수컷 SD 쥐의 스트렙토조토신 유발 당뇨병성 상처 모델은 현재 제1형 당뇨병의 상처 치유를 연구하는 데 가장 널리 사용되는 모델입니다. 이 프로토콜은 이 모델을 생성하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 또한 잠재적인 문제를 제시 및 해결하고 당뇨병성 상처의 진행 및 혈관신생 특성을 검사합니다.
고용량의 스트렙토조토신을 한 번 주사한 후 쥐의 등쪽에 전층 피부 절제술을 하는 것은 제1형 당뇨병 상처의 동물 모델을 구성하는 일반적인 방법입니다. 그러나 부적절한 조작은 쥐의 모델 불안정성과 높은 사망률로 이어질 수 있습니다. 안타깝게도 제1형 당뇨병성 상처 모델링에 대한 기존 지침은 거의 없으며 세부 사항이 부족하고 구체적인 참조 전략을 제시하지 않습니다. 따라서 이 프로토콜은 제1형 당뇨병 상처 모델을 구성하기 위한 전체 절차를 자세히 설명하고 당뇨병 상처의 진행 및 혈관신생 특성을 분석합니다. 제1형 당뇨병성 상처 모델링은 스트렙토조토신 주사의 준비, 제1형 당뇨병의 유도 및 상처 모델의 구축을 포함하는 단계를 포함한다. 상처 부위는 상처 발생 후 7일째와 14일째에 측정하고, 랫트의 피부 조직을 적출하여 조직병리학적 및 면역형광 분석을 하였다. 그 결과 55mg/kg 스트렙토조토신에 의해 유발된 제1형 당뇨병이 사망률이 낮고 성공률이 높은 것으로 나타났습니다. 혈당 수치는 유도 5주 후에 비교적 안정적이었다. 당뇨병성 상처 치유율은 7일째와 14일째에 정상 상처보다 현저히 낮았지만(p < 0.05), 둘 다 14일째에 90% 이상에 도달할 수 있었습니다. 정상군과 비교하여, 14일째에 당뇨병성 상처의 표피층 폐쇄는 불완전하였고, 재상피화를 지연시켰으며, 혈관신생이 유의하게 낮았다 (p < 0.01). 이 프로토콜을 기반으로 구축된 제1형 당뇨병성 상처 모델은 정상 쥐 상처에 비해 폐쇄 불량, 재상피화 지연, 혈관신생 감소 등 만성 상처 치유의 특성을 가지고 있습니다.
제1형 진성 당뇨병(T1DM)은 고혈당증과 췌장 β 세포의 파괴를 특징으로 하는 만성 대사 질환입니다1. T1DM 상처는 만성적으로 치유되지 않는 상처이며 인간에서 당뇨병의 가장 흔하고 치명적인 합병증이다 2,3. 동물 모델은 상처 치유 중 병리학적 변화와 잠재적 치료제의 안전성 및 효능을 연구하는 데 가장 적합한 프로토타입이다4. 다른 유형에 비해 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐는 스트렙토조토신(STZ)에 더 민감하고 관련 사망률이 낮아 당뇨병성 상처 연구에서 인기가 있습니다 5,6.
T1DM 상처 모델을 구성하기 위한 수많은 방법이 설명되었습니다. T1DM 모델과 관련하여 연구는 주로 STZ 주사 방법이 당뇨병 유도 성공률에 미치는 영향에 초점을 맞추었습니다 7,8. 그러나 모델링 프로세스는 이 동일한 단계의 일관되지 않은 작업으로 인해 어려움을 겪습니다. 한 연구에서 쥐는 STZ 주사 전에 18시간 동안 금식했습니다. STZ 주사 1주일 후 혈당 수치가 16.67mmol/L 이상인 쥐는 당뇨병으로 간주되었고, 3주 후에 당뇨병성 상처가 나타났다9. 반대로, 관련 연구에서 Zhu et al. STZ 주사 전 12시간 동안 쥐를 금식했습니다. 주사 후 72 시간에 혈당 수치가 16.7 mmol / L보다 높은 쥐는 당뇨병으로 간주되었고, 당뇨병 상처는 4 주 후에 도입되었다10. 전반적으로 STZ 주사 프로토콜, 당뇨병 진단 기준 및 상처 도입 시간에 불일치가 있습니다.
상처 모델링의 관점에서, 대부분의 연구에서, 성공적인 당뇨병 유도 후 T1DM 상처를 구성하기 위해 등쪽 피부의 전체 두께를 절제한다11,12,13. 이 모델은 쥐의 피부 구축에 취약하지만 노동 집약적이고 저렴하기 때문에 상처 치유 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델입니다14,15. 그럼에도 불구하고 이 전층 절제 기술에 대한 방법 기반 연구는 부족합니다. 또한, 상처 크기 및 위치에 관한 기존 연구에는 균일한 기준이 없다12,16. 상처의 크기와 위치는 실험 설계의 일관성과 결과의 과학적 타당성에 간접적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 연구자들을 위한 참고자료로서 T1DM 유도 및 상처 모델링을 위한 표준 프로토콜이 절실히 요구되고 있다. 이 연구의 목표는 T1DM 상처 연구의 참조로 사용할 수 있는 T1DM 상처 모델링을 위한 특정 프로토콜을 시각화하는 것입니다.
이 프로토콜은 T1DM 상처 모델링에서 논쟁의 여지가 있는 작업을 명확히 합니다. STZ 주사 프로토콜, T1DM 유도 성공 기준, 혈당 안정화 시간, 상처 위치 및 크기에 대한 우려가 이 작업에서 해결되었습니다. 또한, T1DM 상처 치유 평가를 위한 병리학적 특성 및 측정 가능한 매개변수가 명확해졌습니다.
쥐는 STZ의 효능에 영향을 미칠 수 있는 β 세포에 대한 포도당 또는 그 유사체의 경쟁적 결합을 피하기 위해 STZ 주사 전에 18시간 동안 금식했습니다. T1DM을 유도하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 단일 고용량의 STZ이며, 이는 섬을 손상시키고 인슐린 분비를 감소시켜 혈당을 증가시킨다21. 실험 전 시험에서 높은 성공률과 낮은 사망률에 대한 최적의 STZ 용량은 55mg/kg으로 이전 연구에서 보고된 최적 용량보다 낮은 것으로 나타났습니다22,23,24. 이 프로토콜에서 T1DM은 55mg/kg STZ의 단일 복강내 주사를 사용하여 유도되었습니다.
혈당 수치는 STZ 주사 3일 후 모두 16.7mmol/L 이상이었습니다. 그러나 STZ 주사 후 7일째에 혈당 수치가 16.7mmol/L보다 높으면 쥐마다 섬 손상 정도가 다르고 진단 시간을 적절하게 연장하면 위음성률을 줄일 수 있기 때문에 성공적인 T1DM 모델링을 위한 권장 기준입니다. 또한, 혈당 변동은 STZ 주사 후 5 주 후에 안정화되었으며,이 기간 동안 쥐의 체중이 점차 증가하여 이전 결과25,26과 일치합니다. 이는 T1DM 모델의 혈당 수준이 최소 6주 동안 안정화되어야 하고, 6주 후 쥐 체중의 증가가 상처 모델링 동안 사망률을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 따라서 이 프로토콜은 STZ 주사 후 8주에 상처 모델링을 수행했습니다.
상처 후 7일째와 14일째의 상처 봉합률은 정상 상처군보다 당뇨병 환자에서 유의하게 낮았으며, 이는 느린 치유를 나타냅니다. 또한, 상처 재상피화 및 혈관신생은 정상군보다 당뇨병 환자에서 유의하게 낮았다. 이는 T1DM 상처 모델이 정상 쥐에서보다 느린 상처 치유 및 지연된 재상피화를 나타낸다는 것을 보여주며, 이는 감소된 상처 혈관신생의 병리학적 변화와 관련될 수 있습니다. 그러나 14일째에는 T1DM 상처 치유율도 90% 이상이었는데, 이는 인간 당뇨병성 상처의 만성 비치유 특성과 다릅니다. 설치류의 상처 치유 생리학적 기전이 인간의 생리학적 기전과 다르기 때문일 수 있다27. 결과적으로 최상의 상처 직경은 최소 20mm이며, 이는 당뇨병성 상처 연구에서 중재의 효능을 평가할 시간을 허용할 만큼 충분히 큽니다. 상처 위치는 견갑골과 척추를 피해야 하며, 이 두 부위의 지속적인 움직임은 상처 치유를 방해할 수 있습니다.
결론적으로, 이 프로토콜의 방법을 이용한 T1DM 상처 모델의 구축이 효과적이다. 이 프로토콜은 정상 쥐 상처에 비해 느린 상처 치유, 지연된 재상피화 및 혈관신생 감소와 같은 만성 당뇨병 상처의 일부 특성을 복제합니다. 그러나 모델이 당뇨병성 상처의 다른 만성 표현형을 복제할 수 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 또한, 이 프로토콜은 쥐의 피부 수축 문제를 설명하지 않는 가장 기본적이고 널리 사용되는 방법을 설명합니다. 향후 연구에서는 상처 부목의 사용을 이 프로토콜에 통합하거나 만성 당뇨병 상처의 추가 모델을 탐색할 수 있으며, 이는 향후 연구자들에게 중요한 과제가 될 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82104877)의 재정 지원을 받았습니다.
Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
Image J software | National Institutes of Health | — | |
Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
Streptozotocin | Sigma | 57654595 |