5 BSA ile önceden kaplanmış bir pipetle hafifçe karıştırın. Hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün ve süpernatanı dikkatlice atın.
- Organoid peleti buzun üzerine yerleştirin ve kalan Ad-DF+++ kısımlarını daha küçük hacimli bir pipet ucu kullanarak dikkatlice çıkarın. Pelet, 300 μL bazal membran matrisinde ve plakayı önceden ısıtılmış 6 delikli bir plakada tekrar askıya alın. Plakayı% 5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
NOT: Mikroskop altında akıcılığı ayırt etmek için kuyunun bir köşesindeki asılı peletten küçük bir 10 μL kubbenin kaplanması önerilir. Organoidler akıcı görünüyorsa, 6 delikli bir plakanın iki kuyucuğuna plaka yapmak için 300 μL bazal membran matrisi ekleyerek seyreltin. - 20-30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, katılaşmış kubbeye 3 mL önceden ısıtılmış tam ortam ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çeşitli alt tiplerden oluşan hasta kaynaklı meme tümörü organoidlerinden oluşan bir biyobanka kurduk11. Ek olarak, Şekil 1'de özetlenen yaklaşımı kullanarak, BC hastalarından redüktif mamoplasti doku örneklerinden veya bitişik / distal normal memeden türetilen çoklu normal meme organoid hatları oluşturduk.
Hasta kaynaklı çeşitli meme tümörü organoid çizgileri morfolojileri (Şekil 2) ve büyüme hızları (Şekil 3) bakımından farklılık gösterir. Normal meme organoidleri ve tespit ettiğimiz birkaç erken duktal karsinom in situ (DCIS) türevli organoid, duktal hücrelerle çevrili merkezi lümeni ile normal meme yapısına benzemektedir (Şekil 2A, B). İnvaziv bir lobüler karsinomdan türetilen organoidler (Şekil 2C), daha önce diğer laboratuvarlar tarafından bildirildiği gibi, gevşek bir şekilde bağlanmış üzüm salkımı benzeri yapılar oluşturma eğilimindedir36,43. Bu arada, invaziv duktal karsinomlardan (hormon reseptörü pozitif ve üçlü negatif meme kanseri) türetilen organoidler yoğun, büyük ve yuvarlak organoidler oluşturma eğilimindedir (Şekil 2D, E). Organoidler %4 paraformaldehit ile sabitlendi ve ardından %2 agaroz kalıbına gömüldü. Daha sonra parafin gömüldüler ve morfolojiyi gözlemlemek için 10 μm kesitleri hematoksilin ve eozin (Bhatia ve ark.11'de tarif edildiği gibi) ile boyandı.
Farklı hasta kaynaklı meme tümörü organoid hatlarının büyüme hızındaki farklılıkları göstermek için, 1.000 canlı tek hücre, 96 delikli plaka başına% 10 bazal membran matris süspansiyon çözeltisi içinde, 12 günlük bir süre boyunca büyümeyi izlemek için farklı zaman noktalarında hücre canlılığını belirlemek için her biri altı replikasyon ile kaplanmıştır (Şekil 3B ). Organoid oluşumu, 3, 6, 9 ve 12. günlerde ışıldayan hücre canlılığı testi kullanılarak ölçüldü ve kaplamadan sonraki 1. günde bir taban çizgisi okuması yapıldı. Şekil 3A , zaman içinde 6 delikli plakalarda genişleyen aynı organoidlerin parlak alan görüntülerini göstermektedir. Bazı hasta kaynaklı organoid hatların iki katına çıkma süresi 2 gün iken, bazıları 5 gün sürmektedir (Şekil 3B).
Şekil 1: Hasta kaynaklı meme organoidlerinin oluşturulması. (A) Hasta kaynaklı meme tümörlerinin veya normal organoidlerin oluşturulmasındaki ana adımların şematik gösterimi. (B) DS117T hasta kaynaklı meme tümörü organoidlerinin kuruluşundan (pasaj 0) uzun süreli kültüre (pasaj 12) kadar büyümesini gösteren temsili görüntüler. Mavi oklar = lifli malzeme, sarı oklar = enkaz / ölü hücreler ve kırmızı oklar = mikro çevreden (esas olarak fibroblastlar) destekleyici hücre tipleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı alt tipleri temsil eden hasta kaynaklı meme organoidleri. Üst panel: Farklı histopatolojik ve moleküler alt tipteki hasta meme tümörlerinden (B-E) türetilen organoid çizgiler arasındaki morfolojik farklılıklar. (A) Şekil, redüktif mamoplasti cerrahisi sonrası elde edilen normal insan meme dokusundan elde edilen organoidleri temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. Alt panel: Aynı organoid çizgilerin H&E boyalı görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltma: TNBC = üçlü negatif meme kanseri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farklı hasta kaynaklı meme tümörü organoidlerinin kültüründe büyüme. Temsili parlak alan görüntüleri ve hücre canlılık eğrileri (A ve B), 12 gün boyunca farklı hasta kaynaklı meme tümörü organoid çizgilerinin kültüründeki büyümeyi gösteren bir ışıldayan hücre canlılığı testi ile ölçülür. Ölçek çubuğu = 50 μm. Hata çubukları n = 6 için SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laboratuvarımız, naif tümör rezeksiyonlarından veya kazımalarından organoidler oluşturmak için yukarıdaki protokolleri başarıyla kullanmıştır. Bu protokolü , redüktif mamoplastilerle elde edilen meme dokusundan veya kanser hastalarının bitişik veya distal normal meme dokusundan normal organoidler geliştirmek için de kullandık. Rezeke edilen primer tümörlerin yaklaşık %30-40'ı başarılı uzun dönem (>pasaj 8) tümör organoid kültürleri ile sonuçlanmıştır. Birkaç pasajdan sonra sivrilen tümör organoid çizgileri ya normal organoidlerin veya stromal hücrelerin büyümesine sahipti ya da büyük ölçüde proliferatif olmayan tümör hücrelerinden oluşuyordu. Şu anda epitel hücre büyümesini destekleyen ortam bileşenlerinin daha fazla değerlendirilmesi ve modifikasyonu veya tümör hücresi popülasyonlarının önceden seçilmesinin diğer yolları, PDO'ların kurulması ve uzun vadeli kültürü için başarı oranını artırmalıdır. Ek olarak, başarılı bir şekilde genişletilmiş organoidlerin birkaç şişesinin dondurulması ve kültürdeki uzun vadeli başarılarını doğrulamak için kurulan her organoid hattı için dondurulmuş şişeler üzerinde çözülme testleri yapılması şiddetle tavsiye edilir.
Kültürde zaman zaman yavaşlayan veya çözülmeden kurtulmak için mücadele eden bazı başarılı organoid çizgiler genellikle tohumlama yoğunluğunun arttırılmasından yararlanır. Çoğu hat için, muhtemelen hücre-hücre etkileşimlerinin veya salgılanan faktörlerin bir sonucu olarak, daha hızlı büyümeyi uyarmaya yardımcı olmak için daha yüksek akıcılık gözlenmiştir. Ek olarak, organoidlerin (tripsinizasyondan sonra) 70-100 μm'lik bir filtreden filtrelenmesi, bazen bazı organoid çizgileri çözüldükten sonra ortaya çıkan ve büyümelerini engelleme eğiliminde olan ölü organoidlerden biriken kalıntıların giderilmesine yardımcı olabilir. Bununla birlikte, bazı sağlıklı organoid materyallerin filtreleme sürecinde de kaybolduğu belirtilmelidir. Östrojen reseptörünü (ER +) ifade eden bazı organoid çizgiler, TNBC'ye kıyasla yavaş yetiştiriciler olabilir ve ortama östradiol ilavesinden potansiyel olarak yararlanabilir. Hasta kaynaklı meme tümörü organoid hatlarının genomik ve transkriptomik olarak karakterize edilmesini öneriyoruz. Bu, hasta tümörlerinin patolojik ve genetik özellikleri için immünohistokimya değerlendirmesi (östrojen reseptörünün ekspresyonu, progesteron reseptörü, insan epidermal büyüme faktörü 2, Cadherin, Ki-67, vb.), RNA dizileme, tek hücreli RNA dizileme, kanser sürücü genleri için DNA dizileme, kopya sayısı varyasyonları vb. gibi çeşitli teknikler kullanılarak yapılabilir. Mekanik ve ilaç yanıtı çalışmaları için, ortamın bileşenleri olan spesifik inhibitörler ve ameliyattan önce hasta tarafından alınan önceki tedaviler göz önünde bulundurulmalıdır.
Farklı hastalardan türetilen tümör organoid çizgileri genomik mutasyonlar, transkriptomikler, morfoloji, büyüme hızı, büyük organoidler oluşturma kapasitesi, heterojen hücre popülasyonlarının varlığı vb. Açısından farklılık gösterir. Bu farklılıklar, onları kurma ve kültürlemede zorluklar doğurur, ancak aynı zamanda organoidleri hem hasta çeşitliliğini hem de tümör karmaşıklığını temsil eden sağlam modeller haline getirir. Meme tümörü kaynaklı organoidlerin orijinal hasta tümörlerini genomik, transkriptomik11,36 ve metabolomik seviyelerde44 özetlediği gösterilmiştir. Tüm bu faktörler onları ilaç taraması ve hassas onkoloji39 için güçlü araçlar haline getirmektedir. Hasta kaynaklı organoidler, kanser biyolojisini incelemek için üç boyutlu in vitro modeller olarak hizmet edecek ve kişiselleştirilmiş tıp alanını ilerletmek için terapötik açıdan önemli soruları inceleyecek heyecan verici yeni bir model sistemidir. Normal ve tümörlü meme organoidleri, CRISPR mühendisliği15,38 ile genetik olarak değiştirilebilir ve bu da tümörigenez ve kanser progresyonu için mekanik genetik çalışmalar için uygun kullanımlarını sağlar. Hasta kaynaklı meme tümörü organoidleri, hastalarda tümör büyümesini potansiyel olarak taklit edebilen 11,38,39 ksenogreft modellerini geliştirmek için de kullanılmıştır. Ayrıca, hasta kaynaklı meme tümörü organoid ko-kültür sistemleri, meme kanseri hücreleri ile stromal kanserle ilişkili fibroblastlar, bağışıklık hücreleri, adipositler gibi diğer hücreler arasındaki çapraz iletişimin önemi hakkında güçlü bilgiler sağlayabilen, az araştırılmış bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir. tümör progresyonunda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma boyunca kritik tartışmalar için Spector laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Norman Sachs ve Hans Clevers'e (Hubrecht Enstitüsü, Hollanda) başlangıçta bize organoid kültürleme protokollerini sağladıkları için teşekkür ederiz. CSHL Kanser Merkezi Histoloji ve Mikroskopi Paylaşılan Kaynaklarını hizmetleri ve teknik uzmanlığı için kabul ediyoruz (NCI 2P3OCA45508). Histolojik numune hazırlama konusundaki yardımları için Dr. Qing Gao'ya teşekkür ederiz. Dr. Karen Kostroff'un (Northwell Health) hasta tümör örnekleri sağlama konusundaki desteği için minnettarız. Northwell Health Biobanking ekibinin örnek alma çabalarını da takdir ediyoruz ve hastalara ve ailelerine araştırma için doku bağışında bulundukları için teşekkür ediyoruz. Bu araştırma CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) ve Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson ve D.L.S.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL protein concentration) | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
- di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
- Hortobagyi, G. N., et al.
- Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
- Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. Á, Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
- Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
- Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
- Drost, J., Clevers, H.
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
- Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- HCMI Catalog. , Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022).
- Search ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022).
- Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
- Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
- Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
- Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- HUB Organoids: Patient in the lab. , Available from: https://www.huborganoids.nl (2022).
- Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
- Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
- PDX Portal. , Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022).
- Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
- Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
- Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
- Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).
